化瘀滌痰湯對急性硬膜下血腫模型大鼠血清的影響

陸松俠，　龍子江*，　干 磊，　任振興，　王成華，　陳 楊，　余曉琪，　陳師農(nóng)

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽　合肥　230038；2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科，安徽　合肥　230022；3.安徽省藥物研究所，安徽　合肥　230022）

［藥 理］

化瘀滌痰湯對急性硬膜下血腫模型大鼠血清的影響

陸松俠1，龍子江1*，干 磊2，任振興1，王成華2，陳 楊2，余曉琪2，陳師農(nóng)3

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽合肥230038；2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科，安徽合肥230022；3.安徽省藥物研究所，安徽合肥230022）

目的 觀察化瘀滌痰湯（水蛭、地龍、膽南星、川芎）對急性硬膜下血腫模型大鼠血清炎癥因子的影響及腦組織形態(tài)改變。方法 SD大鼠采用自體血液注射法復(fù)制急性硬膜下血腫模型，將造模成功50只大鼠隨機(jī)均分為模型組（等容量蒸餾水）、化瘀滌痰湯組（高、中、低劑量組）、陽性組（天丹通絡(luò)膠囊），另取10只作為假手術(shù)組（只鉆孔不注血）。各組按劑量灌胃給藥14 d，末次給藥后，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定各組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8、IL-2水平；HE染色觀察腦組織形態(tài)改變。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8水平顯著升高（P＜0.01），IL-2水平顯著下降（P＜0.01）；與模型組相比，藥物治療組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8水平明顯降低（P＜0.05），IL-2水平上升（P＜0.05）。鏡下可見模型組大鼠腦組織皮質(zhì)上方有少量血腫存在，血腫區(qū)下方可見炎癥細(xì)胞浸潤，細(xì)胞排列紊亂，間隙較大，并出現(xiàn)壞死現(xiàn)象。各用藥組與模型組比較，血腫消失，炎癥細(xì)胞浸潤較輕，壞死細(xì)胞明顯減少，間質(zhì)水腫減輕；假手術(shù)組基本正常。結(jié)論 化瘀滌痰湯能通過降低TNF-α、IL-6、IL-8炎癥因子水平，上調(diào)IL-2水平，抑制急性硬膜下血腫繼發(fā)性腦損傷，促進(jìn)大鼠硬膜下血腫的消散，發(fā)揮腦保護(hù)作用。

化瘀滌痰湯；急性硬膜下血腫；TNF-α；IL-6；IL-8；IL-2

由于多種原因?qū)е嘛B內(nèi)出血聚集于硬膜下腔形成的血腫稱為硬膜下血腫（Subdura1 Hematoma，SDH），為神經(jīng)外科常見病之一，預(yù)后差，死亡率和致殘率較高［1］，嚴(yán)重威脅著人們的生命安全。急性硬膜下血腫主要由創(chuàng)傷性顱腦損傷引起［2］，其發(fā)生后血腫周圍局部腦血流量減少，受損部位過度炎癥反應(yīng)參與損傷后一系列病理改變，最終會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的繼發(fā)性腦損傷及神經(jīng)功能障礙［3］。炎癥因子（TNF-α、IL-6、IL-8）是腦損傷后重要的內(nèi)源性腦損害因子，參與炎癥級聯(lián)反應(yīng)；IL-2是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，對神經(jīng)元損傷有預(yù)防和修復(fù)作用，因此調(diào)節(jié)炎癥因子水平平衡對降低組織損傷顯得尤為重要［4］?；鰷焯禍前不蔗t(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院國家名老中醫(yī)工作室孔昭遐教授臨床長期應(yīng)用治療硬膜下血腫的經(jīng)驗(yàn)方。該方以水蛭為君藥，配伍地龍、膽南星、川芎等藥，功能破血逐瘀、祛痰開竅，臨床研究已證實(shí)該方能夠加快血腫吸收、改善血腫引起的眩暈、肢體麻木等癥狀，對硬膜下血腫患者具有良好的治療作用［5］。本實(shí)驗(yàn)通過觀察急性硬膜下血腫模型大鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-8、IL-2水平及腦組織形態(tài)變化，旨在探討化瘀滌痰湯對急性硬膜下血腫（ASDH）繼發(fā)性腦損傷的治療作用及機(jī)制，為化瘀滌痰湯的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20）g，由安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，許可證編號：SCXK（皖）2011-002。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 化瘀滌痰湯：方中各藥材均購買及鑒定于安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，藥物經(jīng)傳統(tǒng)方法煎煮后濃縮至相應(yīng)濃度保存?zhèn)溆?。天丹通絡(luò)膠囊：山東鳳凰制藥股份有限公司，批號1301230，臨用前用蒸餾水配制成所需濃度。IL-6試劑盒（批號CK-E67489C）、IL-8試劑盒（批號CK-E87059C）、TNF-α試劑盒（批號CKE83559C）、IL-2試劑盒（批號CK-E95459C）均購自上海源葉生物技術(shù)有限公司。

