脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?；a(chǎn)物的培養(yǎng)提取及制備

徐 華，吳弼東，郭 磊，陳 佳，林妮妮，謝劍煒*

（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點實驗室，北京 100850）

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?；a(chǎn)物的培養(yǎng)提取及制備

徐 華，吳弼東，郭 磊，陳 佳，林妮妮，謝劍煒*

（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點實驗室，北京 100850）

以禾谷鐮刀菌Fusarium graminearum大型分生孢子定量接種大米培養(yǎng)物，制備毒素粗提液，采用硅膠柱一步洗脫分離、分段收集可同時獲得脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）和乙?；撗跹└牭毒┐迹╝cetyldeoxynivalenol，AcDON），采用一步結(jié)晶法即可分別制備獲得毒素純品，并經(jīng)紅外光譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)及核磁共振氫譜等分析確證，液相色譜分析表明兩種毒素純度均大于98%。該培養(yǎng)提取及分離制備方法改變了常規(guī)多步驟繁瑣過程，提供了一種切實有效的、大量制備純化DON及乙酰化DON毒素的簡便方法。

禾谷鐮刀菌；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇；乙?；撗跹└牭毒┐迹慌囵B(yǎng)；制備

由鐮刀菌引起的赤霉?。‵usarium head blight）是危害小麥、大麥、燕麥、玉米、水稻、黑麥等多種禾谷類作物的一種重要病害，廣泛分布于亞洲、歐洲和北美等溫暖潮濕地區(qū)，近年來隨著全球氣候變暖呈逐步蔓延之勢。農(nóng)作物在生長或儲藏過程中均可感染鐮刀菌，不但造成作物產(chǎn)量下降，更重要的是產(chǎn)生的鐮刀菌毒素直接蓄積于禾谷類籽粒中，嚴(yán)重威脅人畜健康［1-4］。

在我國，禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）是赤霉病的主要病原菌。禾谷鐮刀菌主要產(chǎn)生B族單端孢霉烯族毒素，其中以脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），又名嘔吐毒素（vomitoxin，VT）為主。DON利用其倍半萜烯結(jié)構(gòu)作用于真核細(xì)胞蛋白質(zhì)翻譯過程的不同階段，抑制蛋白質(zhì)合成，破壞人畜的免疫系統(tǒng)，使中毒者出現(xiàn)腹瀉、嘔吐和頭暈等癥狀，是最主要的導(dǎo)致食物中毒的真菌毒素之一［5-9］。目前，各國針對谷物及其制品中DON的含量制定了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)，我國谷物中DON的限量標(biāo)準(zhǔn)為1.0 mg/kg［10-12］。

DON的乙?；饕l(fā)生在其3’和15’位點，產(chǎn)生兩種乙?；a(chǎn)物，分別為3-乙?；撗跹└牭毒┐迹?-acetyldeoxynivalenol，3-AcDON）和15-乙?；撗跹└牭毒┐迹?5-acetyldeoxynivalenol，15-AcDON）。DON及3-AcDON、15-AcDON的結(jié)構(gòu)如圖1所示。一般認(rèn)為，乙酰化DON的毒性與DON相當(dāng)。亦有研究報道，產(chǎn)生3-AcDON的鐮刀菌具有更強的產(chǎn)孢率和生長速率，對麥類作物的危害更為嚴(yán)重，并且正在取代產(chǎn)生其他毒素的鐮刀菌，表現(xiàn)出更強的適應(yīng)性［13-14］。因此，需重視DON乙?；a(chǎn)物的相關(guān)研究。

圖1　化合物DON及乙?；疍ON的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of mycotoxin deoxynivalenol （DON） and acetyldeoxynivalenol （AcDON）

鑒于真菌毒素DON和乙?；疍ON在小麥等谷物中普遍存在，繼而對人類和動物的安全造成嚴(yán)重威脅的現(xiàn)實，近年來，針對DON及DON相關(guān)毒素的分析檢測、體內(nèi)外毒性研究及安全性評價等已引起國外廣泛關(guān)注［15-19］。由于目前歐美多國遵循禁止向非澳大利亞公約組織國家出售毒素及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)品的禁運規(guī)定，而我國DON相關(guān)毒素參考品的制備尚屬空白，因而國內(nèi)DON毒素的相關(guān)研究存在較大遲滯。因此，亟需研發(fā)一種簡便的、可有效制備大量DON及乙?；疍ON化合物的方法。

1　材料與方法

1.1菌株、培養(yǎng)基與試劑

禾谷鐮刀菌菌株Fusarium graminearum ACCC31058和ACCC31057購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

