青藤堿對(duì)偏頭痛模型大鼠中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)區(qū)NF-κB和COX-2表達(dá)的影響

易桂標(biāo)， 楊 麗， 郝仁方， 張中菊

（1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴州　遵義　563003；2.遵義醫(yī)學(xué)院研究生院，貴州　遵義　563003；3.遵義市第一人民醫(yī)院，貴州　遵義　563002）

青藤堿對(duì)偏頭痛模型大鼠中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)區(qū)NF-κB和COX-2表達(dá)的影響

易桂標(biāo)1，2， 楊 麗1*， 郝仁方1， 張中菊3

（1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴州遵義563003；2.遵義醫(yī)學(xué)院研究生院，貴州遵義563003；3.遵義市第一人民醫(yī)院，貴州遵義563002）

目的 研究青藤堿對(duì)偏頭痛大鼠中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)區(qū)（PAG）核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）和環(huán)氧化酶-2（COX-2）表達(dá)的影響，探討青藤堿治療偏頭痛的可能機(jī)制。方法 60只健康SD大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、模型組、尼美舒利組、青藤堿低、中、高劑量組，復(fù)制硝酸甘油型偏頭痛大鼠。尼美舒利為陽(yáng)性對(duì)照組，在制模、藥物干預(yù)后，免疫組化檢測(cè)大鼠PAG區(qū)NF-κB和COX-2陽(yáng)性表達(dá)。結(jié)果 ①與對(duì)照組比較，模型組PAG區(qū)NF-κB、COX-2表達(dá)明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；②與模型組比較，尼美舒利組和青藤堿高劑量組PAG區(qū)NF-κB、COX-2表達(dá)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；③與尼美舒利組比較，青藤堿高劑量組PAG區(qū)NF-κB、COX-2表達(dá)無(wú)明顯差異（P＞0.05）。結(jié)論 NF-κB、COX-2參與了偏頭痛發(fā)病過(guò)程；青藤堿能較好地緩解硝酸甘油型偏頭痛大鼠行為學(xué)變化，推測(cè)其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制PAG區(qū)NF-κB和COX-2的表達(dá)。

青藤堿；偏頭痛；中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)；核轉(zhuǎn)錄因子-κB；環(huán)氧化酶-2

中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)（PAG）是參與中樞內(nèi)源性鎮(zhèn)痛調(diào)控的重要結(jié)構(gòu)，內(nèi)含有多種與偏頭痛發(fā)作密切相關(guān)的炎性因子、神經(jīng)肽類、神經(jīng)遞質(zhì)以及雌激素及其相關(guān)受體［1-2］。青藤堿（正清風(fēng)痛寧主要成分）是目前臨床上用于治療風(fēng)濕類疾病的中成藥，鎮(zhèn)痛、抗炎療效顯著。將青藤堿注入家兔腹腔、靜脈所能產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效應(yīng)的劑量是側(cè)腦室的12 000倍、13 000倍，表明其作用部位主要位于中樞［3］。青藤堿的鎮(zhèn)痛、抗炎效應(yīng)是否也可作用于PAG區(qū)，用于治療偏頭痛未見文獻(xiàn)報(bào)道，故取其鎮(zhèn)痛抗炎的療效，觀察其對(duì)偏頭痛模型大鼠行為癥狀的改變和鎮(zhèn)痛效果，來(lái)探討作用于偏頭痛的可能機(jī)制與途徑，為臨床使用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠（雌雄等數(shù)）60只，體質(zhì)量（270±30）g，從第三軍醫(yī)大學(xué)附屬大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)得，許可證號(hào)為SCXK（渝）20070005。

1.1.2藥物和主要試劑 青藤堿（正清風(fēng)痛寧主要成分）由湖南正清制藥提供；硝酸甘油注射液從河南潤(rùn)弘制藥購(gòu)得；尼美舒利從海南新中正制藥有限公司購(gòu)得；NF-κB p65檢測(cè)試劑盒從北京中衫金橋試劑公司購(gòu)得；COX-2檢測(cè)試劑盒從武漢博士德試劑公司購(gòu)得。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)大鼠分組及制模與干預(yù) SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、尼美舒利組、青藤堿低、中、高劑量組，每組10只，分籠飼養(yǎng)。除對(duì)照組不作特殊處理外，余各組均皮下注射硝酸甘油注射劑2 mL（10 mg/kg）制備偏頭痛大鼠模型，隔天注射1次，共5次。在第2次造模后，尼美舒利按每日每次6 mg/kg灌服尼美舒利組，青藤堿按每日每次50 mg、100 mg、200 mg/kg灌服青藤堿低、中、高劑量組，每天灌服1次，連續(xù)7 d。

