柵藻延遲發(fā)光的初步研究*

付加雷，龐靖祥，聶曉艷，韓金祥1,△

(1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355；2.山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南 250014；3. 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，山東 濟(jì)南 250062)

1 引 言

與化學(xué)發(fā)光不同，所有生命系統(tǒng)均存在著超弱的光輻射，他們涉及的范圍極為廣泛：動(dòng)物及其器官、組織、細(xì)胞等；植物及其根莖、花、果等；各種水藻；各種微生物，如細(xì)菌、酵母菌等。這種普遍存在于生物系統(tǒng)中的超弱光輻射被稱為“生物光子輻射”(biophoton emission)。其典型強(qiáng)度為100個(gè)光子/(s·cm2)，光譜分布至少在200～800 nm內(nèi)是連續(xù)的。生物光子輻射作為生命新陳代謝過程的一個(gè)產(chǎn)物，來自生物分子從高能態(tài)向低能態(tài)的躍遷[1]。大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，生物光子輻射對(duì)生物系統(tǒng)內(nèi)部的變化及外界環(huán)境的影響有高度的敏感性，因此，通過對(duì)生物光子輻射的探測(cè)和分析能夠獲得生物系統(tǒng)內(nèi)部的微觀信息，了解外界環(huán)境的微弱變化[2-4]。

柵藻是淡水中常見的浮游藻類，極喜在營養(yǎng)豐富的靜水中繁殖，其中許多種類對(duì)有機(jī)污染物具有較強(qiáng)的耐性，可在水質(zhì)評(píng)價(jià)中作為指示生物[5-6]。鑒于柵藻的以上特性，為了探討柵藻生物光子輻射與生物學(xué)過程的關(guān)系，本研究采用YPMS-2生物光子測(cè)量?jī)x對(duì)其生物光子輻射行為進(jìn)行了初步探測(cè)，得到了一些有意義的結(jié)論。

2 材料和方法

2.1 供試生物

柵藻(Scenedesmus sp.) 購自中國科學(xué)院武漢水生生物研究所(編號(hào)FACHB-933)。

2.2 柵藻的培養(yǎng)

收到藻種后，首先將試管內(nèi)藻液搖勻，在無菌操作下將藻液直接轉(zhuǎn)入滅菌后的玻璃三角瓶(50 ml)內(nèi)，然后將玻璃三角瓶瓶口封好，放置在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度25±1℃，光照條件2 000 Lux，時(shí)間設(shè)置12 h晝/12 h夜。培養(yǎng)20 d，藻種生長(zhǎng)狀態(tài)良好，生物量明顯增多，在無菌條件下可再次轉(zhuǎn)接，再次轉(zhuǎn)接比例1∶5(藻液：培養(yǎng)基)，取長(zhǎng)勢(shì)良好的柵藻轉(zhuǎn)接入盛有BG11培養(yǎng)基的500 ml錐形瓶中，培養(yǎng)一段時(shí)間后，測(cè)定藻懸液的生物光子輻射。

2.3 柵藻生長(zhǎng)濃度的測(cè)定[7-8]

藻類的生物量測(cè)定是藻類生長(zhǎng)、生理生化、生態(tài)等方面研究的必要手段，藻類生物量測(cè)定方法很多，通常的顯微直接計(jì)數(shù)法，光密度(OD)測(cè)量法，葉綠素測(cè)量法，Counter 電子顯微計(jì)數(shù)法等，各有優(yōu)缺點(diǎn)。盡管到目前為止，計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)體數(shù)仍然是最準(zhǔn)確，最令人滿意的方法之一，可以獲得最基本的種群信息，但是直接計(jì)數(shù)法不但工作量大，不同種類間由此估算的生物量差異也較大。相比之下，光密度法操作簡(jiǎn)單，需要樣品量少，能夠?qū)崿F(xiàn)快速測(cè)定。因此，為了準(zhǔn)確、快速的測(cè)量柵藻生物量，本實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定其細(xì)胞密度及吸光度(A)，并進(jìn)行直線回歸分析，得出回歸方程：C=(A×11.995+0.1502) ×106個(gè)/ml(R2=0.9766)。按照此公式，只要測(cè)定出藻液的吸光度，就能計(jì)算出藻液濃度(C)。

