基于抗氧化活性的丹參藥品質(zhì)量評(píng)價(jià)研究

賈 巧， 陳 華， 趙榮華， 任小姍， 夏之寧

（重慶大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶　400044）

基于抗氧化活性的丹參藥品質(zhì)量評(píng)價(jià)研究

賈 巧， 陳 華*， 趙榮華， 任小姍， 夏之寧

（重慶大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶400044）

目的 提出從抗氧化能力評(píng)價(jià)藥物質(zhì)量的新觀點(diǎn)。方法 采用Luminol-Fe2+-H2O2流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光體系評(píng)價(jià)了3種抗氧化劑單體和8種丹參藥品的抗氧化能力，以藥物對(duì)羥自由基的清除率對(duì)濃度作多項(xiàng)式四階擬合，由擬合方程計(jì)算出各自IC50值，以IC50值表示自由基清除能力，從而直接反應(yīng)8種丹參藥品的抗氧化能力。結(jié)果 該方法有較好的穩(wěn)定性和精密度，峰面積的RSD分別為2.3%和3.2%?？寡趸瘑误w和丹參各種藥品都表現(xiàn)為低濃度下羥自由基清除率與濃度成正比，高濃度則不然。結(jié)論 該方法簡(jiǎn)單，高效，重復(fù)性好，穩(wěn)定性高。可推廣應(yīng)用于各抗氧化型藥物的質(zhì)量的實(shí)際療效的初步評(píng)價(jià)。

抗氧化能力；質(zhì)量評(píng)價(jià)；丹參藥品；羥自由基；化學(xué)發(fā)光

氧自由基是生物體新陳代謝的中間產(chǎn)物［1］，活性比分子態(tài)氧高很多［2］。正常情況下，體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除是平衡的，但當(dāng)生物體長(zhǎng)期處于各種脅迫狀態(tài)下，氧自由基產(chǎn)生過多或抗氧化體系出現(xiàn)故障，體內(nèi)氧自由基代謝出現(xiàn)失衡［3］，過多的活性氧可以引發(fā)膜脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)的損傷、嘌呤氧化、堿基突變、DNA鏈的斷裂和突變［4］等，繼而引起細(xì)胞凋亡、組織壞死甚至機(jī)體死亡［5］。目前已證實(shí)與自由基相關(guān)的疾病有炎癥、心血管疾病、衰老［6］、帕金森氏病［7］、腫瘤、缺血性疾病、中毒和放射性疾?。?］等。

丹參是治療心腦血管疾病的傳統(tǒng)中藥材，其治療心腦血管疾病的作用與其含抗氧化活性成分有關(guān)，主要是通過清除已產(chǎn)生的自由基和阻斷自由基鏈反應(yīng)從而保護(hù)心臟免受傷害［9］。大量研究表明丹參在多方面具有較強(qiáng)的抗氧化活性，在治療活性氧誘發(fā)的心腦血管疾病方面具有顯著的療效［10］。

傳統(tǒng)的藥物質(zhì)量的好壞是采用其中所含的某一種或某一類有效成分的多少進(jìn)行評(píng)價(jià)的［11］，該方法的缺點(diǎn)是與藥物的實(shí)際治療效果脫節(jié)。藥物療效與藥效成分含有量固然有關(guān)，但不一定是正相關(guān)，含有量高不一定療效就好，有時(shí)還會(huì)出現(xiàn)相反的情況。丹參藥物在治療心腦血管疾病，發(fā)揮療效的過程中受多方面因素的影響，最根本的因素還是與藥物本身清除致病因子或修復(fù)損傷的能力有關(guān)［12］。丹參藥物對(duì)氧自由基的清除能力能直接反應(yīng)對(duì)心腦血管疾病的治療效果。本實(shí)驗(yàn)欲從其抗氧化能力方面對(duì)系列丹參藥品的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，建立抗氧化型藥物質(zhì)量評(píng)價(jià)的新方法和新思路。

1　儀器與試藥

1.1儀器 IFFM-E型流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析儀（西安瑞邁分析儀器有限公司）；KQ-100型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TGC-16B高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；DELTA 320 pH計(jì)（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.2藥品與試劑 Luminol、兒茶素、丹參素鈉、綠原酸、楊梅素，均為Sigma公司產(chǎn)品（純度≧98%），無水乙醇、過氧化氫、FeSO4·7H2O、Na2CO3、NaHCO3均為國(guó)產(chǎn)分析純，實(shí)驗(yàn)用水都為去離子水。8種丹參藥品采購(gòu)自重慶市某藥店，廠家和生產(chǎn)批次信息列于表1。