1.2.2硝酸甘油型偏頭痛大鼠模型制備及行為學(xué)評(píng)價(jià) 造模：遵從Tassorelli將硝酸甘油注射液以10 mg/kg在大鼠頸部皮下注射制模，約4 min左右大鼠出現(xiàn)兩耳充血發(fā)紅，前肢不停撓頭，爬籠明顯，煩躁不安等被視作造模成功［4］。

評(píng)估：①耳紅即記錄大鼠制模后耳紅開始及消失時(shí)間。②撓頭即記錄大鼠制模后撓頭開始及消失時(shí)間。撓頭開始時(shí)間，以連續(xù)撓頭達(dá)5次以上為準(zhǔn)，消失時(shí)間，則以一個(gè)時(shí)間段中大鼠撓頭次數(shù)少于5次并出現(xiàn)倦怠、疲乏為準(zhǔn)。③撓頭次數(shù)即從制模后開始，每30 min為一個(gè)時(shí)間段，持續(xù)分段記錄撓頭次數(shù)［5］。

1.2.3切片制備及免疫組織化學(xué) 大鼠最后一次造模、灌服藥后3 h，10%水合氯醛（0.4 mL/100 g）腹腔內(nèi)注射麻醉后，仰臥固定，剪開胸、腹腔，從心尖部緩慢置入穿刺針達(dá)主動(dòng)脈并固定，剪破右心房。先快速灌注無(wú)菌生理鹽水100～200 mL，隨后灌注4℃4%多聚甲醛液100～200 mL，至大鼠肢體強(qiáng)直變硬、尾巴豎立后，終止灌注。斷頭后，依據(jù)諸葛啟釧主譯的《大鼠腦立體定位圖譜》剝離中腦PAG區(qū)域的位置組織，于4%多聚甲醛液浸泡固定24 h，常規(guī)脫水、石蠟包埋。于石蠟切片機(jī)對(duì)其行連續(xù)冠狀面切片，切片厚度25μm，貼于多聚賴氨酸處理過(guò)的載玻片，烤片機(jī)中58℃2 h烤干備用。石蠟切片，取1張貼于普通載玻片行常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察確定組織結(jié)構(gòu)未被破壞，行切片免疫組化染色。采用SABC法。操作步驟嚴(yán)格按說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.4陽(yáng)性細(xì)胞記數(shù) 在光學(xué)顯微鏡下：NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞為卵形或梭形，細(xì)胞漿呈棕褐色。COX-2陽(yáng)性細(xì)胞，染色較淡，主要為細(xì)胞核染色，隨著染色程度的不同呈現(xiàn)棕灰色或棕色。每張切片40倍鏡下取左上、下，右上、下和中央5個(gè)鏡野，計(jì)數(shù)每個(gè)鏡野陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)，取均值。

2　結(jié)果

2.1大鼠行為癥狀學(xué)變化 硝酸甘油造模約30 min后，大鼠除對(duì)照組外，其余各組均出現(xiàn)兩耳發(fā)赤，前肢不停搔頭，爬籠、活動(dòng)明顯，煩躁不安等現(xiàn)象，此過(guò)程延續(xù)約3 h，繼而出現(xiàn)倦怠、蜷臥，活動(dòng)減少。在藥物干預(yù)后，藥物干預(yù)組與模型組耳紅及撓頭開始時(shí)間比較，無(wú)明顯差異；青藤堿高劑量及尼美舒利干預(yù)組耳紅及撓頭消失的時(shí)間較模型組大鼠明顯縮短；藥物干預(yù)組大鼠各時(shí)間段撓頭次數(shù)與模型組比較差異明顯，具體結(jié)果見表1～2。

表1　各組大鼠耳紅、撓頭時(shí)間比較（±s，m in）

表1　各組大鼠耳紅、撓頭時(shí)間比較（±s，m in）

注：與模型組比較，*P＜0.05

組別動(dòng)物數(shù)耳紅開始時(shí)間耳紅結(jié)束時(shí)間撓頭開始時(shí)間撓頭結(jié)束時(shí)間模型組10 3.47±0.36 179.58±3.64 4.33±0.53 182.12±13.11尼美舒利組10 3.52±0.53 162.36±7.39*4.17±0.75 163.28±8.10*青藤堿低劑量組10 3.54±0.50 178.49±6.06 4.37±0.68 177.34±8.27青藤堿中劑量組10 3.50±0.92 177.08±3.99 4.47±0.52 176.16±2.43青藤堿高劑量組10 3.63±0.91 162.94±11.34*4.22±0.85 158.60±7.79*

表2　大鼠不同時(shí)間段撓頭次數(shù)的比較（±s，次數(shù)/30m in）

表2　大鼠不同時(shí)間段撓頭次數(shù)的比較（±s，次數(shù)/30m in）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

