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    指紋圖譜技術在中藥注射劑標準提高中的應用

    2015-10-18 05:58:41聶黎行石上梅翟為民馬雙成
    中成藥 2015年3期
    關鍵詞:注射劑指紋圖譜

    聶黎行, 石上梅, 翟為民, 戴 忠, 馬雙成

    (1.中國食品藥品檢定研究院,北京 100050;2.國家藥典委員會,北京 100061)

    [綜 述]

    指紋圖譜技術在中藥注射劑標準提高中的應用

    聶黎行1, 石上梅2*, 翟為民2, 戴 忠1, 馬雙成1

    (1.中國食品藥品檢定研究院,北京100050;2.國家藥典委員會,北京100061)

    本文從整體情況、測定條件和評價方式三個方面對新頒布的中藥注射劑標準中指紋圖譜檢測項加以分析和整理。結果可知中藥注射劑指紋圖譜標準普遍采用高效液相檢測,梯度洗脫,一般要求固定色譜柱型號和柱溫,樣品直接進樣或經簡單處理,大部分品種以相似度作為評價指標。指紋圖譜技術在中藥注射劑標準提高中的應用日趨成熟,對保障藥品的有效、均一具有重要意義。

    中藥注射劑;指紋圖譜;標準提高

    中藥注射劑是在口服方劑基礎上發(fā)展起來的現代新劑型,它改變了傳統(tǒng)的給藥方式,有效成分經提取精制后直接進入人體,生物利用率高,便于臨床使用,其劑量準確、吸收快、作用迅速、療效確切的優(yōu)點已獲得認可。據統(tǒng)計,我國現有中藥注射劑130余種,年銷售額數百億,在心腦血管疾病、腫瘤輔助治療和抗細菌抗病毒感染方面的應用尤為成功。隨著臨床應用的日益廣泛,中藥注射劑的不良反應報道也相應增加,引起了社會的關注。國家食品藥品監(jiān)督管理總局(原國家食品藥品監(jiān)督管理局,以下簡稱“國家局”)對中藥注射劑的安全和質量高度重視,早在1999年就出臺了《中藥注射劑研究的技術要求》。為適應制劑工藝和分析水平的發(fā)展,于2007年組織制定了新的《中藥、天然藥物注射劑基本技術要求》,科學規(guī)范和指導中藥、天然藥物注射劑的研究工作;同時組織包括中國食品藥品檢定研究院在內的多家藥檢所對中藥注射劑標準進行全面提高。2009年,國家食品藥品監(jiān)督管理總局開展了中藥注射劑再評價工作,頒布了多個指導原則和技術要求,從生產工藝、質量控制、非臨床及臨床研究、風險評估等方面對已上市的中藥注射劑進行全面監(jiān)控,保證用藥安全有效。

    質量可控是中藥注射劑安全有效的基礎和保障,科學合理的質量標準是藥品質量保證體系的重要組成部分。作為高風險品種,中藥注射劑的質量標準比傳統(tǒng)中藥口服制劑更加嚴格,不僅安全性檢查項目大幅增加,有效和指標性成分的控制也更為全面細致。雖經提取和精制,但多數中藥注射劑仍屬復雜混合體系,化學成分的多樣性和復雜性是其發(fā)揮療效的物質基礎,同時也是質量評價的重點與難點。指紋圖譜可以整體、宏觀地表征被測樣品主要化學成分的特征,經過多年的發(fā)展和應用,目前是公認的最適合中藥及天然藥物物質群質量控制的手段之一。

    2000年國家食品藥品監(jiān)督管理總局在《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求》中規(guī)定中藥注射劑必需制定指紋圖譜。2002年國家藥典委員會(以下簡稱“藥典會”)又下達了《中藥注射劑色譜指紋圖譜實驗研究技術指南》。中藥注射劑標準提高和再評價工作也強調了指紋圖譜的重要性,要求原料、中間體、制劑均應分別研究建立指紋圖譜,并進行相關性研究。注射劑中含有的大類成分,一般都應在指紋圖譜中得到體現,必要時應建立多張指紋圖譜,以適應檢測不同大類成分的需要。指紋圖譜的相似程度可采用相似度等指標進行評價(狹義的指紋圖譜),也可根據產品特點以特征峰比例等指標及指紋特征進行描述,并規(guī)定非共有峰數及相對峰面積限度等(狹義的特征圖譜)。本文以近3年新頒布的中藥注射劑標準中【指紋圖譜】或【特征圖譜】項目為載體,結合多年中藥注射劑檢驗和標準修訂工作實踐經驗,就指紋圖譜技術在中藥注射劑標準提高中的應用提出拙見,以期拋磚引玉、共同提高。