1.3主要儀器 Stoe1ting腦立體定位儀（Stoe1ting公司）；STRONG-204牙科鉆頭（Saeshin公司）；RT-6000酶標(biāo)儀（雷杜公司）；TS-12A生物組織自動(dòng)脫水機(jī)（湖北省孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司）；BM-IX生物組織包埋機(jī)（孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司）；Leica RM2016輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（上海五相儀器儀表有限公司）。

2　方法

2.1急性硬膜下血腫（ASDH）模型制備 參照Yokobori［6］造模方法經(jīng)改良后復(fù)制ASDH模型。以3.5%水合氯醛（1 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠后俯臥固定，常規(guī)消毒，頭部剃毛后沿正中線切開，剝離骨膜，在矢狀縫右側(cè)3 mm，冠狀縫后側(cè)2 mm處開一個(gè)直徑是1.0 mm的孔，從自體心臟取血，以50μL/min速度緩慢向硬膜下腔隙注射500μL，注血完成后，待血液凝固后拔除注射針。牙科粉封閉鉆孔，縫合頭皮，連續(xù)3 d注射青霉素防止感染。假手術(shù)組大鼠操作過程同造模組，但不注入自體血液。

2.2ASDH大鼠模型評估 動(dòng)物蘇醒后，參考大鼠行為學(xué)評價(jià)方法［7］，對大鼠進(jìn)行前肢對稱試驗(yàn)，前肢觸發(fā)試驗(yàn)及軀體轉(zhuǎn)向試驗(yàn)，表現(xiàn)出左側(cè)肢體活動(dòng)較右側(cè)肢體活動(dòng)欠佳的大鼠視為成功的模型。隨機(jī)抽取2只模型成功大鼠進(jìn)行解剖，可見硬膜下皮質(zhì)上方血腫（如圖1）。

2.3動(dòng)物分組及給藥 模型復(fù)制成功大鼠隨機(jī)分為模型組，化瘀滌痰湯高劑量組（生藥56.52 g/kg）、中劑量組（生藥28.26 g/kg）、低劑量組（生藥14.13 g/kg），陽性藥物組（天丹通絡(luò)膠囊，0.54 g/kg），假手術(shù)組只鉆孔不注血，每組10只，假手術(shù)組和模型組灌胃等容量蒸餾水，每天給藥1次，連續(xù)給藥14 d。

圖1　ASDH模型大鼠血腫分布Fig.1　Distribution of hematoma in ASDH modeI

2.4指標(biāo)檢測

2.4.1大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8、IL-2水平的測定 末次給藥1 h后，3.5%水合氯醛（1 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，3 000 r/min離心15 min，取血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定各組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8、IL-2水平。檢測步驟按照各試劑盒說明書依法操作。

