高效水解乳糖乳酸菌的篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化

劉曜綜，曾小群*，潘道東王賢斌沈建良

（1.寧波大學海洋學院，浙江 寧波 315211；2.河北科技師范學院動物科技學院，河北 秦皇島 066000；3.浙江卓旺農業(yè)科技有限公司，浙江 湖州 313014）

高效水解乳糖乳酸菌的篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化

劉曜綜1，2，曾小群1，*，潘道東1，王賢斌1，沈建良3

（1.寧波大學海洋學院，浙江 寧波 315211；2.河北科技師范學院動物科技學院，河北 秦皇島 066000；3.浙江卓旺農業(yè)科技有限公司，浙江 湖州 313014）

我國新疆地區(qū)傳統(tǒng)酸馬奶中乳酸菌資源豐富，為獲得高效降解乳糖的乳酸菌及其發(fā)酵條件，本實驗從分離自新疆酸馬奶的14 株乳酸菌中，篩選出1 株高效水解乳糖的發(fā)酵乳桿菌RB-6，其乳糖水解率達37%。進一步利用單因素試驗和正交 試驗對發(fā)酵乳桿菌RB-6的發(fā)酵溫度、接種量和發(fā)酵時間進行優(yōu)化，獲得其乳糖水解率最高的發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度39 ℃、接種量3%、發(fā)酵時間8 h。發(fā)酵乳桿菌RB-6在該條件下發(fā)酵酸奶的乳糖水解率達47%，比優(yōu)化前提高了10%。

篩選；乳糖水解；乳酸菌；發(fā)酵條件；優(yōu)化

乳糖不耐癥在我國成年人中十分普遍，影響了人們對牛奶中營養(yǎng)成分的吸收利用。由于成人體內缺乏β-半乳糖苷酶，牛奶中的乳糖不能在小腸中消化吸收，直接被運送到大腸發(fā)酵，使腸道內有機酸、CO2等大量積累，刺激腸黏膜，出現(xiàn)腹脹、腹痛、嘔吐和腹瀉等一系列的乳糖不耐受癥狀［1-2］。2012年我國牛奶產量超過3 000萬 t，比十年前增加了 近10 倍，隨著乳制品更多地進入人們的生活，乳糖的吸收利用問題也越來越受到關注［3］。

乳酸菌作為一種安全、應用廣泛的重要益生菌，具有較強的乳糖水解能力，在無葡萄糖抑制條件下，乳酸菌可通過PTS轉運系統(tǒng)（phosphotransferase systems）攝取磷酸乳糖，經磷酸β-半乳糖苷酶作用水解成6-磷酸半乳糖和葡萄糖，并分別經6-磷酸塔格糖途徑和糖酵解途徑分解；也可以在乳糖透性酶作用下直接攝取乳糖，進而由β-半乳糖苷酶作用水解成葡萄糖和半乳糖，葡萄糖經發(fā)酵途徑生成乳酸，起到緩解乳糖不耐癥的作用［4-5］。研究表明，利用乳酸菌發(fā)酵酸奶可降解牛奶中30%～40%的乳糖［6］。同時，它還具有改善人體腸道、抑制腐敗菌繁殖、降低膽固醇、降血脂、降血壓、增強人體免疫力和抵抗力、抗腫瘤、預防癌癥等功效［7］。

我國新疆地區(qū)許多家庭保持著自制酸馬奶的傳統(tǒng)，經過人類的長期馴化，酸馬奶中的乳酸菌發(fā)酵水解乳糖的能力得到顯著提高［8］。本實驗對從新疆酸馬奶中分離的14 株乳酸菌的水解乳糖能力進行比較，篩選出高效水解乳糖乳酸菌菌株，并進一步優(yōu)化其發(fā)酵條件，提高乳酸菌發(fā)酵過程中的乳糖水解率。以在解決乳糖不耐癥問題，提高牛奶中營養(yǎng)物質利用率，有效利用菌種優(yōu)勢，節(jié)約資源，治理環(huán)境污染等方面發(fā)揮作用。