    1 中藥注射劑標準中的指紋圖譜項目

    2010年版《中國藥典》實施后至2013年,共新頒布實施了24個中藥注射劑標準,1個注射用原料標準。除清開靈注射液收載于2010年版《中國藥典》外,其余均以單頁標準形式發(fā)布。原標準多為衛(wèi)生部或國家局藥品標準,大部分未規(guī)定指紋圖譜檢測項目,標準提高工作承擔單位根據品種各自的特點,在修訂標準中研究并制定了指紋圖譜或特征圖譜檢測方法。按處方分類,注射用薏苡仁油[1]、康萊特注射液[2]、血栓通注射液[3]、注射用血栓通(凍干)[4]、血塞通注射液[5]、注射用血塞通(凍干)[6]、喜炎平注射液[7]7個品種原料為中藥有效部位,占29%;舒血寧注射液[8]、柴胡注射液[9]、丹參注射液[10]、紅花注射液[11]4個品種由單味藥材或提取物制備,占17%;參附注射液[12]、參麥注射液[13]、生脈注射液[14]、注射用益氣復脈(凍干)[15]、參芪扶正注射液[16]、雙黃連注射液[17]、康艾注射液[18]、喘可治注射液[19]、冠心寧注射液[20]9個品種由2~3味原料藥材制得,占37%;痰熱清注射液[21]、脈絡寧注射液[22]、血必凈注射液[23]、清開靈注射液[24]4個品種處方在5味以上,占17%,其中清開靈注射液最為復雜,由八味藥材制得。組方藥味越多,指紋圖譜研究難度越大,需要建立分離度高、信息量大的分析方法,盡可能地體現對每味藥材的質量控制。痰熱清注射液是24個提高標準中唯一規(guī)定兩項指紋圖譜檢測的標準,以HPLCELSD法測定氨基酸,控制熊膽粉、山羊角投料;HPLC-UV法測定280 nm下色譜,控制黃芩、金銀花和連翹投料,達到了全方質控的目的。

    2 指紋圖譜的建立

    隨著分析儀器的進步,指紋圖譜的檢測技術也在不斷發(fā)展,由最初的薄層色譜(TLC)法發(fā)展到液相色譜(HPLC)法[25-26]和氣相色譜(GC)法[27-28],超高效液相色譜(UPLC)的出現使得液相指紋圖譜的分離度進一步提高[29-30],檢測時間大大縮短,而液質聯用(HPLCMS)[31-32]和氣質聯用(GC-MS)[33-34]技術的推廣也擴展了指紋圖譜的分析范圍,豐富了化學信息。計算機輔助技術的發(fā)展使得紅外(IR)[35-36]、近紅外(NIR)[37]、核磁共振(NMR)[38]及X射線衍射[39]等波譜方法,等離子體質譜(ICP-MS)[40]等元素分析手段評價中藥復雜混合體系的指紋特征成為可能。還有學者通過DNA技術,從生物學角度闡釋中藥的指紋信息[41]。出于對方法適用性和可操作性的考慮,目前中藥注射劑質量標準一般仍選用普及程度最廣、發(fā)展最為成熟的HPLC或GC法測定指紋圖譜。24個提高標準25個指紋圖譜項,除1項(柴胡注射液)采用GC法,其余均采用HPLC法檢測。為保證專屬性,起草單位在進行標準研究時也同時對指紋圖譜中的主要特征峰進行了藥材歸屬和質譜指認[42-43]。主要化學成分峰分離度好的指紋圖譜,常常與含量測定采用相同色譜條件,供試品進樣一次用于兩項檢測,24個標準中有11個指紋圖譜可與含量測定同時進行。除注射液用薏苡仁油及其制劑康萊特注射液外,其余品種指紋圖譜流動相均采用梯度洗脫,洗脫時間由55 min至120 min不等。與一般含量測定不同,指紋圖譜檢驗往往通過色譜峰群的整體特征進行判斷,且多采用梯度洗脫,因此對結果重現性要求較高。經驗表明,色譜儀品牌、型號的差異對分離度、出峰順序及峰群面貌的影響遠遠小于色譜柱的型號和柱溫改變造成的影響。出于以上考慮,標準起草單位在指紋圖譜研究初期即對不同色譜柱進行了考察。經比較25個指紋圖譜僅有9個未指定色譜柱型號,其余均在“色譜條件與系統(tǒng)適應性試驗”項下注明了色譜柱的廠家、型號和規(guī)格。丹參注射液標準雖未規(guī)定色譜柱,但在對照指紋圖譜下方標注了生成對照指紋圖譜使用的色譜儀和色譜柱型號。柱溫方面,除GC指紋圖譜對升溫程序有明確規(guī)定外,大部分HPLC指紋圖譜要求固定柱溫,其中規(guī)定25℃的6個,30℃的8個,35℃的4個,40℃的3個,僅3個指紋圖譜未對柱溫做出要求。由于注射劑較之其他中藥制劑,成分相對簡單,25項指紋圖譜檢測所需的供試品溶液中,有22項只需直接進樣或者溶解/稀釋后進樣,其余需要前處理的品種操作也較簡單,痰熱清注射液氨基酸指紋圖譜需柱前衍生化,參芪扶正注射液經正丁醇提取后進樣測定,康艾注射液供試品溶液由固相萃取小柱凈化制備。值得一提的是,盡管標準起草單位在方法學考察階段進行過較全面的耐用性試驗,但儀器狀態(tài)、色譜柱使用程度、流動相試劑廠家、色譜峰積分參數等因素都有可能引起不同實驗室測定結果的偏差。檢驗人員在實際操作時應首先進行系統(tǒng)適用性試驗,確保分析條件滿足標準要求,基線平穩(wěn),主要特征峰分離良好。