表1　丹參系列藥物信息

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1化學(xué)發(fā)光檢測(cè)條件 光電倍增管負(fù)高壓600 V，增益為1，管路內(nèi)徑0.8 mm，主副泵轉(zhuǎn)速40 r/min相當(dāng)于2.27 mL/min的體積流量，采樣時(shí)間1 s。

2.2溶液配制 0.025 mmol/L的Luminol用0.1 mol/L碳酸鹽緩沖溶液（pH 10.50）配制；0.048%的H2O2用去離子水配制；10 mmol/L Fe2+，加入少量鐵粉和稀硫酸，臨用時(shí)用去離子水稀釋到0.02 mmol/L。

2.3樣品前處理 準(zhǔn)確稱取丹參藥品0.5 g，用50%乙醇溶解，超聲30 min后放置室溫后定容到50 mL量瓶。將樣品溶液在5 000 r/min下高速離心10min取上清液作樣品待測(cè)溶液。

將藥物溶液稀釋成一系列濃度，分別測(cè)定其·OH清除率，把清除率對(duì)濃度作非線性回歸擬合，得到兩者的量效關(guān)系，求出當(dāng)清除率為50%時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度，即為各自的IC50值。IC50越小說明其抗氧化能力越強(qiáng)。

3　結(jié)果與討論

3.1流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法參數(shù)優(yōu)化

3.1.1流路的選擇 考察了兩種流路對(duì)抗氧化劑抗氧化能力評(píng)價(jià)的影響（圖1）。流路A可從譜圖上直接反應(yīng)出抗氧化劑清除·OH的程度，但溶劑空白亦可使發(fā)光降低50%左右，會(huì)掩蓋抗氧化劑的信號(hào)峰，使抗氧化劑的自由基清除率為負(fù)值，表觀顯示為促氧化作用，與實(shí)際相矛盾。Katerina等［14］對(duì)此現(xiàn)象進(jìn)行了系統(tǒng)研究，但未能解決溶劑倒峰的現(xiàn)象。流路B則可避免這種現(xiàn)象，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇流路B的混合模式。

圖1　化學(xué)發(fā)光流路圖

3.1.2Luminol濃度的選擇 用單因素變量法，考察了Luminol濃度在0.001～0.030 mmol/L之間對(duì)發(fā)光強(qiáng)度、峰形、峰面積的影響。結(jié)果顯示發(fā)光強(qiáng)度隨濃度的增大而增大，但噪聲亦同時(shí)增大，發(fā)光試劑殘留也增多，峰對(duì)稱性也變差。綜合考慮各種因素，最終確定Luminol濃度為0.025 mmol/L。

3.1.3H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)的選擇 同樣又考察了H2O2在0.030%～0.060%之間的發(fā)光情況。結(jié)果顯示隨H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，發(fā)光強(qiáng)度先增加后減小，在H2O2為0.048%時(shí)峰形好，峰面積最大，且噪聲也小。因此選擇H2O2的使用液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.048%。

3.1.4Fe2+濃度的選擇 Fe2+是Fenten反應(yīng)中的催化劑，一般催化劑具有用量少，高效率的特點(diǎn)。但Fe2+在堿性條件下不能穩(wěn)定存在，容易被水中溶解氧化生成氫氧化鐵紅色沉淀，附著在管道內(nèi)壁，堵塞管道。因而鐵濃度不能過高?？疾炝藵舛仍?.020～0.100 mmol/L之間的Fe2+對(duì)發(fā)光情況的影響。結(jié)果顯示Fe2+濃度對(duì)發(fā)光強(qiáng)度影響很小，因此本實(shí)驗(yàn)選用0.02 mmol/L Fe2+作為使用液。

3.1.5pH的選擇 Luminol須在堿性條件下發(fā)光，但Fe2+在堿性條件下不穩(wěn)定，因此考察了不同pH緩沖溶液的發(fā)光情況。結(jié)果發(fā)光強(qiáng)度隨著pH的增大先增大后減小。在pH為10.50時(shí)達(dá)到最大值，故本實(shí)驗(yàn)選用緩沖溶液pH 10.50。