馬鈴薯葡萄糖（PDA）培養(yǎng)基購自北京奧博星生物有限公司。

DON、3-AcDON和15-AcDON毒素參考品是本實驗室儲存品，均配成1 mg/mL的丙酮或乙腈溶液備用；其他所有試劑均為分析純及以上純度。

1.2儀器與設(shè)備

Acquity UPLC-Xevo G2 Q-TOF-MS儀器（配有電噴霧離子源（ESI）及Masslynx 4.1數(shù)據(jù)采集處理系統(tǒng)）美國Waters公司；XDB C18色譜柱 美國Agilent公司；Thermo 6700傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo公司；ECS400MHz超導(dǎo)傅里葉變換核磁共振譜儀 日本Jeol公司。

1.3方法

1.3.1菌株培養(yǎng)和毒素生產(chǎn)

將禾谷鐮刀菌菌株ACCC31058從冷藏斜面轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基平板上活化，25 ℃培養(yǎng)3～5 d，挑取少量的菌絲接種到質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%綠豆湯培養(yǎng)基中，其瓶底預(yù)先鋪滿約1/2底表面積的直徑約4～5 mm的玻璃珠，于25 ℃條件下200～250 r/min搖床振蕩培養(yǎng)3～5 d，獲得種子液。種子液經(jīng)無菌紗布過濾除去菌絲，用血球計數(shù)器對大型分生孢子進(jìn)行計數(shù)。在500 mL三角燒瓶中加入87.5 g大米，然后加入37.5 mL蒸餾水，高壓制備無菌米飯培養(yǎng)基。接種1×106個孢子至米飯培養(yǎng)基中，拍打混勻，20～25 ℃靜置培養(yǎng)，每日拍打瓶子底部防止培養(yǎng)基結(jié)塊，分別于10、20、30、40、50、60、100 d收獲大米固體培養(yǎng)物。

1.3.2粗毒素提取及鑒定

每瓶大米固體培養(yǎng)物先后分別用400 mL 70%甲醇溶液和250 mL純甲醇溶液浸泡過夜，合并兩次浸提液，減壓蒸去甲醇，加入1/3體積的飽和氯化鈉水溶液，靜置1 h后去除沉淀，再用乙酸乙酯萃取2 次，每次100 mL。收集乙酸乙酯相，合并后減壓蒸餾濃縮，獲得毒素的粗提液，并經(jīng)薄層層析（thin layer chromatography，TLC）鑒定：將毒素粗提液，用二氯甲烷和四氫呋喃體積比為10：3的展開劑在F254薄層硅膠板上展開，以20%三氯化鋁乙醇水溶液噴板顯色。

1.3.3液相色譜-質(zhì)譜分析毒素粗提液

將毒素粗提液旋干后，用等量甲醇溶液重懸后，取2 μL上清液進(jìn)樣分析。色譜條件：XDB C18色譜柱（3.0 mm×100 mm，1.8 μm），流動相A為含5 mmol/L乙酸銨的純水溶液，流動相B為含5 mmol/L乙酸銨的甲醇溶液，梯度洗脫程序：0～1 min，20% B；1～7 min，20% B～70% B（線性）；7～9 min，70% B。柱溫40 ℃，流速0.2 mL/min。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，毛細(xì)管電壓2 500 V，錐孔電壓20 V，萃取電壓4 V，離子源溫度100 ℃，脫溶劑氣溫度300 ℃，錐孔氣流量50 L/h，脫溶劑氣流量800 L/h。通過Acquity UPLC-Xevo G2 Q-TOF-MS儀器所配采集系統(tǒng)軟件Masslynx 4.1進(jìn)行譜圖數(shù)據(jù)的采集，分析毒素粗提液成分。

1.3.4毒素制備

1.3.4.1毒素粗提液一步分離

毒素粗提液過制備型硅膠柱（300目，20 cm×2.5 cm），以二氯甲烷和四氫呋喃體積比為10：3的混合洗脫液一步洗脫，保持流速約為1 mL/min。

1.3.4.2乙酰化DON毒素制備

首先收集第30～80 mL流分，將目標(biāo)流分合并蒸干后用正己烷提取3 次，棄去正己烷相，剩余溶液濃縮獲得棕紅色油狀物。將此棕紅色油狀物過干法制備的硅膠柱（300 目，25 cm×1.0 cm），以正己烷和乙酸乙酯體積比為1：1的混合液常壓洗脫，保持流速約為1 mL/min，收集第60～100 mL流分，旋蒸至干，獲得產(chǎn)物呈淡黃色油狀物。將獲得的產(chǎn)物在乙酸乙酯和正己烷混合體系中放置結(jié)晶，抽濾后得白色晶體，即為純化的乙?；疍ON。