2.4.2腦組織形態(tài)學(xué)觀察 末次給藥1 h后，3.5%水合氯醛（1 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，用10%中性甲醛溶液內(nèi)固定后，斷頭取腦去除小腦，置于10%中性甲醛溶液中固定1周，常規(guī)梯度脫水、石蠟包埋，切片，厚度為5μm，HE染色，觀察各組大鼠腦組織形態(tài)。

2.5數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)結(jié)果以±s表示，定量資料多組間兩兩比較采用方差分析（方差齊采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊者采用Dunnett t檢驗(yàn)）。

3　結(jié)果

3.1化瘀滌痰湯對ASDH模型大鼠血清IL-6、IL-8水平的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清IL-6、IL-8水平顯著升高，具有顯著性差異（P＜0.01）；與模型組比較，化瘀滌痰湯高劑量組、中劑量組、低劑量組、陽性組血清IL-6水平下降，有明顯差異（P＜0.05），IL-8水平顯著降低，有顯著性差異（P＜0.01），見表1。

表1　化瘀滌痰湯對ASDH模型大鼠血清IL-6、IL-8水平的影響（±s，n=10）Tab.1 Effects of Huayu Ditan Decoction on serum IL-6，IL-8 in ASDH modeI rats（±s，n=10）

表1　化瘀滌痰湯對ASDH模型大鼠血清IL-6、IL-8水平的影響（±s，n=10）Tab.1 Effects of Huayu Ditan Decoction on serum IL-6，IL-8 in ASDH modeI rats（±s，n=10）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01，△P＜0.05

組別劑量/（g·kg-1）IL-6/（ng·L-1）IL-8/（ng·L-1）假手術(shù)組—134.07±33.79 413.34±71.93模型組—199.07±18.20**703.70±28.37**高劑量組56.52 157.78±25.16△△497.22±76.29△△中劑量組28.26 169.83±21.39△445.22±90.47△△低劑量組14.13 170.29±19.03△583.04±70.02△△陽性組0.54 157.56±33.45△△569.56±71.96△△

3.2化瘀滌痰湯對ASDH模型大鼠血清TNF-α、IL-2水平的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清TNF-α水平顯著上升、IL-2水平明顯降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，化瘀滌痰湯高劑量組、中劑量組、低劑量組血清TNF-α水平下降，具有顯著性差異（P＜0.05），IL-2水平顯著上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），陽性組TNF-α水平下降明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），見圖2。

圖2　化瘀滌痰湯對ASDH模型大鼠血清TNF-α、IL-2的影響（±s，n=10）Fig.2　Effects of Huayu Ditan Decoction on serum TNF-α，IL-2 in ASDH modeI rats（±s，n=10）

3.3腦組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 光鏡下觀察，假手術(shù)組可見細(xì)胞間排列緊密，核仁清晰，未見壞死灶及炎性細(xì)胞浸潤（圖3a）。模型組可見皮質(zhì)上方有少量血腫存在，血腫區(qū)下方細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，可見壞死區(qū)域，炎癥細(xì)胞浸潤、細(xì)胞間隙增大等（圖3b）。陽性組（圖3c）、化瘀滌痰湯高劑量組（圖3d）、中劑量組（圖3e）、低劑量組（圖3f）與模型組比較血腫消失，炎癥細(xì)胞浸潤較輕，間質(zhì)水腫減輕，壞死細(xì)胞明顯減少。

圖3　化瘀滌痰湯對腦組織形態(tài)學(xué)的影響（40×10）Fig.3　Effect of Huayu Ditan Decoction on brain tissuem orphoIogy（40×10）