3.1.6體積流量的選擇 實(shí)驗(yàn)考察了泵轉(zhuǎn)速在10～70 r/min相當(dāng)于體積流量0.57～3.99 mL/min下的化學(xué)發(fā)光情況。結(jié)果顯示：低體積流量時(shí)由于縱向擴(kuò)散導(dǎo)致峰展寬。高體積流量下反應(yīng)量加大，峰高增高，峰形變好，如圖2。但反應(yīng)體系流過檢測(cè)窗口的速度過快，反應(yīng)不充分，在發(fā)光強(qiáng)度還未達(dá)到峰值時(shí)，液流已經(jīng)流過檢測(cè)窗，因而峰寬變窄，峰面積減小。綜合考慮峰形、峰寬、峰面積，本實(shí)驗(yàn)選擇主副泵同步轉(zhuǎn)速40 r/min，體積流量為2.28 mL/min。

圖2　不同體積流量的化學(xué)發(fā)光動(dòng)力學(xué)曲線

3.1.7穩(wěn)定性試驗(yàn)和精密度試驗(yàn) 在選定最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件和最佳儀器參數(shù)后對(duì)發(fā)光體系的穩(wěn)定性進(jìn)行了考察。每隔2 h測(cè)定1次，共測(cè)定1 d內(nèi)5個(gè)時(shí)間段內(nèi)的空白發(fā)光強(qiáng)度，每次平行測(cè)5次。計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，峰高的RSD為1.5%，峰面積的RSD為2.3%，結(jié)果表明在1 d內(nèi)該發(fā)光體系穩(wěn)定。為了考察所建立體系的重復(fù)性，重復(fù)11次測(cè)定空白發(fā)光強(qiáng)度，計(jì)算其峰高、峰面積的RSD分別為3.4%和3.2%。結(jié)果表明測(cè)量結(jié)果的重復(fù)性良好。

3.2抗氧化劑單體的抗氧化能力評(píng)價(jià) 為考察方法測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，實(shí)驗(yàn)選擇了丹參素鈉、兒茶素、綠原酸3種抗氧化劑單體的不同質(zhì)量濃度對(duì)·OH的清除作用，以清除率y對(duì)質(zhì)量濃度x作多項(xiàng)式4階擬合，結(jié)果如表2所示。

表2　抗氧化劑單體的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合

結(jié)果表明，抗氧化劑的抗氧化能力與其含有量并非呈正比。根據(jù)擬合曲線，計(jì)算獲得了各自的IC50值，IC50值越小表示其抗氧化能力越強(qiáng)，3種抗氧化劑的抗氧化能力大小依次為兒茶素＞丹參素鈉＞綠原酸。酚類化合物抗氧化活性大小通常與分子中羥基的個(gè)數(shù)和位置相關(guān)。尤其是苯環(huán)上的羥基，由于氧的電子與芳香環(huán)電子共軛的影響，對(duì)氫離子的束縛能力減弱，相對(duì)容易給出氫離子自身被氧化成醌而具有較強(qiáng)的還原性，而脂肪鏈上的羥基則被氧化為醛、酮或羧酸。此外，分子內(nèi)氫鍵越多，抗氧化活性越強(qiáng)［15］，試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果與理論相吻合，說明該方法測(cè)定結(jié)果可靠，可應(yīng)用于后續(xù)試驗(yàn)研究。

3.3丹參藥品的抗氧化能力評(píng)價(jià)

3.3.1樣品清除率比較 分別取各樣品溶液用50%乙醇稀釋50倍后成200 mg/L的質(zhì)量濃度，以50%乙醇做空白對(duì)照，按照“3.1”項(xiàng)所示的方法測(cè)定清除率。測(cè)定結(jié)果如表3所示。

表3　高質(zhì)量濃度（200 mg/L）下各丹參藥品的自由基清除率比較（%）

從表3可以看出8種丹參藥物在質(zhì)量濃度為200 mg/L時(shí)都具有較高的羥自由基清除率，其中6#樣品清除率達(dá)到99%，其清除率大小依次為6#＞7#＞3#＞8#＞1#＞2#＞4#＞5#。

3.3.2樣品IC50比較 根據(jù)藥物清除率能力差異選擇不同質(zhì)量濃度范圍對(duì)樣品進(jìn)行稀釋，測(cè)定各自清除率，清除率對(duì)質(zhì)量濃度的擬合方程如表4所示。計(jì)算各自IC50值亦如表4所示，IC50大小依次為3#＜6#＜1#＜2#＜7#＜8#＜4#＜5#，即抗氧化能力順序?yàn)?#＞6#＞1#＞2#＞7#＞8#＞4#＞5#。

