富硒芪云水提物對S180荷瘤小鼠腫瘤微環(huán)境影響的實驗研究

高華武， 田麗娜， 龍子江*， 劉金林， 任振興， 陸松俠

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽　合肥　230038；2.安慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，安徽　安慶　246052）

［科研報道］

富硒芪云水提物對S180荷瘤小鼠腫瘤微環(huán)境影響的實驗研究

高華武1， 田麗娜1， 龍子江1*， 劉金林2， 任振興1， 陸松俠1

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽合肥230038；2.安慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，安徽安慶246052）

目的 研究富硒芪云水提物對S180荷瘤小鼠抗腫瘤作用及腫瘤微環(huán)境的影響。方法 S180荷瘤模型小鼠隨機(jī)分為模型組，環(huán)磷酰胺陽性對照組（60 mg/kg），黃芪組（3.9 g/kg），紫云英組（3.9 g/kg），富硒芪云水提物低（1.95 g/kg）、中（3.9 g/kg）、高（7.8 g/kg）劑量組，另取正常小鼠為正常對照組。連續(xù)灌胃給藥，持續(xù)治療10 d后，第11天剝?nèi)×鼋M織稱定質(zhì)量，計算抑瘤率。取血檢測各組荷瘤小鼠血清硒結(jié)合蛋白1（SBP1）、谷胱甘肽過氧化物酶1（GPX l）、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、活性氧（ROS）。結(jié)果 富硒芪云水提物1.95、3.9、7.8 g/kg抑瘤率分別為13.64%、44.92%、38.70%；富硒芪云水提物各劑量組能明顯增加血清SBP1蛋白表達(dá)，提高GPX 1活性，提高AMPK水平、減少ROS含有量（P＜0.05），與模型組比較，1.95 g/kg、3.9 g/kg劑量組有顯著性差異（P＜0.05）；與黃芪組比較，3.9 g/kg劑量組有顯著性差異（P＜0.05）。結(jié)論 富硒芪云水提物能抑制S180腫瘤細(xì)胞的增長，其機(jī)制可能為升高腫瘤細(xì)胞中硒水平，影響腫瘤微環(huán)境而發(fā)揮抗腫瘤作用。

富硒芪云水提物；荷瘤小鼠；氧化；硒；微環(huán)境

中藥黃芪為扶正益氣中藥，具有補(bǔ)氣固表，利尿托毒，排膿，斂瘡生肌等功效，臨床常用于抗腫瘤［1］。紫云英，又名紅花草，營養(yǎng)價值豐富，《全國中草藥匯編》指出紫云英具有解毒止痛、清除邪毒之功效，配伍黃芪用于抗腫瘤研究，應(yīng)證中醫(yī)“扶正祛邪”理論［2］。流行病學(xué)研究表明許多癌癥都與硒的攝入不足有關(guān)［3］，硒日補(bǔ)充劑量在200～400μg能降低癌癥發(fā)生率［4］，我國傳統(tǒng)中藥富含天然有機(jī)硒，應(yīng)用于抗腫瘤具有獨(dú)特優(yōu)勢。研究顯示黃芪、紫云英為硒富集中藥［5-6］。本課題組前期采用ICP-MS檢測發(fā)現(xiàn)，黃芪紫云英配伍水提物含硒量可高達(dá)9.346μg/g，以黃芪臨床日用量30 g計算，黃芪紫云英配伍水提物含硒量為280.36μg/g，遠(yuǎn)高于《食品中硒限量標(biāo)準(zhǔn)》、《食品安全法》和《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)管理辦法》等國家標(biāo)準(zhǔn)（規(guī)定指出，動植物產(chǎn)品含硒量達(dá)50～200μg/g為富硒產(chǎn)品）［7］。

綜合黃芪紫云英扶正祛邪以及富硒特性，本實驗研究富硒芪云水提物對S180荷瘤小鼠的抑制作用和對血清SBP1、GPX 1、AMPK和ROS的影響，探討其對腫瘤細(xì)胞微環(huán)境的影響，為富硒芪云水提物對S180荷瘤小鼠的抑瘤作用及機(jī)制提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1動物與瘤株 SPF級昆明種小鼠，雌雄各半，20～25 g，安徽省實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（皖）2005-001。S180鼠源性肉瘤細(xì)胞，南京中醫(yī)藥大學(xué)陸茵老師惠贈，本室傳代保種。