4　討論

急性硬膜下血腫是由顱腦損傷引起的一種常見疾病［8］。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為外傷之后，血溢脈外，離經(jīng)之血形成瘀血；而后瘀阻經(jīng)脈，氣血運(yùn)行不暢，后聚津?yàn)闈?，釀濕為痰，同時(shí)瘀血郁而化熱，熱盛傷津，亦會(huì)煉津?yàn)樘?，因此痰瘀互結(jié)是導(dǎo)致硬膜下血腫發(fā)病的主要原因。本實(shí)驗(yàn)采用自體血液注入硬膜下腔，形成瘀血，瘀阻經(jīng)絡(luò)，與硬膜下血腫中醫(yī)發(fā)病機(jī)制相似，同時(shí)該造模方法形成的血腫位置恒定，操作方法相對簡單，且動(dòng)物死亡率低，故可通過此動(dòng)物模型探討化瘀滌痰湯對急性硬膜下血腫的干預(yù)作用。

急性硬膜下血腫引起的腦水腫及顱內(nèi)壓增高是一種非感染性炎癥表現(xiàn)［9］，這種炎癥反應(yīng)主要是由血腫壓迫腦組織引起的缺血、缺氧作用引起。一般認(rèn)為，炎癥介質(zhì)釋放是腦缺血性損傷的重要機(jī)制之一［10］。細(xì)胞因子IL-6、IL-8、TNF-α、IL-2是參與機(jī)體炎癥反應(yīng)和一系列病理生理過程的重要介質(zhì)。Vi11a等［11］研究證明，IL-8對神經(jīng)組織炎性反應(yīng)中性粒細(xì)胞具有趨化活性和激活作用，能促進(jìn)神經(jīng)組織的炎性反應(yīng)，在腦損傷過程中起有害作用，降低IL-8能夠減輕腦損傷。此外，顱腦損傷后IL-6、TNF-α表達(dá)明顯增加，能夠介導(dǎo)細(xì)胞之間的直接毒性作用或相互作用，增加血腦屏障的通透性，并導(dǎo)致鈣離子通道開放，使鈣離子內(nèi)流，引起細(xì)胞水腫、在腦繼發(fā)性損傷中起著重要作用。星形細(xì)胞在應(yīng)急狀態(tài)下能產(chǎn)生IL-6、TNF-α，在損傷發(fā)生后IL-6水平上升，并且損傷程度越重，血液中IL-6的水平越高，血液IL-6水平可作為反映損傷程度的指標(biāo)之一［12］。TNF-α來源于腦內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及外周循環(huán)中的單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等細(xì)胞，腦創(chuàng)傷病人腦脊液及血液中TNF-α水平都會(huì)增高。此外，TNF-α是體外循環(huán)炎性反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，它能誘導(dǎo)IL-6、IL-8等細(xì)胞因子的生成，增加細(xì)胞黏附因子的表達(dá)及吞噬細(xì)胞的活性，促進(jìn)中性粒細(xì)胞活化及脫顆粒，使炎癥反應(yīng)呈級聯(lián)放大模式，最終形成全身炎癥反應(yīng)［13］。IL-2是由Th11細(xì)胞產(chǎn)生的一類細(xì)胞因子，在免疫調(diào)節(jié)中起著重要的作用。當(dāng)腦組織受到缺血、缺氧刺激后，神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌調(diào)節(jié)功能受到影響，使免疫反應(yīng)受到抑制，IL-2生成減少，抑制神經(jīng)功能的恢復(fù)。腦缺血不僅可以誘導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)，還可以引起外周系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)，因此血液中炎癥因子水平可作為評價(jià)腦組織繼發(fā)性炎癥反應(yīng)強(qiáng)弱的指標(biāo)［14］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，急性硬膜下血腫模型大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8水平明顯上升，IL-2水平明顯下降，應(yīng)用化瘀滌痰湯治療后能夠明顯降低血清TNF-α、IL-6、IL-8水平，升高IL-2水平，減輕炎癥反應(yīng)，降低腦損傷。HE染色顯示，模型組大鼠腦血腫區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，可見梗死區(qū)域，血管周圍及細(xì)胞間隙增大，腦水腫嚴(yán)重。應(yīng)用化瘀滌痰湯干預(yù)后，血腫區(qū)組織結(jié)構(gòu)紊亂及間質(zhì)水腫和細(xì)胞變性程度明顯減輕，壞死細(xì)胞明顯減少，炎癥細(xì)胞浸潤程度明顯抑制，細(xì)胞形態(tài)較模型組明顯改善。綜上所述，化瘀滌痰湯通過抑制細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-8水平，升高IL-2水平，能夠減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，對急性硬膜下血腫模型大鼠有明顯的治療作用，為臨床治療硬膜下血腫提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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InfIuence of Huayu Ditan Decoction on serum in ratsw ith acute subduraIhematoma