2.4 柵藻延遲發(fā)光的測(cè)量

YPMS-2生物光子測(cè)量?jī)x，購自荷蘭米盧娜公司(Netherlands Meluna Research Company)。

將制備好的藻懸液混勻后傾入4 cm×1 cm×1 cm石英比色杯中，先用紫外分光光度計(jì)測(cè)其吸光系數(shù)，然后快速置于YPMS-2生物光子測(cè)量?jī)x的樣品暗室內(nèi)，放置一定時(shí)間(約180 s)，以消除外界光源影響，使柵藻混懸液生物光子輻射達(dá)到自發(fā)狀態(tài)，再立即用白LED光源激發(fā)，激發(fā)時(shí)間為10 s，測(cè)其延遲發(fā)光，一般測(cè)量時(shí)間為600 s。測(cè)量參數(shù)為：工作電壓1250 V，測(cè)量時(shí)間600 s，間隔時(shí)間1 s。測(cè)定光子計(jì)數(shù)率—時(shí)間曲線、光子計(jì)數(shù)與柵藻濃度的關(guān)系以及培養(yǎng)基對(duì)柵藻延遲發(fā)光的影響。

2.5 數(shù)據(jù)處理分析

將測(cè)得的結(jié)果輸入到OriginPro 9.1 軟件中，分別對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖與非線性(雙曲線)擬合，并分析處理。

3 結(jié)果與討論

3.1 噪聲、培養(yǎng)基與藻液延遲發(fā)光對(duì)比分析

提前2 h打開溫濕度控制系統(tǒng)，室溫恒定設(shè)置為20℃，濕度恒定設(shè)置為45%。打開YPMS-2生物光子測(cè)量?jī)x，測(cè)量暗室的本底噪聲，然后放入盛有3 ml液體培養(yǎng)基BG11的石英比色杯，測(cè)量培養(yǎng)基BG11自發(fā)與延遲發(fā)光，結(jié)果見圖1。培養(yǎng)基BG11為含有無機(jī)鹽NaNO3、K2HPO4、MgSO4、CaCl2、ZnSO4等的無菌水溶液。噪聲的平均光子數(shù)為11.4/s，BG11自發(fā)的平均光子數(shù)為12.05/s，培養(yǎng)基BG11延遲發(fā)光從光子數(shù)60多個(gè)，1s后直接衰減至自發(fā)狀態(tài)(平均光子數(shù)12.24/s)。無機(jī)鹽水溶液培養(yǎng)基BG11的延遲發(fā)光幾乎沒有雙曲性弛豫，呈現(xiàn)為指數(shù)衰減狀態(tài)。

柵藻混懸液的延遲發(fā)光與培養(yǎng)基BG11延遲發(fā)光對(duì)比分析，見圖2。培養(yǎng)基BG11延遲發(fā)光從光子數(shù)60多個(gè)，1s后直接衰減至自發(fā)狀態(tài)(平均光子數(shù)12.24/s)，與本底噪聲(平均光子數(shù)11.4/s)非常接近。藻懸液的延遲發(fā)光是從光子數(shù)6×104多個(gè)向下衰減，呈現(xiàn)雙曲線弛豫；而培養(yǎng)基BG11的延遲發(fā)光從60多個(gè)光子衰減，呈現(xiàn)指數(shù)衰減。相對(duì)于藻懸液延遲發(fā)光而言，培養(yǎng)基延遲發(fā)光幾乎可以忽略不計(jì)，即可以認(rèn)為藻懸液的延遲發(fā)光就是藻體本身的延遲發(fā)光。

圖2 柵藻與培養(yǎng)基BG11延遲發(fā)光對(duì)比分析

3.2 柵藻的延遲發(fā)光光子計(jì)數(shù)率——時(shí)間曲線

將柵藻懸液混勻后傾入石英比色杯中，置于YPMS-2生物光子測(cè)量?jī)x的樣品暗室內(nèi)，放置一定時(shí)間(約180 s)，待柵藻懸液生物光子輻射達(dá)到自發(fā)狀態(tài)后(自發(fā)狀態(tài)的平均光子數(shù)約30/s)，立即用白LED光源激發(fā)柵藻，激發(fā)時(shí)間為10 s，測(cè)定其延遲發(fā)光，得到光子計(jì)數(shù)率——時(shí)間曲線，見圖3。

圖3 柵藻延遲發(fā)光光子計(jì)數(shù)——時(shí)間曲線

將雙曲函數(shù)公式：

I(t)=I0/(1+t/τ)β

(1)

轉(zhuǎn)換為公式：

y=a/(1+x/b)c

(2)

