Box-Behnken設計-效應面法優(yōu)化微波輔助提取廢次煙葉中煙堿的工藝研究

黃 飛， 張 哲， 魏先文， 陳國平， 楊富功， 楊可可

（1.黃山學院化學化工學院，安徽　黃山　245041；2.安徽工業(yè)大學化學與化工學院，安徽　馬鞍山　243002）

Box-Behnken設計-效應面法優(yōu)化微波輔助提取廢次煙葉中煙堿的工藝研究

黃 飛1， 張 哲1， 魏先文2， 陳國平1， 楊富功1， 楊可可1

（1.黃山學院化學化工學院，安徽黃山245041；2.安徽工業(yè)大學化學與化工學院，安徽馬鞍山243002）

目的 Box-Behnken設計-效應面法優(yōu)化微波輔助提取煙葉中煙堿工藝。方法 以煙堿的提取率為評價指標，考察浸泡時間、固液比、微波功率、微波輻射時間4個因素對煙堿提取率的影響，采用Box-Behnken設計-效應面法優(yōu)化微波輔助提取工藝，并進行預測分析。結果 浸泡時間、微波輻射時間、固液比、微波功率對煙堿的提取率具極顯著影響，確定微波輔助提取煙堿的最優(yōu)提取工藝為：浸泡時間為6 h，微波輻射時間7 min，固液比為0.1，微波功率為800W。結論 Box-Behnken設計-效應面法優(yōu)化微波輔助提取煙葉中煙堿工藝，建立的數(shù)學模型和實驗觀察數(shù)據(jù)相符，該提取工藝合理，精確度高，可預測性好。

Box-Behnken設計-效應面法；微波輔助；廢次煙葉；煙堿；提取

煙堿又稱尼古?。╪icotine，Nic），是煙草的主要成分之一。一般人們認為煙堿是煙葉中的主要毒性物質(zhì)，其實這是一種誤解。流行病學研究報告表明，煙堿可以有效清除活性氧自由基，能夠抑制多巴胺自氧化，可以降低老年癡呆癥和帕金森氏綜合癥的發(fā)病率［1-2］，能治療精神分裂癥、抑郁癥等，對婦女子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌等雌激素依賴性疾病有較好的療效［3］。煙堿還可以用于戒煙，提高戒煙的成功率，避免吸煙產(chǎn)生的有害物質(zhì)對身體的毒害［4-5］。

目前從煙葉中提取煙堿的常見方法有水蒸氣蒸餾法［6］、連續(xù)逆流提取法［7］、溶劑萃取法［8］、超臨界萃取法［9］、離子交換法［10］、超聲輔助酶法［11］等。以上方法設備成本、技術要求較高，萃取過程中可能有新的組分產(chǎn)生等缺點。微波輔助提取可以顯著加速傳質(zhì)過程，提高提取效率，容易實現(xiàn)工業(yè)化應用［12］。與傳統(tǒng)的提取方式相比較，具有明顯的優(yōu)勢。微波輔助提取大多是采用正交設計實驗對煙堿提取工藝進行考察［11，13-14］，考慮正交設計的局限性，本研究以廢次煙草為原料，通過Box-Behnken設計-效應面法優(yōu)化微波輔助提取廢次煙葉中煙堿的工藝，獲得了優(yōu)化的微波提取工藝條件，該方法尚未見報道。

1　儀器與試劑

1.1儀器 UV-2100紫外可見分光光度計（北京北分瑞利分析儀器有限責任公司）；NMS72SF型微波爐（上海微波爐有限公司）；FZ102型微量植物粉碎機（上海申光儀器儀表有限公司）；BT25S電子天平（賽多利斯）。

1.2試劑 廢次煙葉（Nicotiana tabacum L.，購自黃山市煙草收購站，批號20130824，經(jīng)黃山學院化學化工學院制藥工程教研室柯仲成鑒定為茄科煙草）；99%煙堿對照品（購于西安云芝生物科技有限責任公司，批號20130312），甲基橙、三氯甲烷、乙醇、檸檬酸磷酸氫二鈉緩沖溶液均為分析純（中國國藥化學試劑有限公司）。

2　方法與結果

2.1煙堿標準曲線的繪制 吸取煙堿標準液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL，分別注入60 mL分液漏斗中，加入檸檬酸磷酸氫二鈉緩沖溶液2 mL、甲基橙溶液2 mL，混合均勻后加入三氯甲烷5 mL，萃取2 min，靜置分層，取三氯甲烷層加入1 cm比色皿中，測其波長420 nm處的吸光度。以吸光度為縱坐標，煙堿濃度為橫坐標作圖，繪制標準曲線，作出回歸方程y=-0.022 42+5.462 35x，相關系數(shù)為r=0.997 7［15］。