    3 指紋圖譜的評價方式

    好的檢測條件可以幫助分析人員獲得準確的、反映樣品化學特征全貌的指紋圖譜,在此基礎上加以科學、合理的評價也是質量控制的重要環(huán)節(jié)。色譜峰數量、保留時間和面積的變化可以反映藥品內在質量的差異,如何將這種差異科學客觀地表達是中藥注射劑標準建立過程需要解決的問題之一。指紋圖譜的評價方式早已從最初的直觀比較發(fā)展到數字化解讀,一般基于相對保留時間和相對峰面積這兩個核心參數,結合化學計量學方法對圖譜加以綜合的半定量評價。近年來很多學者將模式識別技術用于指紋圖譜信息的挖掘和表達[44-45],但模型轉移和算法共享等問題限制了其在藥品質量標準中的應用。

    按結果判斷方式分類,目前中藥標準中獲得廣泛認可并且普遍使用的是特征圖譜和指紋圖譜兩種檢測方法。前者一般要求若干特征峰與參照峰的相對保留時間和相對峰面積在規(guī)定值的±n%以內,后者以夾角余弦法計算樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜的整體相似度并規(guī)定下限。從廣義上講,特征圖譜仍舊是指紋圖譜的一種,當n取值較小時,狹義的特征圖譜比狹義的指紋圖譜限度更為嚴格。對于成分復雜的藥品,采用特征圖譜模式評價質量,如果特征峰選取數量過少,難以體現整體特性;而特征峰數目的增加會加重手工選擇、計算的工作量,且容易引入人為誤差。2004年我國頒布了具有自主知識產權的《中國色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(A、B版),用于中藥指紋圖譜相似度的計算,能定量比對圖譜整體相似程度的工具。此后根據實際使用效果總結經驗,不斷改進和完善軟件的功能,于2009年推出了新版《中國色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2.0版)。2012年,國家藥典委員會組織制定和建立了中藥色譜指紋圖譜電子標準圖譜及其相似度評價軟件系統(tǒng),通過互聯網正式對外開放(http://fp.chp.org.cn),用戶可以在該系統(tǒng)下載相似度評價軟件及對照指紋圖譜。