1　材料與方法

1.1菌種與培養(yǎng)基

新疆酸馬奶分離的1 4 株乳酸菌［9］：發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）RA-3、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）RA-4、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）RA-5、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）RB-1、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）RB-2、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）RB-3、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）RB-4、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）RB-5、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）RB-6、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）RC-1、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）RC-2、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）RC-3、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）RC-4、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）RC-5，本實驗室保存。

MRS固體培養(yǎng)基：乳酸菌專用MRS固體培養(yǎng)基杭州微生物試劑有限公司；牛奶液體培養(yǎng)基：高蛋白高鈣脫脂奶粉 內蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司，配成139 g/L的脫脂奶；沉淀劑：120 g/L ZnSO4溶液、20 g/L NaOH溶液，體積比1：1取用；顯色劑：10 g/L苯酚溶液、50 g/L NaOH溶液、10 g/L苦味酸溶液、10 g/L亞硫酸氫鈉溶液，體積比1：2：2：1順序混合。

1.2儀器與設備

UV-4802紫外-可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠；高速冷凍離心機 湘儀離心機儀器有限公司；高壓立式蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；冰箱 青島海爾股份有限公司；超凈工作臺 蘇州華科凈化設備有限公司；pH計 梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3高活性水解乳糖乳酸菌菌株的篩選

1.3.1乳糖標準曲線的繪制

精密稱取分析純的乳糖0.5 g，干燥2 h，溶解，移入500 mL容量瓶。分別吸取乳糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于25 mL比色管中并加入2.5 mL顯色劑，加塞混勻，準確沸水浴6 min，稀釋至25 mL，于520 nm波長處測定吸光度［10-11］。

1.3.2測定牛奶乳糖吸光度

取10 mL牛奶于200 mL容量瓶，再取25 mL稀釋后牛奶于100 mL容量瓶，順序加入5 mL ZnSO4溶液和5 mL NaOH溶液，沉淀溶液中的蛋白質，消除蛋白質對乳糖吸光度測定的影響。稀釋至刻度，靜置30 min，干燥濾紙過濾，棄去初濾液，收集濾液。同時制備對照組。分別取牛奶和對照組2 mL于25 mL比色管，加入2.5 mL顯色劑，沸水浴6 min，稀釋至25 mL，于520 nm波長處測定吸光度［10-11］。

1.3.3發(fā)酵液乳糖水解率測定

活化保藏菌種，3%接種量接種牛奶液體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)8 h。

發(fā)酵液3 000 r/min離心30 min，取上清液，按1.3.2節(jié)所述的方法處理發(fā)酵液、測定吸光度。并按如下公式對乳糖質量濃度和乳糖水解率進行計算。

式中：R為乳糖水解率/%；ρ1為牛奶乳糖質量濃度/（mg/mL）；ρ0為發(fā)酵液乳糖質量濃度/（mg/mL）。

1.4乳酸菌水解乳糖發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.4.1單因素試驗

將篩選獲得乳酸菌種以3%接種量接種于牛奶液體培養(yǎng)基，分別在35、36、37、38、39 ℃條件恒溫培養(yǎng)8 h，每一溫度設置3 次重復，確定最佳發(fā)酵溫度。分別以1%、2%、3%、4%、5%接種量接種于牛奶液體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)8 h，每一接種量設置3 次重復，確定最佳接種量。以3%接種量接種乳酸菌于牛奶液體培養(yǎng)基，分別于37 ℃恒溫培養(yǎng)6、7、8、9、10 h，每一發(fā)酵時間設置3 次重復，確定最佳發(fā)酵時間。

1.4.2正交試驗

在單因素試驗結果基礎上，以發(fā)酵溫度、接種量、發(fā)酵時間為主要影響因素，乳糖水解率為響應值，做三因素三水平正交試驗，每一處理設置3 次重復，確定最佳發(fā)酵條件。正交試驗獲得最佳發(fā)酵條件后，進一步做驗證實驗，測定在該條件下的乳糖水解率。

2　結果與分析

2.1乳糖標準曲線

以乳糖吸光度為橫坐標（X）、乳糖質量濃度為縱坐標（Y），繪制乳糖標準曲線。結果顯示在0～2.5 mg/mL范圍內，乳糖質量濃度和乳糖吸光度呈良好的線性關系：Y=3.567X+0.033（R?=0.985 5）。以2.5 mg/mL乳糖溶液測定乳糖吸光度，相對標準偏差為0.2%（n=5），說明精密度良好。