表4　丹參藥物清除率y-質(zhì)量濃度x曲線擬合和IC50值

樣品的清除率排序與抗氧化能力排序差別的原因正是因?yàn)楦哔|(zhì)量濃度下抗氧化劑抗氧化能力與質(zhì)量濃度之間不呈正比關(guān)系。而對(duì)于一個(gè)確定的體系而言，IC50值是一個(gè)定值，與抗氧化劑的質(zhì)量濃度無關(guān)。因此建議此類型實(shí)驗(yàn)都采用IC50值來表示抗氧化能力大小。

4　結(jié)論

建立了評(píng)價(jià)丹參藥品抗氧化能力的流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法，對(duì)該發(fā)光體系進(jìn)行各種參數(shù)優(yōu)化，考察了方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。該方法簡(jiǎn)單、高效、快速、精密度高、穩(wěn)定性好。將該方法應(yīng)用于3種抗氧化劑單體和8種丹參藥品的抗氧化能力評(píng)價(jià)，結(jié)果表明低質(zhì)量濃度下抗氧化劑的自由基清除率與質(zhì)量濃度成正比，高質(zhì)量濃度則不然。把清除率對(duì)質(zhì)量濃度作多項(xiàng)式4階擬合時(shí)，曲線擬合度良好。3種抗氧劑的抗氧化能力大小依次為兒茶素＞丹參素鈉＞綠原酸。8種丹參藥物的抗氧化能力大小依次為3#＞6#＞1#＞2#＞7#＞8#＞4#＞5#。

化學(xué)發(fā)光法最大優(yōu)點(diǎn)是不需要光源，操作成本低，適合于抗氧化型藥物的抗氧化能力效果的總體評(píng)價(jià)。

［1］ Finkel T，Holbrook N J.Oxidants，oxidative stress and the biology of aging［J］.Nature，2004，408（9）：239-247.

［2］ Gillepie K M，Chae JM，Ainsworth E A.Rapid measurement of total antioxidant capacity in plants［J］.Nature Protoc，2007，2（4）：867-870.

［3］ 邱松山，呂曉玲，李 平，等.流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析研究油茶總皂苷清除活性氧能力［J］.天津科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，21（1）：25-28.

［4］ 王紅濤，趙玉珉.水分脅迫對(duì)植物活性氧代謝的影響［J］.通化師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，32（2）：52-54.

［5］ 李 勇，孔令青，高 洪.自由基與疾病研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008，29（4）：85-88.

［6］ Zuo L，Motherwell M S.The impact of reactive oxygen species and genetic mitochondrialmutations in Parkinson's disease［J］. Gene，2013，532（1）：18-23.

［7］ Sanyal J，Sarkar B，Banerjee T K，etal.Peripheralmarkers for oxidative stress in Parkinson's disease patients of Eastern India［J］.Neurochem J，2011，5（2）：146-149.

［8］ 趙保路.氧自由基和天然抗氧化劑［M］.北京：科學(xué)出版社，1999：91.

［9］ 陽志云，劉 崢.天然藥物中的抗氧化成分及評(píng)價(jià)方法的研究進(jìn)展［J］.華夏醫(yī)藥，2005，18（3）：492-494.

［10］ 浦錫娟，徐凱琳.丹參藥理作用研究進(jìn)展［J］.臨床醫(yī)學(xué)工程，2009，16（8）：154-155.

［11］ 吳宏偉，唐力英，楊洪軍，等.基于抗氧化活性的丹參藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2009，15（10）：3-5.

［12］ 王 鵬，趙啟韜，郭 慶，等.丹參活性成分保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞研究進(jìn)展［J］.山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，35（2）：184-186.

［13］ 鄧乾春，陳春艷，田斌強(qiáng)，等.化學(xué)發(fā)光法測(cè)定白果白蛋白的體外抗氧化活性［J］.中草藥，2007，38（5）：685-690.

［14］ Minioti K S，Georgiou C A.High thoughput flow injection bioluminometric methold for olive oil antioxidant capacity［J］. Food Chem，2008，109（2）：455-461.

［15］ 齊婧敏，張 鑫，呂慶章.黑沙蒿中4種黃酮類化合物抗氧化活性的DFT研究［J］.計(jì)算機(jī)與應(yīng)用化學(xué)，2013，30（3）：267-272.

R285.5

B

1001-1528（2015）03-0667-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.048

2014-01-09

國(guó)家自然科學(xué)基金（21005092）；科技部國(guó)際合作計(jì)劃項(xiàng)目（2010DFA32680）

賈 巧（1988—），女，碩士，從事天然產(chǎn)物活性成分篩選。Tel：18227678557，E-mail：missjia880519@163.com

陳 華 Tel：（023）65106615，E-mail：chenhuacqu@aliyun.com