0～30 min 31～60 min 61～90 min 91～120 min 121～150 min 151～180 min對(duì)照組組別動(dòng)物數(shù)10 1.70±1.06 1.10±0.99 1.20±1.03 1.00±0.94 1.00±0.94 0.90±0.57模型組10 35.70±4.79*43.10±5.70*42.90±4.31*31.80±6.07*25.20±4.96*3.70±1.89*尼美舒利組10 24.00±5.98*#26.80±3.79*#27.00±3.37*#26.70±6.78*#14.90±2.99*#1.40±0.84*#正清風(fēng)痛寧低劑量組10 32.90±5.17*33.90±2.92*#34.10±2.33*#29.40±4.22*24.65±5.37*2.90±1.73*正清風(fēng)痛寧中劑量組10 30.00±2.94*#33.30±3.92*#32.90±3.57*#21.10±3.21*#16.3±4.03*#2.70±0.95*正清風(fēng)痛寧高劑量組10 26.37±5.09*#29.90±4.01*#31.30±3.65*#19.5±4.14*#15.50±1.58*#1.70±1.06*#

2.2免疫組化檢測(cè) 結(jié)果見表3及圖1。

表3　各組大鼠中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)區(qū)NF-κB與COX-2陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)結(jié)果

圖1顯示了各組大鼠中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)區(qū)NF-κB與COX-2陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)結(jié)果：模型組PAG區(qū)NF-κB、COX-2表達(dá)與對(duì)照組比較，明顯增多；尼美舒利組和青藤堿高劑量組（PAG）區(qū)NF-κB、COX-2表達(dá)與模型組比較，明顯減少；青藤堿高劑量組PAG區(qū)NF-κB、COX-2表達(dá)與尼美舒利組比較，無(wú)明顯差異。

3　討論

NF-κB是許多靶因的多效性轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于細(xì)胞胞漿中，習(xí)慣上NF-κB主要為p50/p65異源二聚體，參與不少同炎癥、免疫功能相關(guān)基因的調(diào)控。運(yùn)用電刺激上矢狀竇區(qū)硬腦膜復(fù)制的偏頭痛大鼠，在其PAG內(nèi)NF-κB蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)［2，6］。預(yù)防性予以含NF-κB抑制劑的龍牙草，已被證明，可使偏頭痛爆發(fā)頻率減少、減緩其癥狀［7］。COX-2被稱為“炎癥反應(yīng)基因”，并且是偏頭痛發(fā)作時(shí)的重要炎性介質(zhì)前列腺素（PG），尤其是前列腺素-E2（PGE2）合成的關(guān)鍵酶。研究還發(fā)現(xiàn)，環(huán)氧化酶（COX）抑制劑能緩解偏頭痛發(fā)作，現(xiàn)已被試用于偏頭痛的臨床治療［8］。COX-2的表達(dá)受NF-κB調(diào)控，NF-κB、COX-2是否與偏頭痛聯(lián)系密切，值得進(jìn)一步研究。

硝酸甘油偏頭痛大鼠模型能較好地模擬人類偏頭痛發(fā)病時(shí)的表現(xiàn)，其行為癥狀變化是能用于客觀且能量化評(píng)價(jià)偏頭痛治療藥物療效的合理指標(biāo)［5］，其造模的主要原理之一是硝酸甘油在機(jī)體內(nèi)通過(guò)一系列生理、生化反應(yīng)，從而介導(dǎo)神經(jīng)源性炎癥引發(fā)偏頭痛，所以還適于進(jìn)行神經(jīng)源性炎癥機(jī)制研究。無(wú)先兆偏頭痛是偏頭痛中最主要的類型，參照國(guó)際頭痛協(xié)會(huì)（2004年）制訂的無(wú)先兆偏頭痛診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中之一是至少發(fā)作5次，故本實(shí)驗(yàn)共造模5次。

圖1　各組大鼠中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)區(qū)NF-κB與COX-2表達(dá)

中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)（PAG）內(nèi)炎性因子（如核轉(zhuǎn)錄因子-κB、環(huán)氧化酶-2、白介素-1等）、神經(jīng)肽類，神經(jīng)遞質(zhì)（如5-羥色胺、一氧化氮等）、雌激素等及其相關(guān)受體的含量變化及其功能異常，?？墒筆AG的結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生紊亂，進(jìn)而影響了其對(duì)偏頭痛中樞疼痛的調(diào)控，在一定程度上可能促進(jìn)了偏頭痛的發(fā)作。