2.2不同菌種乳糖水解率比較

圖1　不同乳酸菌菌株乳糖水解率比較Fig.1 Comparisons of lactose hydrolysis rates among different lactic acid bacteria

14 株乳酸菌的乳糖水解率見圖1，其中發(fā)酵乳桿菌RB-6乳糖水解率最高，達37%；其次為發(fā)酵乳桿菌RC-3，乳糖水解率為34%；發(fā)酵乳桿菌RB-2的乳糖水解率最低，僅為14%。在這14 株乳酸菌中，發(fā)酵乳桿菌RB-6、發(fā)酵乳桿菌RC-3、植物乳桿菌RA-4的乳糖水解率較高，均高于30%；發(fā)酵乳桿菌RB-2、發(fā)酵乳桿菌RB-3、戊糖乳桿菌RC-4的乳糖水解率較低，均低于20%；有11 株乳酸菌的乳糖水解率高于20%；說明新疆酸馬奶為篩選降解乳糖乳酸菌的較好來源。

2.3單因素試驗結果

圖2　發(fā)酵溫度（A）、接種量（B）、發(fā)酵時間（C）對發(fā)酵乳桿菌RB-6乳糖水解率的影響Fig.2 Effects of fermentation temperature （A）， inoculum size （B） and fermentation period （C） on rates of lactose hydrolysis by Lactobacillus fermentum RB-6

由圖2A可知，發(fā)酵乳桿菌RB-6在39 ℃時，乳糖水解率最高；發(fā)酵溫度在35～39 ℃范圍內，乳糖水解率由18%增加到了47%，隨溫度上升而增加。當接種量為3%時，乳糖水解率最高，達37%；接種量為1%～3%，乳糖水解率呈上升趨勢，由23%上升到37%；但接種量為3%～5%，乳糖水解率從37%下降到25%（圖2B）。由圖2C可知，發(fā)酵6～10 h內，乳糖水解率逐漸上升，在發(fā)酵10 h時乳糖水解率最高，達41%。

2.4正交試驗結果

表1　正交試驗方案設計及結果Table1 Orthogonal array design with experimental results

正交試驗結果（表1）表明，乳糖水解率最高的發(fā)酵條件為A3B2C3，即發(fā)酵溫度39 ℃、接種量3%、發(fā)酵時間8 h。方差分析結果（表2）表明，發(fā)酵溫度對發(fā)酵乳桿菌RB-6發(fā)酵乳糖水解率的影響極顯著，接種量和發(fā)酵時間對乳糖水解率的影響顯著，其影響主次排序為：發(fā)酵溫度＞接種量＞發(fā)酵時間。

表2　方差分析Table2 Analysis of variance

2.5驗證實驗

在正交試驗所得的乳糖水解率最高的條件下發(fā)酵，即發(fā)酵溫度39 ℃、菌種接種量3%、發(fā)酵時間8 h，測得在該條件下發(fā)酵得到的乳糖水解率為47%，高于正交試驗各組的乳糖水解率，與理論預測值相符。表明通過正交試驗得到的發(fā)酵條件結果是可靠的。

3　討 論

新疆酸馬奶中分離的不同優(yōu)良乳酸菌具有不同乳糖水解能力、產酸能力和發(fā)酵性能［8-9］。本實驗通過正交試驗篩選出的發(fā)酵乳桿菌RB-6，以3%接種量，39 ℃培養(yǎng)8 h，乳糖水解率為37%。優(yōu)化發(fā)酵條件后，其乳糖水解率達到47%，比優(yōu)化前提高了10%，據文獻報道，牛奶的乳糖水解率達50%左右就可以很好的克服乳糖不耐癥的問題［12］。本實驗所得到的酸奶的乳糖水解率高于文獻［13］所述黑曲霉的30.8%，雖然低于武波波等［14］報道的低乳糖酸奶中的乳糖水解率63%，但該低乳糖酸奶中添加了外源乳糖酶，而本實驗所得到的酸奶為發(fā)酵乳桿菌RB-6發(fā)酵過程中產生的，更安全自然，并可以有效起到預防乳糖不耐癥的作用。