將公式(2)編輯入OriginPro 9.1 軟件，將柵藻的混懸液延遲發(fā)光測(cè)得的數(shù)據(jù)，與理論表達(dá)式(2)做雙曲線最佳擬合，其回歸方程為：

y=586714/(1+t/0.4)^1.25，R2=0.9986

將測(cè)定的柵藻混懸液延遲發(fā)光數(shù)據(jù)，與雙曲線函數(shù)(2)進(jìn)行擬合，擬合關(guān)聯(lián)度高達(dá)99.86%，擬合的三個(gè)參數(shù)a(I0)=586714，b(τ)=0.4，c(β)=1.25。雙曲線衰減規(guī)律說明生物系統(tǒng)內(nèi)的各個(gè)激發(fā)態(tài)分子之間是相互偶聯(lián)的，它們可能通過生物系統(tǒng)內(nèi)存在的電磁場(chǎng)互相聯(lián)系，而這正是相干場(chǎng)的重要特征[9-10]。電磁輻射相干性：一部分自發(fā)的和光誘導(dǎo)的生物超弱發(fā)光的光子(量子)，起源于生物系統(tǒng)內(nèi)一個(gè)高度相干的電磁場(chǎng)，這種相干電磁場(chǎng)很可能是活組織內(nèi)通訊聯(lián)絡(luò)的基礎(chǔ)[11-13]，而恰恰可能是生物光子扮演著生物體內(nèi)一種新型通訊信使的角色[14]。用雙曲線規(guī)律擬合柵藻的延遲發(fā)光數(shù)據(jù)曲線，擬合關(guān)聯(lián)度高達(dá)99%以上，這一結(jié)果支持了Popp 的相干性理論，也符合延遲發(fā)光弛豫動(dòng)力學(xué)過程不能用指數(shù)函數(shù)描述的特點(diǎn)[15]。

雙曲函數(shù)公式(1)所含的三個(gè)參數(shù)I0、τ、β具有一定的物理意義：I0代表初始強(qiáng)度，它依賴于被測(cè)樣品的性質(zhì)，同時(shí)與光照條件有關(guān)；τ 是一個(gè)特征時(shí)間，只與樣品自身的性質(zhì)有關(guān)；β是一個(gè)指數(shù)因子，強(qiáng)烈控制弛豫的速率。這三個(gè)參數(shù)值定量地刻畫了被測(cè)樣品(在延遲發(fā)光意義上)的性質(zhì)[4]。

3.3 柵藻藻液濃度對(duì)其延遲發(fā)光的影響

分別取生長(zhǎng)旺盛的柵藻3 ml至5個(gè)14 ml離心管中，然后用液體培養(yǎng)基BG11分別稀釋至4、5、6、7、8 ml，取其中3 ml入石英比色杯中，測(cè)量其吸光度以及延遲發(fā)光。根據(jù)測(cè)得的藻液吸光度A，依據(jù)公式C=(A×11.995+0.1502) ×106(個(gè)/ml)，計(jì)算每個(gè)稀釋比例藻懸液的濃度(個(gè)/mL)，見表1。把不同濃度的藻懸液測(cè)得的延遲發(fā)光數(shù)據(jù)，分別與理論表達(dá)式(2)做雙曲線最佳擬合，得出不同濃度藻懸液延遲發(fā)光曲線擬合參數(shù)，見表2。

由表1 可知，隨著稀釋比例的降低，不同濃度的藻懸液的吸光度也降低，其相應(yīng)的藻懸液濃度也明顯降低。

將盛有不同濃度藻懸液的石英比色杯，放入YPMS-2生物光子測(cè)量?jī)x，測(cè)定其延遲發(fā)光。測(cè)得的不同濃度藻懸液數(shù)據(jù)利用OriginPro 9.1軟件進(jìn)行畫圖處理，由圖4可知，單純從延遲發(fā)光曲線來看，不同濃度藻懸液之間幾乎沒有明顯的區(qū)別。將不同稀釋比例的藻懸液(不同濃度的藻懸液)延遲發(fā)光數(shù)據(jù)，分別與雙曲線函數(shù)(2)進(jìn)行最佳擬合，擬合關(guān)聯(lián)度都高達(dá)99.60%以上，其擬合后的參數(shù)，見表2。實(shí)測(cè)初始強(qiáng)度，即盛有藻懸液的石英比色杯，放入YPMS-2生物光子測(cè)量?jī)x的樣品暗室內(nèi)，被白LED燈光源激發(fā)后，暗室快門打開，生物光子儀器初始記錄的光子數(shù)。