    本文總結的24個中藥注射劑提高標準,除柴胡注射液標準要求6個特征峰的相對保留時間在規(guī)定時間的±8%范圍內外,其余標準均采用指紋圖譜模式,不僅要求檢出特征峰,還以相似度為指標控制樣品質量。其中,注射用益氣復脈和舒血寧注射液標準分別采用益氣復脈對照提取物和銀杏葉對照提取物作為實物對照,檢驗時與樣品隨行測定,以供試品溶液指紋圖譜與對照提取物溶液指紋圖譜的相似度進行評價。剩余21個品種22個指紋圖譜項,起草單位在標準修訂階段建立了相應對照指紋圖譜,上報藥典會,電子文件隨標準同時頒布。檢驗時只需測定樣品,計算供試品溶液指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度。具體地,尚有全譜相似度與特征峰相似度之分,檢驗人員在應用指紋圖譜評價軟件時應注意點選不同的相似度計算功能。以參附注射液和參麥注射液為例,前者標準規(guī)定“在9~105 min范圍內,本品指紋圖譜與參附注射液對照指紋圖譜比較,相似度應不得低于0.9”,這時需點擊“全譜峰匹配”計算相似度(見圖1);后者標準規(guī)定“在8~90 min范圍內,應呈現16個與參麥注射液對照指紋圖譜相對應的特征峰。按中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)計算,以特征峰計算相似度,本品指紋圖譜與參麥注射液對照指紋圖譜比較,相似度不得低于0.85”,這時需要根據保留時間的先后順序及峰貌特征,以對照品指紋圖譜為尺,在供試品指紋圖譜中選中16個相對應的特征峰后,點擊“Mark峰匹配”,計算相似度(見圖2)。部分品種,如參麥注射液、生脈注射液,除對特征峰相似度有下限要求外,尚規(guī)定非特征峰占總峰面積的比例不得高于上限,軟件在計算相似度時,會同時給出非特征峰比例。由于面積較大的色譜峰對相似度的貢獻較多,可能掩蔽其他成分的差異,為更加全面、細致地評價中藥注射劑整體質量,可以在計算相似度時將含量特別高或者響應特別強的組分對應色譜峰剪除。如雙黃連注射液指紋圖譜中,黃芩苷峰面積顯著高于其他成分,標準規(guī)定“刪除10號峰,將供試品色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”,黃芩苷作為含量測定項的指標。根據實際情況,不同品種相似度的計算方式及限度有所差異(見表1),一般情況下,有效部位制成的注射劑或獨家產品由于原料和生產工藝相對固定,藥品質量均一性和穩(wěn)定性更有保障,相似度要求較高。

    圖1 全譜峰匹配模式計算相似度

    圖2 特征峰匹配模式計算相似度

    表1 23個中藥注射劑標準指紋圖譜相似度計算模式及限度

    4 展望

    指紋圖譜技術自上世紀末引入我國以來,在中藥質量控制領域始終發(fā)揮著積極作用,尤其是在中藥注射劑質量標準提高中,已得到全面、成熟的應用。藥典委分別于2012年和2013年組織了兩期全國范圍的“中藥色譜指紋圖譜電子標準圖譜及其相似度評價系統(tǒng)專項培訓”,本文作者們作為培訓班的授課講師,深切地感受到了來自藥檢系統(tǒng)和藥品生產企業(yè)的工作人員對掌握和運用指紋圖譜技術,把好藥品質量關的渴望,同時也感到正確的引導和規(guī)范在中藥指紋圖譜檢驗工作中的重要性。對于中藥注射劑,必須始終堅持高標準、嚴要求,鼓勵采用綜合手段對質量進行多維、全方控制,積極嘗試新技術、新方法,探索更加準確、客觀、全面的評價方式。將指紋圖譜技術獨特的優(yōu)勢用于藥品的研究、生產和質量控制等環(huán)節(jié),有助于提高工藝水平、完善質量標準、保證用藥安全、有效。

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    [2] WS3-301(Z-308)-2006(Z)-2013,康萊特注射液標準[S].2013.

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    [9] WS3-B-3297-98-2011,柴胡注射液標準[S].2011.

    [10] WS3-B-3766-98-2011,丹參注射液標準[S].2011.

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    R284.1

    A

    1001-1528(2015)03-0607-05

    10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.032

    2014-04-23

    國家自然科學基金(81303194)

    聶黎行,女,副研究員,主要從事中藥質量控制和中藥標準物質的研究。E-mail:nielixing@163.com

    石上梅,女,主任藥師,主要從事中藥標準的研究與建立。E-mail:sm@chp.org.cn

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