HPLC法同時(shí)測定吉祥草中阿魏酸及蘆丁

田源紅， 張永萍， 李 瑋， 徐 劍， 王建科， 劉 赟

（貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州　貴陽　550002）

HPLC法同時(shí)測定吉祥草中阿魏酸及蘆丁

田源紅， 張永萍*， 李 瑋， 徐 劍， 王建科， 劉 赟

（貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽550002）

目的 建立吉祥草中阿魏酸和蘆丁的測定方法。方法 采用反相高效液相色譜法，Wondasil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇-0.4%磷酸水（38∶62），體積流量為1 mL/min，檢測波長270 nm；柱溫30℃。結(jié)果 阿魏酸在0.40～2.40μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系（r=0.999 9），平均回收率為100.1%，RSD為2.8%；蘆丁在0.625～5.625μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系（r=0.999 95），平均回收率為100.7%，RSD為1.3%。結(jié)論 該方法分離效果好，操作簡單，穩(wěn)定性好，重復(fù)性好，可用于吉祥草中阿魏酸和蘆丁的測定。

吉祥草；RP-HPLC；阿魏酸；蘆丁

吉祥草又名觀音草，為百合科植物吉祥草Reineckia carner（Andr.）Kunth的干燥全草。具有滋陰潤肺、涼血止血的功效，用于肺燥咳喘、陰虛咳嗽、咯血、遺精、跌撲損傷。在《本草綱目》、《中藥大辭典》、《全國中草藥匯編》中均有記載，苗族、侗族、布依族喜用鮮品治療咳嗽等［1-2］。是咳速停糖漿、咳速停膠囊、復(fù)方吉祥草片等制劑的主要藥物。近年來發(fā)現(xiàn)其中還含有Fe、Cu、Zn、Mn、Mg、Ca、K等8種微量元素，且含有量較高，具有較高的藥用價(jià)值［3］。還發(fā)現(xiàn)具有溶血、止咳、化痰、抗炎、降血糖的作用［4-5］。阿魏酸是抑菌作用的有效成分，蘆丁是止咳作用的有效成分［6］，本實(shí)驗(yàn)同時(shí)對兩成分定量測定方法進(jìn)行了研究，為提高吉祥草的質(zhì)量控制方法提供依據(jù)。

1　藥材

吉祥草經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院汪毅教授鑒定為百合科植物吉祥草Reineckia carner（Andr.）Kunth的干燥全草。

2　儀器與試藥

2.1儀器 高效液相色譜儀（日本島津/LC-20AT）、超聲波清洗機(jī)（北京創(chuàng)新德超聲電子研究所）、SHZ-95型循環(huán)水式真空泵（河南鞏義市予華儀器有限公司）、AE-240雙量程電子分析天平（萬分之一，十萬分之一）、HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）、色譜柱（ACE C18、WondaSil C18、Diamonsil C18）。

2.2試藥 阿魏酸對照品（貴州迪大生物科技有限責(zé)任公司，供含量測定用，批號1135-24-6），蘆丁對照品（中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用，批號100080-200707），色譜甲醇（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號20130501），娃哈哈純凈水，分析純甲醇、乙醇、磷酸。

3　試驗(yàn)方法

3.1對照品溶液的的制備 精密稱取阿魏酸對照品0.016 g，于100 mL量瓶中，用色譜甲醇定容至刻度，即得每1 mL含阿魏酸0.16 mg的溶液；另取蘆丁對照品0.025 g，于100 mL量瓶中，同法即得每1 mL含蘆丁0.25 mg的溶液。

3.2供試品溶液的制備

3.2.1提取方法考察 分別用超聲提?。?］、回流提?。?］、索氏提取，結(jié)果用回流提取的方法兩成分的峰面積最大，且分離度、拖尾因子較好，故選用回流提取。

3.2.2正交試驗(yàn) 精密稱取吉祥草全草粉末約1 g于100 mL圓底燒瓶中，以料液比、甲醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取次數(shù)為四因素，各3個(gè)水平設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，9個(gè)樣品，回流提取，過濾，濾液水浴揮干，殘?jiān)佑? mL甲醇定容，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，進(jìn)樣10μL。測定峰面積，計(jì)算。因素水平及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1～4。

表1　因素水平Tab.1 Level of factors

表2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of the experiment

表3　阿魏酸方差分析Tab.3 Variance analysis of ferulic acid

表4　蘆丁方差分析Tab.4 Variance analysis of rutin

從表2得出：影響阿魏酸因素依次為C＞D＞B＞A，最佳方案為A3B2C2D3；影響蘆丁因素依次為C＞D＞A＞B，最佳方案為A2B3C3D3。提取時(shí)間、提取次數(shù)影響較大。

從表3、4得出：料液比、甲醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取次數(shù)對吉祥草中阿魏酸和蘆丁的量無顯著性差異。

綜上所述，考慮到節(jié)約溶劑和時(shí)間，提取方案為A3B2C2D2，即：料液比（1∶30）、甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)（90%）、提取時(shí)間（1 h）、提取次數(shù)（2次）作為提取吉祥草的最佳提取條件。即：精密稱取吉祥草全草粉末約1 g于100 mL圓底燒瓶中，精密加入30 mL 90%甲醇回流提取1 h，過濾，濾液備用，再將濾紙放入圓底燒瓶中同法回流1 h，合并兩次濾液，水浴揮干，殘?jiān)佑? mL甲醇定容，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，進(jìn)樣10μL。

