共振瑞利散射法測定棉子糖含量的研究及應(yīng)用

鄧世星, 黎 剛

(遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)化學(xué)教研室,貴州遵義 563000)

棉子糖(Raffinose)又叫甜菜糖、蜜三糖，廣泛存在于豆科植物如大豆、扁豆、豌豆、綠豆和花生等[1]中，屬于大豆低聚糖之一。棉子糖是雙歧桿菌的食料，能促使雙歧桿菌的繁殖，而且還具有不被對(duì)人體有害的大腸菌利用的特點(diǎn)，因此對(duì)人體健康有特別的保健作用[2]。該物質(zhì)目前的分析方法有氣相色譜法[3]、比色法[4]。共振瑞利散射(RRS)技術(shù)始于上世紀(jì)九十年代初，可為研究分子結(jié)構(gòu)和反應(yīng)特征提供豐富的信息，用于離子締合反應(yīng)以測定痕量金屬離子[5]、蛋白質(zhì)[6]、有機(jī)化合物[7]以及藥物的分析研究[8]。

本文探討了棉子糖、FeCl3溶液組成的二元體系的共振瑞利散射特征，建立了一種新的棉子糖含量的測定方法。該方法應(yīng)用于保健食品中棉子糖的含量測定，結(jié)果滿意。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

VARIAN Cary Eclipse 熒光分光光度計(jì)(美國，瓦里安公司)；510型酸度計(jì)(中國型號(hào)5410)；SG7200HPT超聲波清洗器(上海冠特超聲儀器有限公司)。

棉子糖標(biāo)準(zhǔn)品(上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：080520)；大豆低聚糖片(哈爾濱百愛科技有限公司綏棱分公司)；大豆低聚糖粉(哈爾濱百愛科技有限公司綏棱分公司)；FeCl3·6H2O(分析純，成都金山化學(xué)試劑有限公司)。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 測定方法

于10 mL比色管中，依次加入適量的棉子糖標(biāo)準(zhǔn)溶液、pH=9.90的B-R緩沖液，0.05 mol/L FeCl3溶液，并迅速用二次蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，室溫下靜置15 min后，在熒光分光光度計(jì)上，以λex=λem進(jìn)行同步掃描，記錄共振瑞利散射光譜，并于514 nm波長處測定各離子締合物的共振瑞利散射強(qiáng)度IRRS及試劑空白的共振瑞利散射強(qiáng)度I0，計(jì)算△I=I0-IRRS。

2 結(jié)果與討論

圖1 棉子糖的RRS光譜

2.1 共振瑞利散射光譜

RRS光譜見圖1。從圖中可以看出，單獨(dú)的FeCl3溶液的RRS強(qiáng)度很大，加入棉子糖后體系的RRS強(qiáng)度明顯減弱，其RRS光譜的最大散射峰位于514 nm處。圖1中曲線1為FeCl3的RRS，曲線2～6為FeCl3溶液與不同濃度的棉子糖溶液混合后的RRS光譜。

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.2.1酸度的選擇試驗(yàn)了多種緩沖溶液對(duì)締合物RRS散射光強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明，采用B-R緩沖溶液，且pH在9.62～10.3之間能使締合物的△I最大且穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)選擇pH=9.90的B-R緩沖液。

2.2.2緩沖溶液用量的選擇實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)緩沖液用量對(duì)RRS的影響很大，對(duì)0.1～1.8 mL范圍內(nèi)的緩沖液用量進(jìn)行了考察。結(jié)果顯示，緩沖液用量為0.2 mL時(shí)△I值最大，選擇B-R緩沖液的最佳用量為0.2 mL。

2.2.3FeCl3溶液用量的選擇實(shí)驗(yàn)考察了0.1～0.2 mL范圍內(nèi)FeCl3溶液對(duì)RRS值的影響。結(jié)果顯示，F(xiàn)eCl3溶液用量為0.4 mL時(shí)體系的△I值最大且相對(duì)穩(wěn)定。選擇FeCl3溶液用量為0.4 mL。

2.2.4試劑加入順序的選擇實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)試劑的加入順序?qū)w系的RRS光譜也有影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，按棉子糖→B-R緩沖液→FeCl3的順序加入，RRS強(qiáng)度及信號(hào)穩(wěn)定性最好。

2.2.5反應(yīng)時(shí)間的影響實(shí)驗(yàn)考察了45 min內(nèi)△I值的變化情況。結(jié)果表明體系在25 min后達(dá)到穩(wěn)定，△I在25 min之后隨時(shí)間的變化不大，選擇反應(yīng)時(shí)間25 min。

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

對(duì)濃度為1.5、2.0、2.5 μg/mL的棉子糖溶液分別平行測定15次，得出其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.4%、0.98%、2.2% ，表明方法的精密度很好。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

通過實(shí)驗(yàn)得出棉子糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：△I=-11.95+41.97c，濃度在0.75～3.0 μg/mL范圍線性良好，相關(guān)系數(shù)R=0.9975。方法的檢出限(3σ)為0.46 μg /mL。

2.5 共存物質(zhì)的影響

實(shí)驗(yàn)考察了部分可能共存的離子如常見的陰陽離子、葡萄糖、精氨酸等物質(zhì)對(duì)25 μg/mL棉子糖測定的干擾。以測定誤差小于±5%為依據(jù)，得到共存物允許量,見表1。

表1 共存物質(zhì)的影響

2.6 回收率試驗(yàn)

分別在不同濃度百愛牌大豆低聚糖片配制成的樣品溶液中，加入不同量的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 回收率試驗(yàn)

2.7 樣品分析

2.7.1大豆低聚糖片的測定取百愛牌大豆低聚糖片4片，研勻混合后，準(zhǔn)確稱取0.5000 g于100 mL容量瓶中,用二次蒸餾水定容至刻度、搖勻。過濾，棄去初濾液，精密取續(xù)濾液10 mL于100 mL容量瓶中，用二次蒸餾水稀釋至刻度。按實(shí)驗(yàn)方法測定RRS光譜強(qiáng)度，計(jì)算得每片的含量為0.239 g/tablet(標(biāo)示量為0.25 g/tablet)。

2.7.2大豆低聚糖粉的測定取百愛牌大豆低聚糖粉1包，準(zhǔn)確稱取0.2500 g于100 mL容量瓶中，用二次蒸餾水定容至刻度，搖勻。過濾，棄去初濾液，精密取續(xù)濾液10 mL于100 mL容量瓶中，用二次蒸餾水稀釋至刻度。按實(shí)驗(yàn)方法測定，計(jì)算出每包大豆低聚糖粉中棉子糖的含量為46%(標(biāo)示量為50%)。

3 結(jié)論

在pH=9.90的B-R緩沖液條件下，F(xiàn)eCl3的RRS光譜強(qiáng)度被棉子糖顯著減弱，且其降低值與棉子糖濃度在一定范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R=0.9975，線性范圍為0.75～3.0 μg/mL。該方法可應(yīng)用到保健食品中棉子糖的含量測定。