1.3.4.3DON毒素制備

另收集第200～330 mL流分，用薄層層析檢測每管洗脫液中含有DON的情況，合并含有DON的收集管并旋轉(zhuǎn)蒸干，溶解于少量的正己烷和乙醚體系中，抽濾后得白色晶體，即為純化的DON。

1.3.5毒素鑒定

分別采用紅外光譜法（infrared spectroscopy，IR）、質(zhì)譜法（mass spectrometry，MS）和核磁共振氫譜（nuclear magnetic resonance hydrogen spectrum，1H-NMR）方法對制備純化的兩種毒素進(jìn)行鑒定。

2　結(jié)果與分析

2.1薄層色譜鑒定

大米培養(yǎng)物提取的毒素粗提液經(jīng)薄層色譜鑒定，結(jié)果表明硅膠板上出現(xiàn)2 個明顯的藍(lán)紫色熒光斑點，分別與DON參考品和3-AcDON或15-AcDON參考品的Rf值相同。

2.2毒素粗提液的液相色譜-質(zhì)譜定性鑒定結(jié)果

圖2　禾谷鐮刀菌ACCC31058毒物粗提液的液相色譜--質(zhì)譜鑒定總離子流圖Fig.2 Total ion chromatography of the crude extracts from Fusarium graminearum ACCC31058 cultures

由圖2可知，在大米培養(yǎng)物提取的粗毒素產(chǎn)物中，除了DON色譜峰外，還有一個明顯的產(chǎn)物峰，其MS圖中的基峰m/z為307.16，結(jié)合TLC鑒定結(jié)果，推測為乙?；疍ON產(chǎn)物，由于常見的DON乙?；稽c存在于3’和15’位，需要進(jìn)一步確認(rèn)其位點信息。由于3-AcDON和15-AcDON的結(jié)構(gòu)和極性均極其相似，兩者在液相色譜柱上的保留行為幾乎一致。在考察不同液相色譜條件的基礎(chǔ)上，最終成功實現(xiàn)了兩者的液相色譜分離，結(jié)果如圖2所示。從而確認(rèn)了該培養(yǎng)物中主要存在的乙?；疍ON產(chǎn)物為3-AcDON。

2.3DON和3-AcDON的培養(yǎng)時間-質(zhì)量濃度曲線

考察大米培養(yǎng)物中DON和乙?；疍ON的質(zhì)量濃度隨培養(yǎng)時間的變化曲線，結(jié)果如圖3所示，在25 ℃條件下培養(yǎng)50 d時，DON產(chǎn)量達(dá)到高峰，而乙酰化DON則隨著培養(yǎng)時間的延長呈下降趨勢，尤其在培養(yǎng)50 d時下降顯著，綜合考慮，最終選擇最佳培養(yǎng)時間為40～50 d。

圖3　DON及3-AcDON的培養(yǎng)時間-質(zhì)量濃度曲線Fig.3 Culture time-concentration curves of DON and 3-AcDON

圖4　化合物DON的紅外光譜鑒定圖Fig.4 Infrared spectrum of DON

兩種化合物結(jié)晶物的紅外光譜與相應(yīng)的參考譜圖完全一致［20］，鑒定結(jié)果見圖4和圖5。其中，DON紅外光譜的特征峰為3 471 cm-1（-OH）、2 972 cm-1（-CH3）、1 677 cm-1（-C=O）、1 468 cm-1（-CH3）、1 171 cm-1（-C-O）和1 080 cm-1（-C-O）。3-AcDON紅外光譜的特征峰為3 492 cm-1（-OH）、3 422 cm-1（-OH）、1 740 cm-1（-C=O）和1 680 cm-1（-C=O）。

圖5　化合物3-AcDON的紅外光譜鑒定圖Fig.5 Infrared spectrum of 3-AcDON

2.5質(zhì)譜鑒定

DON的一級質(zhì)譜中（圖6A），其分子離子峰［M-H］-為m/z 295.1，與其相對分子質(zhì)量296.1相吻合，同時可觀察到其乙酸加合峰為m/z 355.1［M+CH3COO］。其主要碎片離子峰（圖6B）與參考品譜圖及文獻(xiàn)報道均一致［21-22］，分別為m/z 265.1［M-CH2O-H］-，m/z 247.1［M-CH2OH2O-H］-和m/z 217.1［M-2CH2O-H2O-H］-等。