3.3色譜條件 WondaSilC18色譜柱（250 mm× 4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.4%磷酸水（32∶68）；體積流量1.0 mL/min，檢測波長270 nm；柱溫30℃。

3.3.1色譜柱的選擇 分別對ACEC18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）、DiamonsilC18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）、WondaSilC18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，WondaSilC18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）的色譜柱分離效果好，故選擇此色譜柱。

3.3.2最大吸收波長的選擇 對200～400波段進(jìn)行掃描，蘆丁在波長365 nm處有最大吸收，阿魏酸在265 nm處有最大吸收波長。通過實(shí)驗(yàn)比較選擇的最適吸收波長為270 nm。

3.3.3流動(dòng)相的選擇 先后對甲醇-0.4%磷酸水、甲醇-0.1%磷酸水、甲醇-0.2%磷酸水、甲醇-0.3%磷酸水、甲醇-水、甲醇-水-乙酸（45∶54∶1）［9］6種流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇甲醇-0.4%磷酸水（32∶68）作為流動(dòng)相。

3.4方法學(xué)考察

3.4.1繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別取質(zhì)量濃度為0.16 mg/mL的阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)溶液2.5、5.0、7.5、10、12.5、15μL注入高效液相色譜儀，記錄其峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，得回歸方程y=3×106x-29 728（r=0.999 9），結(jié)果表明阿魏酸在0.40～2.40μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系；同法精密量取質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液2.5、5.0、7.5、10、12.5、15、22.5μL注入高效液相色譜儀，記錄其峰面積。得出回歸方程y=2×106x-1 684.5（r=0.999 95），結(jié)果表明蘆丁在0.625～5.625μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。樣品、對照品HPLC圖譜見圖1。

圖1　吉祥草HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of Reineckia carner

3.4.2精密度試驗(yàn) 精密吸取按正交試驗(yàn)優(yōu)選出的最佳提取工藝制備的供試品溶液，每次進(jìn)樣10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，結(jié)果阿魏酸峰面積RSD為1.7%，蘆丁峰面積RSD為1.6%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

3.4.3穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一吉祥草樣品，每次進(jìn)樣10μL，分別于0、2、4、6、8、12 h依次進(jìn)樣，測定峰面積，結(jié)果阿魏酸峰面積RSD為2.4%，蘆丁峰面積RSD為0.9%，結(jié)果表明樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.4.4重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一吉祥草樣品粉末6份，每份約1 g，制備供試品溶液，每次進(jìn)樣10μL，測定峰面積，計(jì)算，結(jié)果阿魏酸RSD為2.9%，蘆丁RSD為2.3%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.4.5回收率試驗(yàn) 分別稱取已知含有量吉祥草樣品粉末（阿魏酸0.119 mg/g和蘆丁0.425 mg/g）6份，每份約0.5 g，精密加入阿魏酸對照品（0.103 mg/mL）溶液0.6 mL和蘆丁對照品（0.220 mg/mL）溶液1 mL，按供試品項(xiàng)下制備，進(jìn)樣10μL，測定峰面積，計(jì)算，阿魏酸平均回收率為100.1%、RSD為2.8%，蘆丁的平均回收率為100.7%，RSD為1.3%，表明該方法的回收率良好。見表5，表6。

表5　阿魏酸加樣回收率試驗(yàn)Tab.5 Results of recovery tests for ferulic acid

表6　蘆丁加樣回收率試驗(yàn)Tab.6 Results of recovery tests for rutin

3.4.6樣品測定 精密吸取3批吉祥草藥材的供試液10μL分別進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算阿魏酸和蘆丁的量，結(jié)果見表7。3批吉祥草中的阿魏酸含有量在0.011%～0.013%之間，蘆丁含有量在0.047%～0.054%之間。

表7　阿魏酸、蘆丁測定結(jié)果Tab.7 Determ ination results of ferulic acid and rutin

4　結(jié)果與討論

4.1體積流量的選擇 分別對0.8、0.9、1.0 mL/min的體積流量進(jìn)行考察，結(jié)果表明1.0 mL/min時(shí)峰面積最大。

4.2柱溫的選擇 分別對25℃［10］、30℃［11］、35℃［12］三個(gè)柱溫進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明30℃時(shí)峰型最佳，故選擇柱溫為30℃。

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Determ ination of ferulic acid and rutin in Reineckia carner（Andr.）Kunth.by HPLC

TIAN Yuan-hong， ZHANG Yong-ping， LIWei， XU Jian， WANG Jian-ke， LIU Yun
（Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guizhou 550002，China）

Reineckia carner（Andr.）Kunth；RP-HPLC；ferulic acid；rutin

R284.1

A

1001-1528（2015）03-0603-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.031

2014-04-04

貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合重G字［2012］4 001號）；貴州省教育廳中藥、民族藥產(chǎn)地加工與炮制技術(shù)工程中心（黔教合KY字［2012］021號）

田源紅（1963—），女，教授，碩士生導(dǎo)師，從事中藥材民族藥材炮制工藝及質(zhì)量研究。Tel：13511931919，E-mail：tyh0831@sohu.com

張永萍（1964—），女，教授，碩士生導(dǎo)師，從事中藥新制劑新劑型新技術(shù)研究。Tel：（0851）5652056，E-mail：zgygpg @sohu.com