LU Song-xia1， LONG Zi-jiang1*， GAN Lei2， REN Zhen-xing1， WANG Cheng-hua2， CHEN Yang2， YU Xiao-qi2， CHEN Shi-nong3
（1.Anhui University of Traditional ChineseMedicine，Hefei230038，China；2.Department of Traditional ChineseMedicine，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei230022，China；3.Anhui Institute of Medicine，Hefei230022，China）

AIM To observe the effects of Huayu Ditan Decoction（Hirudo，Pheretima，Arisaema cum bile，Chuanxiong Rhizoma）on serum 1eve1s of inf1ammatory cytokine IL-6，IL-8，TNF-α，and IL-2，and change of brain tissuemorpho1ogy in ratswith acute subdura1hematoma.METHODS Ratmode1 for acute subdura1hematoma was induced by auto1ogous injection of b1ood into SD rats.Fifty rats with acute subdura1hematoma were random1y divided equa11y into themode1group（given disti11ed water），the high，medium and 1ow dose Huayu Ditan Decoction group，the contro1group（Tiandan Tong1uo Capsu1es）.Another ten ratswere served as the sham operation group（given disti11ed water），which were on1y dri11ed but not injected the b1ood.After the 1ast one of successive administration for14 days，the serum 1eve1s of inf1ammatory cytokine IL-6，IL-8，TNF-α，and IL-2 weremeasured by ELISA，brain tissuemorpho1ogy wasmeasured by HE staining.RESULTS Compared with the sham operation group，the 1eve1s of serum TNF-α，IL-6，IL-8 went significant1y up（P＜0.01）and IL-2 1eve1went down（P＜0.01）in themode1group.As compared with themode1 group，serum 1eve1s of TNF-α，IL-6，IL-8 in the drug therapy groups decreased significant1y（P＜0.05），IL-2 1eve1 increased（P＜0.05）.In themode1group，a sma11amountof hematoma existed at the top of cerebra1cortex.Inf1ammatory ce11s infi1trated，ce11s arranged irregu-1ar1y，ce11s gap increased and therewere areas of necrosis at the bottom of the hematoma.Compared with themode1 group，hematoma appeared to subside in each treatmentgroup and their inf1ammatory ce11infi1tration，necrotic ce11s and edema decreased.Rats in sham operation group were norma1.CONCLUSION Huayu Ditan Decoction can inhibit the secondary brain injury of acute subdura1hematoma and promote the absorption of hematoma in rats.The mechanism is possib1y re1ated to the reduction of TNF-α，IL-6，IL-8 1eve1s and the increase of the 1eve1of IL-2，which p1ays a ro1e in protecting cerebra1 tissue.

Huayu Ditan Decoction；acute subdura1hematoma；TNF-α；IL-6；IL-8；IL-2

R285.5

A

1001-1528（2015）01-0001-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.001

2014-01-15

安徽省研究生”千人計(jì)劃“項(xiàng)目資助（2013）

陸松俠（1989—），女，碩士生，主要從事中藥對心腦血管疾病防治作用的研究。Te1：15156871761，E-mai1：1usongxia5678 @126.com

龍子江（1957—），男，教授，主要從事中藥對心腦血管疾病防治作用的研究。Te1：（0551）5169216，E-mai1：1zjy1s@ 163.com