圖6　化合物DON的液相色譜-質(zhì)譜鑒定圖Fig.6 HPLC-MS spectra of DON

3-AcDON的一級質(zhì)譜中（圖7A），其分子離子峰［M-H］-為m/z 337.1，與其相對分子質(zhì)量338.1相吻合，同時可觀察到其乙酸加合峰為m/z 397.1［M+CH3COO］-。其主要碎片離子峰（圖7B）裂解規(guī)律與DON類似，分別為m/z 307.1［M-CH2O-H］-，m/z 247.1［M-CH2OCH2CO-H2O-H］-和m/z 217.1［M-2CH2O-CH2COH2O-H］-等。

圖7　化合物3-AcDON的液相色譜-質(zhì)譜鑒定圖Fig.7 HPLC-MS spectra of 3-AcDON

2.6核磁共振氫譜鑒定

DON的1H-NMR圖譜為δ H2，3.66；H3，4.63；H4，2.20；H7，4.95；H10，6.79；H11，4.50；H13a，3.14；13b，3.25；H14，1.15；H15a，3.66；H15b，3.98；H16，1.92。3-AcDON的1H-NMR圖譜為δ H2，3.91；H3，5.23；H4b，2.18；H4a，2.36；H7，4.68；H10，6.62；H11，4.84；H13a，3.13；H13b，3.19；H14，1.17；H15a，3.80；H15b，3.87；H16，2.15。兩種化合物的1H-NMR鑒定結(jié)果表明，制備獲得的DON和3-AcDON其1H-NMR δ值與參考品的δ值一致。兩種化合物可確認(rèn)為DON和3-AcDON。

2.7DON和3-AcDON的純度鑒定

基于液相色譜法（紫外檢測器）中的歸一化法分析兩種毒素的純度，其純度均達(dá)到98%以上，可以滿足毒素相關(guān)科研的要求，亦為國際可比對實驗結(jié)果和風(fēng)險評估的準(zhǔn)確數(shù)據(jù)提供質(zhì)量保障。

3　討 論

本研究以打破國際禁運壁壘為導(dǎo)向，針對目前真菌毒素參考品的獲取難題，旨在探討一種簡便易行的高純度DON及相關(guān)毒素制備方法，為準(zhǔn)確度高的溯源性分析檢測提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

DON屬于倍半萜烯類化合物，具有較為復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)，迄今為止尚未實現(xiàn)DON的化學(xué)全合成［15，23］。一般而言，DON從菌株培養(yǎng)提取后制備純化而得，其中關(guān)鍵步驟之一為種子液的獲得，即通過培養(yǎng)獲得足夠數(shù)量的大型分生孢子以作接種擴(kuò)大培養(yǎng)之用。但采用傳統(tǒng)振蕩式培養(yǎng)時，菌絲的抱團(tuán)生長會對孢子的產(chǎn)生造成極大限制，影響其后的接種效率。本研究經(jīng)大量前期實驗，確定往放置種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中加入玻璃珠，再行振蕩培養(yǎng)，利用玻璃珠在振蕩培養(yǎng)中產(chǎn)生的足夠大的剪切力，能夠有效抑制菌絲抱團(tuán)生長，從而促進(jìn)孢子的優(yōu)勢生長。

產(chǎn)毒時適用的接種培養(yǎng)基分為固體（米飯或者麥粒等）培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基。一般認(rèn)為，固體培養(yǎng)基產(chǎn)生DON的效率要優(yōu)于液體培養(yǎng)基，因此在DON毒素的制備純化過程中，固體培養(yǎng)基仍是首選［24-25］。但是，采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)時，由于小麥和大米中含有較豐富的蛋白質(zhì)和糖類等組分，導(dǎo)致DON毒素粗提液中往往存在較多雜質(zhì)，進(jìn)而導(dǎo)致了制備純化步驟較為繁瑣耗力，效率較低，因此本研究對傳統(tǒng)制備純化中需多步分離洗脫、重復(fù)結(jié)晶的步驟［15，21，25-27］加以改進(jìn)，采用甲醇-乙酸乙酯體系獲得毒素粗提液，僅需要通過兩根硅膠柱串聯(lián)、一步分離洗脫的途徑，即可獲得純度良好的DON毒素，并且在正己烷和乙醚體系中通過一步重結(jié)晶的步驟，獲得的DON純度即大于98%。