單因素試驗結果顯示，發(fā)酵乳桿菌RB-6在39 ℃條件乳糖降解率最高，表明在39 ℃時乳酸菌產β-半乳糖苷酶活性最強，適宜乳酸菌發(fā)酵乳糖。熊素玉等［15］研究不同溫度對分離自新疆酸馬奶乳酸菌生長的影響，發(fā)現(xiàn)多數乳酸菌的最適生長溫度在40 ℃左右，這與本實驗獲得結果基本一致。但同陸文偉等［16］在pH 5.5，20%乳糖條件對發(fā)酵乳桿菌β-半乳糖苷酶轉糖基活性的研究存在差異，可見在不同的乳糖質量濃度、pH值條件下，乳糖最適發(fā)酵溫度也不相同。在發(fā)酵6～10 h時間段內，隨時間延長，β-半乳糖糖苷酶活性增強，也就使乳糖降解率隨時間增加而相應增加［17］。

在食品工業(yè)中，乳酸菌是發(fā)酵生產酸奶的重要菌種，水解乳糖成本低廉，發(fā)酵條件溫和，易于控制，雜質混入的可能性較?。?8-20］。另外，乳酸菌作為一種益生菌，安全可靠的同時，還可發(fā)揮益生作用，緩解乳糖不耐癥，增強免疫力促進人體尤其是腸道的健康，降低高血壓、腫瘤、脂肪肝等疾病的患病風險［19-22］。本實驗篩選的高效水解乳糖乳酸菌，為降解乳糖提供了一種經濟、有效、無污染的生物途徑，采用水解乳糖能力較高的菌種生產的酸奶中乳糖含量更低，同時，為乳糖發(fā)酵提供了可選的優(yōu)化條件，有利于乳酸菌利用碳水化合物產生乳酸，增加酸奶的酸度，減少凝乳時間，在生產發(fā)酵乳制品、調味品、功能性食品等領域都有著廣闊的前景［19-25］。同時，隨著發(fā)酵工業(yè)對優(yōu)勢菌種需求的不斷提升，高效水解乳糖乳酸菌也為采用定向誘變、DNA重組、原生質體融合技術等方法獲得高產超級工程菌豐富了菌種資源，具有廣泛的經濟和研究價值。

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Screening of Lactic Acid Bacteria with High Lactose-Hydrolyzing Ability and Optimization of Fermentation Conditions

LIU Yaozong1，2， ZENG Xiaoqun1，*， PAN Daodong1， WANG Xianbin1， SHEN Jianliang3
（1. School of Marine Sciences， Ningbo University， Ningbo 315211， China；2. Animal Science Department， Hebei Norma l University of Science and Technology， Qinhuangdao 066000， China；3. Zhejiang Zhuowang Agricultural Science and Technology Co. Ltd.， Huzhou 313014， China）

Koumiss， a traditional fermented mare’s milk in Xinjiang province of China， is an abundant source of lactic acid bacteria. Fourteen strains of lactic acid bacteria from Koumiss were screened for lactose-hydrolyzing ability. A strain of Lactobacillus fermentum RB-6 with high rate of lactose hydrolysis （37%） was obtained. Single-factor and orthogonal array designs were used to optimize the inoculum quantity， fermentation temperature， and fermentation time for the selected strain. The results indicat ed that when the fermentation was carried out for 8 h with an inoculum size of 3% at 39 ℃， the rate of lactose hydrolysis was 47%， which was increased by 10% as compared with that before optimization.

screening； lactose hydrolysis； lactic acid bacteria； fermentation conditions； optimization

TS252.42

A

1002-6630（2015）03-0090-04

10.7506/spkx1002-6630-201503017

2014-03-10

國家自然科學基金青年科學基金項目（41406165）；國家星火計劃項目（2014GA701048；2013GA701018）；浙江省科學技術廳重大科技專項計劃項目（2012C12016-1）

劉曜綜（1989—），男，碩士研究生，研究方向為農畜產品加工。E-mail：1137910323@qq.com

曾小群（1982—），女，講師，博士，研究方向為畜產品加工。E-mail：zxqun3447@126.com