1.2主要試劑及儀器 黃芪，產(chǎn)地內(nèi)蒙古，由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供；紫云英，產(chǎn)地安徽，由藥用美譽(yù)有限公司提供；注射用環(huán)磷酰胺，批號2J679A，由Baxrer Oncology GmbH公司提供。SBP1試劑盒（批號E-20634）、GPX 1試劑盒（批號E-20729）、AMPK試劑盒（批號E-26041）、ROS試劑盒（批號E-22033），均由南京建成生物工程研究所提供。

酶標(biāo)儀，RT-6000，深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司；離心機(jī)，JW3021HR，安徽嘉文儀器裝備有限公司；超純水系統(tǒng)，Milli-Q Advantage A10，默克密理博有限公司。

1.3富硒芪云水提物的制備 黃芪、紫云英粉碎，分別準(zhǔn)確稱取100 g混合后，加100℃純凈水2 000 mL浸泡60 min，回流提取60 min，120目網(wǎng)篩過濾，藥渣重復(fù)提取2次，合并濾液濃縮至1 000 m L，獲400 mg/mL富硒芪云水提物，臨用時稀釋至100、200、400 mg/mL，相當(dāng)于生藥1.95、3.9、7.8 g/kg。黃芪水提物、紫云英水提物同法制備。

1.4方法

1.4.1S180荷瘤鼠模型的建立［8-9］及分組給藥 S180腫瘤細(xì)胞株接種于昆明小鼠腹腔，抽取腹水，細(xì)胞計數(shù)調(diào)整密度為1×107個/m L，按0.2 mL/只接種于小鼠右前腋皮下，復(fù)制S180荷瘤小鼠模型。造模24 h后，隨機(jī)分為模型組、黃芪提取物組（3.9 g/kg）、紫云英提取物組（3.9 g/kg）、富硒芪云水提物低、中、高劑量組（1.95、3.9、7.8 g/kg）、環(huán)磷酰胺組（60 mg/kg），每組12只。藥物組每日灌胃給藥，給藥體積為0.2 mL/10 g；模型組給予等容量的生理鹽水，每日1次，連續(xù)10 d；陽性藥物組腹腔注射環(huán)磷酰胺，間日1次，連續(xù)給藥3次。

1.4.2指標(biāo)檢測 末次藥后，用3.5%水合氯醛腹腔麻醉，腹主動脈取血并分離血清，檢測小鼠血清SBP1、GPX 1、AMPK、ROS水平，嚴(yán)格按照試劑盒操作；剝離腫瘤組織，稱定質(zhì)量計算抑瘤率，抑瘤率≥30%以上認(rèn)為受試物具有一定的抗腫瘤作用。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組間采用單因素方差分析，P＜0.05為有顯著性差異，P＜0.01為有極顯著性差異。

2　結(jié)果

2.1富硒芪云水提物對S180荷瘤小鼠的抑瘤作用 與模型組比較，陽性藥物組能顯著抑制S180移植性實體瘤生長（P＜0.01），抑瘤率高達(dá)56.20%，同時能抑制小鼠體質(zhì)量增長（P＜0.01）；黃芪組、紫云英組以及富硒芪云水提物低劑量組腫瘤抑制作用不明顯；富硒芪云水提物中、高劑量組均能顯著抑制S180實體瘤生長（P＜0.01），抑瘤率分別為44.92%、38.70%，同時無明顯抑制小鼠體質(zhì)量增加的作用。見表1。

表1　富硒芪云水提物對S180移植性實體瘤的抑制作用（±s，n=12）

表1　富硒芪云水提物對S180移植性實體瘤的抑制作用（±s，n=12）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別劑量/（g·kg-1）末體質(zhì)量/初體質(zhì)量瘤質(zhì)量/ g抑瘤率/ %模型組-1.04±0.07 2.28±0.55-環(huán)磷酰胺組0.06 0.90±0.08**1.00±0.47**56.20黃芪組3.90 1.00±0.04 1.72±0.37 24.63紫云英組3.90 1.10±0.13 1.87±0.70 18.02富硒芪云組1.95 1.06±0.03 1.97±0.91 13.64富硒芪云組3.90 1.02±0.03 1.25±0.50**44.92富硒芪云組7.80 1.06±0.08 1.40±0.61**38.70