研究中還發(fā)現(xiàn)，毒素粗提液中除了含有DON毒素外，還有高含量的乙?；疍ON毒素存在。通過優(yōu)化液相色譜及質(zhì)譜方法，建立了分離鑒定3-AcDON和15-AcDON的方法，最終確定了ACCC31058菌株的毒素粗提液中主要含有DON和3-AcDON毒素。對培養(yǎng)物中該兩種毒素的生成量隨培養(yǎng)時間的變化趨勢進(jìn)行了考察，結(jié)果表明DON產(chǎn)量呈現(xiàn)近似拋物線型關(guān)系，培養(yǎng)時間過長造成DON產(chǎn)量下降的原因不明，可能在于DON的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化抑或降解，其機理尚待進(jìn)一步研究。在25 ℃培養(yǎng)50 d時，DON的產(chǎn)量達(dá)到最大值，此結(jié)果與文獻(xiàn)中報道的一旦培養(yǎng)時間超過30 d，DON含量將急劇下降不同［25，28］，究其原因可能與菌株來源不同以及培養(yǎng)環(huán)境差異有關(guān)。而3-AcDON則隨著培養(yǎng)時間的延長呈下降趨勢，推測其可能在培養(yǎng)初期即迅速達(dá)到最高值，有待進(jìn)一步考證。為了同時大量獲得兩種毒素，本研究確定最佳培養(yǎng)時間為40～50 d。在制備純化毒素過程中，發(fā)現(xiàn)DON制備純化過程中的一步洗脫步驟，同樣適用于洗脫收集富含3-AcDON的流分。先行收集的該段流分濃縮后，再經(jīng)過一次硅膠柱的層析純化，即可獲得純度較好的3-AcDON，同樣，采取乙酸乙酯和正己烷混合體系一步重結(jié)晶，即可獲得純度大于98%的3-AcDON。

對獲得的兩種化合物進(jìn)行鑒定，其IR、MS以及1H-NMR數(shù)據(jù)值均與相應(yīng)的參考品及文獻(xiàn)報道一致。從而確認(rèn)兩種化合物為DON和3-AcDON。經(jīng)計算，ACCC31058菌株大米培養(yǎng)物的產(chǎn)毒率約為DON 320 mg/kg和3-AcDON 260 mg/kg。為了驗證建立的培養(yǎng)及提取制備方法的適用性，對不同來源的菌株ACCC31057進(jìn)行同樣操作，最終也同樣獲得了高純度的DON毒素及其乙?；舅禺a(chǎn)物，產(chǎn)毒率約為DON 220 mg/kg和3-AcDON 180 mg/kg。

綜上所述，本研究所建立的方法摒棄了常規(guī)的多步驟分離洗脫以及反復(fù)重結(jié)晶的繁瑣流程，采用一步洗脫分段收集以及一次重結(jié)晶法，從毒素粗提液中同時制備了DON毒素及乙酰化DON毒素，操作簡單、實驗費用低、產(chǎn)品收率高、純度較高，是一種切實有效的、適用于大量制備純化DON及相關(guān)毒素的簡便方法。這為后續(xù)深入開展DON相關(guān)毒素在動物體內(nèi)外的代謝轉(zhuǎn)化研究，以及為食品安全風(fēng)險評估等提供了堅實的物質(zhì)基礎(chǔ)。

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A Convenient Method for Preparation and Purification of Deoxynivalenol and Acetyldeoxynivalenol from Fusarium graminearum Culture

XU Hua， WU Bidong， GUO Lei， CHEN Jia， LIN Nini， XIE Jianwei*
（State Key Laboratory of Toxicology and Medical Countermeasures， Institute of Pharmacology and Toxicology，Academy of Military Medical Sciences， Beijing 100850， China）

Fusarium graminearum macroconidia were quantitatively inoculated in rice culture， and the crude extracts of the toxins were prepared and subjected to silica gel column chromatography. Deoxynivalenol （DON） and acetyldeoxynivalenol（AcDON） isolates were monitored by thin-layer chromatography and the fractions rich in these toxins were pooled and concentrated， respectively. Both fractions yielded a crystalline material through a simple crystallization step. The two compounds were identified and confirmed by infrared spectroscopy， liquid chromatography-mass spectrometry and1H NMR analysis in comparison to the reference standards or the published data. The liquid chromatography analysis showed that the purity of the two toxins were both greater than 98%. This method developed here has overcome the disadvantages of the conventional cumbersome multi-step procedure， and provided a simplified and efficient strategy suitable for large-scale production and purification of the mycotoxin DON and its acetylated products AcDON from Fusarium graminearum rice cultures.

Fusarium graminearum； deoxynivalenol； acetyldeoxynivalenol； culture； preparation

TS201.3

A

1002-6630（2015）03-0132-05

10.7506/spkx1002-6630-201503025

2014-03-21

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2011BAK10B07-1）

徐華（1979—），女，助理研究員，博士，研究方向為毒物藥物分析。E-mail：xuhua-1979@163.com

謝劍煒（1964—），男，研究員，博士，研究方向為毒物藥物分析。E-mail：xiejw@bmi.ac.cn