圖4 不同稀釋比例的藻液延遲發(fā)光曲線對(duì)比

表2 不同濃度的藻液延遲發(fā)光曲線擬合參數(shù)對(duì)比

由表2可知，隨著藻懸液濃度的降低，實(shí)測(cè)初始強(qiáng)度明顯降低；a(I0)值也明顯降低；c(β)值有升高趨勢(shì)；b(τ)先降低后又微弱升高。(1)a(I0)應(yīng)該代表理論初始強(qiáng)度，它依賴于被測(cè)樣品的性質(zhì)，同時(shí)與光照條件有關(guān)。在相同的白LED光源、相同時(shí)間激發(fā)下，不同濃度的藻懸液測(cè)得的延遲發(fā)光數(shù)據(jù)，經(jīng)雙曲線函數(shù)(2)進(jìn)行擬合后，得出的理論上的初始強(qiáng)度a(I0)(即擬合出的雙曲線的理論最高點(diǎn))，一般比實(shí)際測(cè)得的初始強(qiáng)度高出許多。實(shí)測(cè)初始強(qiáng)度和理論初始強(qiáng)度都與藻懸液濃度呈正相關(guān)，即隨著藻懸液濃度的降低，實(shí)測(cè)與理論初始強(qiáng)度也隨之降低。(2) c(β)是一個(gè)指數(shù)因子，它強(qiáng)烈控制弛豫的速率。隨著藻懸液濃度的降低，指數(shù)因子逐漸增大，即雙曲線的弛豫速率升高。換而言之，隨著藻懸液濃度的降低，其相應(yīng)的延遲發(fā)光衰減變快。這一點(diǎn)從圖4也可以看出，即隨著藻懸液濃度越低，其延遲發(fā)光數(shù)據(jù)雙曲線拐點(diǎn)越接近中心坐標(biāo)軸原點(diǎn)。(3)b(τ)是一個(gè)特征時(shí)間，只與樣品自身的性質(zhì)有關(guān)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著柵藻濃度的降低，延遲發(fā)光的特征時(shí)間有升高的趨勢(shì)。生命系統(tǒng)相干性的另一表現(xiàn)是生物光子輻射的合作性[4]，其基本特征為：輻射壽命與原子數(shù)成反比，輻射強(qiáng)度與原子數(shù)的平方成正比，這就是所謂的“超輻射”。復(fù)雜的生命系統(tǒng)是由無數(shù)的小的子系統(tǒng)構(gòu)成，整個(gè)復(fù)雜系統(tǒng)的輻射壽命與子系統(tǒng)的數(shù)量成反比，輻射強(qiáng)度與子系統(tǒng)的數(shù)量的平方成正比，我們的結(jié)果初步驗(yàn)證了該理論。

綜上所述，單純從延遲發(fā)光曲線來看，不同濃度藻懸液之間幾乎沒有明顯的區(qū)別；但通過雙曲函數(shù)擬合出來的三個(gè)參數(shù)(I0、τ、β)，就能很明顯的把它們區(qū)別開，這三個(gè)參數(shù)攜帶著不同濃度柵藻和液體培養(yǎng)基的信息，即生物光子輻射攜帶著自身狀態(tài)和外界狀況的信息。這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的獲得，為柵藻可作為液體環(huán)境的生物指示劑，奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

(1)柵藻與培養(yǎng)基延遲發(fā)光對(duì)比以及柵藻在液體培養(yǎng)基中延遲發(fā)光分析，表明柵藻具有較強(qiáng)生物光子輻射能力。

(2)柵藻的光子計(jì)數(shù)率—時(shí)間曲線回歸說明，用雙曲線函數(shù)擬合，其擬合關(guān)聯(lián)度高達(dá)99%以上，雙曲線規(guī)律為生物光子輻射的相干理論提供了證據(jù)。

(3) 柵藻延遲發(fā)光的初始強(qiáng)度I0，隨藻密度的增加而增強(qiáng)，兩個(gè)計(jì)量之間呈顯著正相關(guān)；隨著藻液濃度的降低，指數(shù)因子β逐漸增大，即雙曲線的弛豫速率升高，衰減變快；τ 是一個(gè)特征時(shí)間，與樣品自身的性質(zhì)有關(guān)。隨著柵藻濃度的降低，延遲發(fā)光的特征時(shí)間有升高的趨勢(shì)，這一結(jié)果再次驗(yàn)證了生物光子輻射相干性理論。

柵藻有較強(qiáng)的生物光子輻射能力，其延遲發(fā)光的雙曲線規(guī)律為生物光子輻射的相干性理論提供了證據(jù)。雙曲函數(shù)擬合出來的三個(gè)參數(shù)(I0、τ、β)有明顯差別，其中τ 是一個(gè)特征時(shí)間，與樣品自身的性質(zhì)有關(guān)。隨著柵藻濃度的降低，延遲發(fā)光的特征時(shí)間有升高的趨勢(shì)，這一結(jié)果再次驗(yàn)證了生物光子輻射相干性理論。這三個(gè)參數(shù)攜帶著不同濃度柵藻和液體培養(yǎng)基的信息，即生物光子輻射攜帶著自身狀態(tài)和外界狀況的信息。這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的的獲得，為柵藻可作為液體環(huán)境的生物指示劑，奠定了一定的理論基礎(chǔ)。