2.2富硒芪云水提物對S180荷瘤小鼠血清SBP1及GXP1的影響 與正常對照組比較，模型組小鼠血清SBP1水平、GXP1活性顯著降低；與模型對照組比較，環(huán)磷酰胺組、紫云英組SBP1、GXP1升高不顯著，黃芪及富硒芪云水提物各劑量組血清SBP1、GXP1明顯上升（P＜0.01）；與黃芪組比較，富硒芪云水提物3.9 g/kg組SBP1水平升高明顯（P＜0.01），富硒芪云水提物3.9 g/kg、7.8 g/kg組GXP1活性明顯升高（P＜0.01）；與紫云英組比較，富硒芪云水提物3.9 g/kg、7.8 g/kg組SBP1、GXP1水平升高明顯（P＜0.01）。見表2。

表2　富硒芪云水提物對S180荷瘤小鼠血清SBP1、GXP-1、AMPK及ROS的影響（±s，n=12）

表2　富硒芪云水提物對S180荷瘤小鼠血清SBP1、GXP-1、AMPK及ROS的影響（±s，n=12）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與黃芪組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與紫云英組比較，△△P＜0.01

組別劑量/（g·kg-1）SBP1/（ng·L-1）GPX1/（ng·L-1）AMPK/（U·L-1）ROS/（U·mL-1）正常組-98.98±7.50**25.05±2.803**13.84±1.67**269.10±45.14**模型組-81.44±4.28 20.73±2.06 11.44±0.84 349.66±28.35環(huán)磷酰胺組0.06 84.49±6.47 20.77±1.98 12.27±1.11 330.82±45.75黃芪組3.90 97.41±6.90**22.89±1.66*13.29±1.51**281.63±40.75**B紫云英組3.90 87.74±5.82 22.31±2.95 12.13±1.30 323.05±32.89富硒芪云組1.95 91.03±6.54**21.323±2.04 12.43±1.22 266.87±26.84**A富硒芪云組3.90 108.82±8.62**##26.25±2.15**##△△15.42±1.66**##△△237.10±39.04**#△△富硒芪云組7.80 102.54±7.58**25.12±1.52**#△△14.69±1.31**#△△253.09±50.66**△△

2.3富硒芪云水提物對S180荷瘤小鼠血清AMPK活性的影響 與正常對照組比較，模型組小鼠血清AMPK活性明顯低于正常對照組（P＜0.01）；與模型對照組比較，環(huán)磷酰胺組、紫云英組AMPK活性升高不顯著，黃芪組、富硒芪云水提物3.9 g/kg和7.8 g/kg組血清AMPK活性明顯上升（P＜0.01）；與黃芪組比較，富硒芪云水提物3.9 g/kg和7.8 g/kg組AMPK活性升高（分別為P＜0.01、P＜0.05）。與紫云英組比較，富硒芪云水提物3.9 g/kg和7.8 g/kg組AMPK活性升高（P＜0.01）。見表2。

2.4富硒芪云水提物對S180荷瘤小鼠血清ROS水平的影響

模型組小鼠血清ROS水平顯著高于正常對照組（P＜0.01）；與模型對照組比較，環(huán)磷酰胺組、紫云英組ROS水平降低不明顯，黃芪水提物及富硒芪云水提物各劑量組血清ROS水平明顯降低（P＜0.01）；與黃芪組比較，富硒芪云水提物3.9 g/kg組ROS水平降低（P＜0.05）；與紫云英組比較，富硒芪云水提物各劑量組ROS水平降低（P＜0.01），黃芪組ROS降低（P＜0.05）。見表2。

3　討論

研究發(fā)現(xiàn)，中藥單獨(dú)應(yīng)用具有顯著的抗腫瘤作用［10］，且與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用具有增強(qiáng)藥效、克服耐藥、緩解癌癥疼痛、抑制癌癥轉(zhuǎn)移以及減輕不良反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)［11-12］。黃芪為補(bǔ)益類抗腫瘤中藥，紫云英同為黃芪屬中藥且具解毒止痛功效，本研究在前期成功復(fù)制小鼠荷瘤模型研究基礎(chǔ)上，以中醫(yī)抗腫瘤“扶正祛邪”理論為指導(dǎo)，采用黃芪與紫云英1∶1配伍進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示富硒芪云水提物3.9 g/kg和7.8 g/kg劑量組瘤質(zhì)量明顯低于模型組（P＜0.05），抑瘤率＞30%。與環(huán)磷酰胺組比較，富硒芪云水提物3.9 g/kg劑量組抑瘤率無顯著性差異。結(jié)果表明富硒芪云水提物3.9 g/kg和7.8 g/kg劑量組具有抑制腫瘤作用。