2.2提取液中煙堿的測定 取10.00 g廢次煙葉，用微型植物粉碎機粉碎，以一定的固液比加入乙醇，浸泡一定時間后，以一定功率的微波處理一定時間，冷卻后于3 500 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 min，取上清液1 mL，加入2 mL檸檬酸磷酸氫二鈉緩沖液和2 mL飽和的甲基橙溶液，搖勻后加入5 mL三氯甲烷，震蕩2.5 min，靜置分層。取三氯甲烷層加入1 cm比色皿中，測其420 nm處吸光度［13，16］。根據(jù)測得的吸光度，用回歸方程計算出對應的濃度，計算煙堿提取率。

2.3Box-Behnken設計-效應面法優(yōu)化微波提取工藝條件

2.3.1試驗設計與結果 根據(jù)預試驗結果，煙堿微波輔助提取較為顯著的影響因素有浸泡時間、微波輻射時間、固液比、微波功率和提取次數(shù)等?？紤]到提取次數(shù)為非連續(xù)變量因素，回歸方程處理較為復雜，故根據(jù)實際情況，將其固定為1次。根據(jù)星點設計的研究思路和Box-Behnken的中心組合試驗設計原理，對各因素進行3水平試驗設計，用代碼值-1、0、1來表示。代碼值所代表的實際值見表1，試驗設計與結果見表2。

表1　Box-Behnken試驗因素與水平

表2　Box-Behnken試驗設計與結果

多元線性回歸：Y=87.67+2.50X1+4.24X2+1.99X3+ 5.56X4（r2=0.831 7）

由表3回歸方程的方差分析結果可知，在本實驗設定的區(qū)域范圍內(nèi)，浸泡時間、微波輻射時間、固液比、微波功率對煙堿的提取率有極顯著的影響，浸泡時間和固液比、固液比和微波功率的相互作用具有非常顯著影響，浸泡時間和微波輻射時間的相互作用具有顯著影響。浸泡時間和微波功率、微波輻射時間和固液比、微波輻射時間和微波功率的相互作用沒有顯著影響?；貧w方程失擬檢驗不顯著，說明其他未知因素對該試驗干擾比較小。擬合檢驗極顯著，說明該二項式方程與實際提取情況擬合很好，較好地反映了煙堿提取率和浸泡時間、微波輻射時間、固液比、微波功率的關系。因此，該二項式方程較好地描述了煙堿提取率隨各個因素的變化規(guī)律，具有良好的預測指導性［17-21］。

表3　回歸方程的方差分析

2.3.3效應面優(yōu)化和預測 根據(jù)二次多項式數(shù)學模型，應用Design-Expert8.0.6軟件，繪制考察指標與影響較顯著的兩個自變量的三維效應曲面圖及等高線圖，如圖1所示。利用回歸模型進行分析，預測煙堿的提取率最大值為98.43%，最優(yōu)提取工藝條件為：浸泡時間為6 h，微波輻射時間7 min，固液比為0.1，微波功率為800W。

2.3.4驗證試驗 根據(jù)預測得出的最優(yōu)提取工藝條件，平行進行3次驗證試驗，煙堿的提取率分別為97.23%、96.58%、97.35%，平均值為97.05%，RSD為1.5%，偏差率=（97.05%-98.43%）/98.43%=-1.40%，表明所建立的數(shù)學模型具有準確的預測性，所選工藝條件具有較好重復性。

3　討論

在多數(shù)的情況下，各因素對效應的影響并非是線性的，國內(nèi)一般采用正交試驗設計和均勻試驗設計優(yōu)化工藝、篩選處方，即用線性數(shù)學模型進行擬合，雖然試驗次數(shù)較少，但是精確度較低，預測性較差。選擇適合于非線性擬合的實驗設計方法，可以提高優(yōu)化效果，Box-Behnken設計-效應面法就是一種較為成熟的方法。本實驗采用這種方法，可以評價指標和因素間的非線性關系，充分考慮了各因素之間的交互作用，提高了實驗準確性和預測性，已被較多地應用于化學合成過程、生物過程等優(yōu)化，具有較好的應用價值前景。

圖1　各因素對響應值影響的三維效應曲面圖和二維等高線圖

效應面優(yōu)化法在藥物制劑中應用較為廣泛［22-25］，但還沒有很好地應用于現(xiàn)代中草藥行業(yè)中。本研究采用Box-Behnken設計-效應面法對微波輔助提取煙堿的工藝進行了優(yōu)化，并進行驗證試驗，為其進一步開發(fā)應用提供了科學合理的理論和實驗依據(jù)。

［1］ 趙保路.尼古丁預防帕金森氏綜合癥和老年癡呆癥的分子機理研究［J］.生物物理學報，2007，23（2）：81-91.

［2］ 謝渝湘，劉 強，張 杰，等.煙堿預防帕金森氏綜合癥和老年癡呆癥的分子機理［J］.中國煙草學報，2006，12（4）：25-30.