神經(jīng)源性炎癥機(jī)制是目前闡述偏頭痛病理機(jī)制學(xué)說(shuō)的主流。該學(xué)說(shuō)認(rèn)為NF-κB的激活是神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)中的主要內(nèi)容之一。靜息狀況時(shí)，NF-κB通常以非活化狀態(tài)存于胞漿中，遇到傷害性刺激后，NF-κB迅速轉(zhuǎn)位入胞核并結(jié)合特異性κB序列，進(jìn)而被激活，誘導(dǎo)調(diào)控炎癥反應(yīng)相關(guān)基因（如COX-2、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、iNOS等）產(chǎn)生與轉(zhuǎn)錄，繼而造成腦血管周圍組織的炎癥反應(yīng)，從而引發(fā)偏頭痛發(fā)作。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：硝酸甘油復(fù)制的偏頭痛模型大鼠PAG區(qū)NF-κB、COX-2表達(dá)相比于對(duì)照組明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示硝酸甘油誘發(fā)了模型組PAG區(qū)的炎癥反應(yīng)，促使了NF-κB神經(jīng)元的激活，進(jìn)而誘導(dǎo)了COX-2基因轉(zhuǎn)錄的大量增加，從而啟動(dòng)了神經(jīng)性炎癥反應(yīng)，同時(shí)也可導(dǎo)致PAG的功能紊亂，從而失去了對(duì)中樞疼痛的調(diào)控，由此引發(fā)了大鼠偏頭痛樣癥狀發(fā)作，同時(shí)也較好地驗(yàn)證神經(jīng)源性炎癥在偏頭痛中的作用。并同時(shí)觀察到在予以青藤堿、尼美舒利干預(yù)后，大鼠行為學(xué)改變與模型組相比，緩解明顯，且青藤堿高劑量組和尼美舒利組PAG區(qū)NF-κB、COX-2表達(dá)與模型組相比明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示兩者對(duì)NF-κB、COX-2的抑制效應(yīng)相當(dāng)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示正青藤堿與尼美舒利一樣，對(duì)治療偏頭痛有效，其作用機(jī)制可能與抑制PAG區(qū)神經(jīng)細(xì)胞NF-κB、COX-2表達(dá)有關(guān)。

尼美舒利是環(huán)氧化酶-2抑制劑，故本研究選取尼美舒利為陽(yáng)性對(duì)照組。同時(shí)其抗炎、鎮(zhèn)痛作用顯著，臨床上用尼美舒利治療偏頭痛療效也不錯(cuò)［9-10］。青藤堿（Sin）化學(xué)結(jié)構(gòu)與嗎啡類似，和腦的阿片受體或許有特殊的親和力，并可透過(guò)血腦屏障［11］；研究證實(shí)青藤堿在小鼠中腦分布濃度較在大腦和小腦的濃度升高顯著［12］；這些都是青藤堿具有中樞鎮(zhèn)痛作用的有力證據(jù)。其抗炎效應(yīng)與皮質(zhì)類激素氟美松相當(dāng)［13］，作用機(jī)理可能是干預(yù)了NF-κB激活通路，從而抑制炎癥局部前列腺素的合成或釋放［3］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示這兩者在緩解硝酸甘油誘發(fā)的偏頭痛大鼠的行為癥狀學(xué)方面效果明顯。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)顯示青藤堿能夠明顯緩解偏頭痛模型大鼠的行為癥狀學(xué)變化，因此推測(cè)可能對(duì)偏頭痛治療有效。前期研究表明：青藤堿可下調(diào)偏頭痛模型大鼠腦干炎性因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的表達(dá)，抑制c-fos、c-jun基因表達(dá)及5-HT能系統(tǒng)的激活［14-16］，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在偏頭痛模型大鼠PAG區(qū)NF-κB、COX-2表達(dá)增高，用一定劑量的青藤堿干預(yù)偏頭痛大鼠其行為癥狀學(xué)變化有較好的改善作用，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制腦干PAG區(qū)神經(jīng)NF-κB、COX-2的表達(dá)，下調(diào)炎癥因子（IL-1β、TNF）的釋放［17］，從而抑制了神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)，而達(dá)到緩解行為癥狀學(xué)的作用，以達(dá)到止痛目的。由此推測(cè)青藤堿對(duì)偏頭痛治療有一定的療效，到底有沒有效，還需要大樣本的臨床觀察才能定論。

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R285.5

B

1001-1528（2015）03-0678-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.051

2014-01-18

遵義市科技局基金（201133）

易桂標(biāo)（1984—），男，碩士生，主要從事神經(jīng)病學(xué)研究。Tel：15200203825，E-mail：451241950@qq.com

楊 麗（1957—），女，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事偏頭痛及腦血管疾病研究。Tel：（0852）28608747，E-mail：yangli1668@126.com