腫瘤微環(huán)境主要是由腫瘤細(xì)胞、基質(zhì)組織以及細(xì)胞外基質(zhì)組成的多維空間結(jié)構(gòu)，氧化還原水平異常，能量代謝失衡，活性氧簇水平升高能影響其自身內(nèi)環(huán)境，是微環(huán)境特異性特征［13］。微量元素硒在體內(nèi)主要以硒蛋白形式參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的氧化還原狀態(tài)，平衡細(xì)胞內(nèi)氧化還原水平發(fā)揮抗腫瘤作用［14］。硒結(jié)合蛋白1（SBP1）參與細(xì)胞內(nèi)高爾基體蛋白的合成及物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，廣泛表達(dá)于多種組織及細(xì)胞，在缺氧條件下，經(jīng)低氧誘導(dǎo)因子lα介導(dǎo)，通過改變VDH1酶的活性或者直接與希佩爾-林道蛋白（VHL蛋白）之間交換［15］，防止泛素化蛋白酶體降解過程中VHL蛋白突變從而抑制腫瘤的發(fā)生。SBP1為目前硒抗腫瘤作用最有潛力的標(biāo)志物之一，其表達(dá)減少與癌癥患者生存率低有關(guān)［16］。谷胱甘肽過氧化物酶1（GPX1）為氧化還原酶，見于線粒體以及胞漿中，為人體內(nèi)含有量最高、表達(dá)最廣泛的硒蛋白之一。GPX1能減少癌癥細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，Kang等［17］研究發(fā)現(xiàn)，GPX1能有效地保護(hù)DNA和蛋白質(zhì)的過氧化氫誘導(dǎo)的氧化損傷，提高抗氧化防御系統(tǒng)。本實驗結(jié)果顯示，模型組荷瘤小鼠SBP1、GPX1顯著降低，治療后，富硒芪云組SBP1、GPX1水平明顯上升，其中3.9 g/kg、7.8 g/kg劑量組效果更顯著。

能量代謝異常為腫瘤細(xì)胞區(qū)別于正常細(xì)胞的一大顯著特征，腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）被稱為“細(xì)胞能量調(diào)節(jié)器”，廣泛存在于真核細(xì)胞生物中，是一種高度保守的蛋白激酶，用于調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝平衡［18］。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)AMP/ATP比率增高時AMPK被激活，啟動生成ATP的分解代謝途徑，同時抑制消耗ATP的合成代謝途徑。AMPK的激活能抑制腫瘤細(xì)胞生長、增殖過程中必需營養(yǎng)物質(zhì)蛋白質(zhì)、脂肪酸、多糖等的合成［19］?；钚匝酰≧OS）為生物有氧代謝的產(chǎn)物，是過氧化氫、超氧陰離子、單線氧態(tài)及羥自由基等一類物質(zhì)總稱。細(xì)胞內(nèi)ROS主要來源于線粒體，當(dāng)活性氧自由基的產(chǎn)生和清除這一動態(tài)平衡被破壞時，會損害機(jī)體的氧化應(yīng)激環(huán)境［20］。氧化應(yīng)激下引起線粒體結(jié)構(gòu)改變產(chǎn)生功能障礙，造成能量產(chǎn)生減少，ROS生成增多［21］。大量ROS可以造成線粒體功能障礙，引起蛋白質(zhì)、DNA、RNA等生物大分子的氧化損傷反應(yīng)，改變其結(jié)構(gòu)功能，從而引起腫瘤的發(fā)生、惡化［22］。本實驗結(jié)果顯示，富硒芪云組能提高AMPK活性、降低ROS水平，且3.9 g/kg、7.8 g/kg劑量組效果更顯著。

綜上所述，富硒芪云水提物能抑制荷瘤小鼠腫瘤組織的增長，升高含硒蛋白GPX1、SBP1水平，減少線粒體氧化損傷，激活A(yù)MPK，提高線粒體有氧氧化作用，清除體內(nèi)過多的ROS，可能是其影響腫瘤微環(huán)境發(fā)揮抗腫瘤作用的途徑之一。

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R285.5

B

1001-1528（2015）03-0623-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.035

2014-11-09

安徽省研究生“千人培養(yǎng)計劃”項目資助（2012）

高華武（1987—），男，碩士生，從事中藥對腫瘤防治作用的研究。Tel：15156071673，E-mail：ghw445673028@163.com

龍子江，男，教授。Tel：（0551）65169216，E-mail：lzjyls@163.com