［3］ 魏榮寶.煙草植物在有機醫(yī)藥和農(nóng)藥中的應用［J］.化學教育，2009，30（7）：1-4.

［4］ 黃 琳，殷 彤，董振香.戒煙新藥尼古丁透皮貼劑的臨床應用和評價［J］.中國新藥雜志，2009，18（20）：1926-1929，1934.

［5］ 徐光奇，吳金虎.尼古丁透皮貼片和戒煙作用［J］.中國藥學雜志，1997，32（5）：268-270.

［6］ 衛(wèi) 青，劉維涓，蔡 卿，等.煙堿蒸餾簡易裝置及實驗條件研究［J］.云南化工，2004，31（2）：47-50.

［7］ 韓 麗，謝秀瓊，楊 明，等.丹參動態(tài)階段連續(xù)逆流提取工藝研究［J］.中成藥，2009，31（5）：721-724.

［8］ 黃蘭芳，胡 偉，謝建偉，等.加速溶劑萃取法提取煙葉揮發(fā)性成分條件的優(yōu)化［J］.光譜實驗室，2010，27（4）：1406-1410.

［9］ Alagic S，Stanic I.Chemical composition of the supercritical CO2extracts of the Yaka，Peilep and otlja tobaccos［J］.JEssent Oil Res，2006，18（8）：185-188.

［10］ 明寧寧，郭俊成，劉 強，等.煙草中生物堿的提取和分析方法研究進展［J］.中國煙草學報，2003，13（3）：64-69.

［11］ 朱 松，婁在祥，陳尚衛(wèi)，等.超聲輔助酶法提取廢次煙葉中綠原酸、煙堿工藝研究［J］.食品工業(yè)科技，2012，33（5）：181-184.

［12］ Zhang B，Yang R，Liu C Z.Microwave-assisted extraction of chlorogenic acid from flower buds of Lonicera japonica Thunb［J］.Separat Purifi Technol，2008，62（2）：480-483.

［13］ 王亞紅，王亞麗，曲小姝.廢次煙葉中煙堿微波提取工藝研究［J］.河北化工，2010，33（7）：19-21.

［14］ 梁柏林，張 娜.低次煙葉超聲波提取煙堿工藝及數(shù)學模擬［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2007，35（21）：6457-6458.

［15］ 張立杰.煙堿的快速分析［J］.湖南化工，1999，29（3）：43-44.

［16］ Leslie D，Millen C，Raymond Murphy W.Countercurrent extraction of nicotine from tobacco juice［J］.Industrial and Engineering Chemistry Research，1993，32（12）：3056-3060.

［17］ 柯仲成，程子洋，陳 龍.Box-Behnken效應面法優(yōu)化貫葉金絲桃中金絲桃苷的提取工藝［J］.中成藥，2012，34（10）：2023-2025.

［18］ 田寶成，賈昌平，楊軍濤.Box-Behnken效應面法優(yōu)化紅旱蓮總黃酮提取工藝的研究［J］.中成藥，2010，32（3）：389-392.

［19］ 邱 遠，芮 昕，謝翌冬.響應面法優(yōu)化超聲提取葛根素工藝［J］.食品科學，2014，35（6）：1-5.

［20］ 沈成英，王 冶，徐 和.Box-Behnken設計-效應面法優(yōu)化波棱甲素新型納米混懸速溶膜［J］.中草藥，2014，45（1）：37-41.

［21］ 董迪迪，王鴻飛，周增群.響應面法優(yōu)化超臨界CO2萃取楊梅籽油工藝條件的研究［J］.中國糧油學報，2014，29（2）：30-35.

［22］ 林小玲，田成旺，張鐵軍.星點設計-效應面法優(yōu)選參芪消巖顆粒滲漉提取工藝［J］.中草藥，2013，44（4）：430-433.

［23］ 張洪兵，朱雪瑜，張鐵軍.星點設計-效應面優(yōu)化法優(yōu)選復方止痛巴布劑基質(zhì)處方［J］.中草藥，2013，44（8）：985-988.

［24］ 邢建國，王新春，張永軍，等.正交實驗聯(lián)用星點設計-效應面法優(yōu)化紫草素脂質(zhì)體處方［J］.中成藥，2010，32（3）：392-395.

［25］ 葉 蕾，胡容峰，王曉華，等.星點設計-效應面法優(yōu)化葛根素自微乳工藝［J］.中成藥，2014，36（3）：514-519.

R284.2

B

1001-1528（2015）03-0670-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.049

2014-05-09

國家自然科學基金項目（21271006）；安徽省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練項目（AH201310375027）；安徽省優(yōu)秀青年人才基金重點項目（2013SQRL088ZD）；黃山學院自然科學研究項目（2012xkj006）

黃 飛（1983—），男，碩士，助教，主要從事藥物新劑型與新技術研究。Tel：（0559）2546625， E-mail：huangfei@hsu. edu.cn