RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定線紋香茶菜不同生長(zhǎng)部位中三萜酸成分

鄒盛勤， 姜 瓊（江西省天然藥物活性成分研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西　宜春　336000）

RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定線紋香茶菜不同生長(zhǎng)部位中三萜酸成分

鄒盛勤， 姜 瓊*
（江西省天然藥物活性成分研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西宜春336000）

目的 建立反相高效液相色譜法（RP-HPLC）同時(shí)測(cè)定線紋香茶菜全草、根、莖和葉中坡模酸、山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸和熊果酸5種三萜酸的含有量。方法 線紋香茶菜95%乙醇提取液的分析在Kromasil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）上進(jìn)行，流動(dòng)相為甲醇-2.0%乙酸水溶液（88∶12，V/V），體積流量1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫25℃。結(jié)果 坡模酸、山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸和熊果酸進(jìn)樣量分別在0.552～41.4 mg/L（r =0.999 5），0.540～40.5 mg/L（r=0.999 6），0.824～61.8 mg/L（r=0.999 9），2.444～183.3 mg/L（r=0.999 7）和3.172～237.9 mg/L（r=0.999 7）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，加樣回收率分別為98.1%、98.0%、96.3%、99.7%、99.0%。RSD（n=6）均小于2.2%。結(jié)論 線紋香茶菜樣品不同部位中，5種三萜酸類成分含有量高低依次為葉＞全草＞莖＞根。

線紋香茶菜；三萜酸；坡模酸；山楂酸；科羅索酸；齊墩果酸；熊果酸

線紋香茶菜為唇形科Lamiaceae香茶菜屬Rabdosia植物線紋香茶菜Rabdosia lophanthoides（Buch.-Ham.ex D.Don）Hara的全草，俗稱溪黃草、熊膽草、血風(fēng)草、黃汁草、溪溝草、香茶菜、土黃連等［1-3］。線紋香茶菜因其喜生于山谷明濕溪旁，新鮮葉片揉碎有黃汁而得名，主產(chǎn)于長(zhǎng)江以南的湖南、四川、云南、江西、廣東、廣西等省區(qū)，其味辛、性溫，具有清熱利濕、涼血散瘀和驅(qū)蟲的功效，用于治療濕熱瀉痢，跌打瘀腫，急性黃疸型肝炎，急性膽囊炎，痢疾、腸炎、跌打瘀痛等病癥［4-5］。線紋香茶菜含萜類、黃酮類、酚類、氨基酸等多種化學(xué)成分［6-8］。王兆全［9］等從線紋香茶菜的干葉乙醇提取物中分離出β-谷甾醇、齊墩果酸、2α，19α-二羥基烏蘇酸、β-谷甾醇-D-葡萄糖苷及線紋香茶菜酸等5種單體，有關(guān)線紋香茶菜單個(gè)三萜類成分如熊果酸、2α-羥基熊果酸的測(cè)定已有報(bào)道［10-11］。但采用反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定線紋香茶菜不同部位中多種三萜酸的量尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以廣東省連州線紋香茶菜為實(shí)驗(yàn)材料，優(yōu)化色譜條件，對(duì)其所含坡模酸、山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸和熊果酸等5個(gè)三萜酸類成分進(jìn)行了分離和定量測(cè)定，可作為線紋香茶菜的質(zhì)量控制和藥效基礎(chǔ)物質(zhì)研究的依據(jù)。

1　儀器與試劑

1.1儀器 高效液相色譜儀，包括雙515泵，2996光電二極管陣列檢測(cè)器，Empower中文色譜數(shù)據(jù)工作站（美國(guó)Waters公司）；SK2510HP超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司，功率250 W，頻率59kHz）CP225D電子分析天平（德國(guó)Sartourius公司）。

1.2試藥 甲醇（色譜純，德國(guó)MERCK公司），其余試劑均為分析純，水為重蒸水。坡模酸對(duì)照品（上海如吉生物科技發(fā)展有限公司，批號(hào)120528）；山楂酸和科羅索酸對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)分別為20110105、20120502）；齊墩果酸、熊果酸對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定院，批號(hào)分別為110709-200304、110742-200314）。線紋香茶菜原料藥采自廣東省連州市，經(jīng)鑒定為唇形科香茶菜屬植物線紋香茶菜Rabdosia lophanthoides（Buch.-Ham.ex D.Don）Hara的全草。

2　方法與結(jié)果

2.1溶液配制

2.1.1對(duì)照品溶液 分別精密稱定坡模酸2.76 mg、山楂酸2.70 mg、科羅索酸4.12 mg、齊墩果酸12.22 mg、熊果酸15.86 mg對(duì)照品，置于50 mL量瓶中，加適量甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成含坡模酸0.055 2 mg/mL、山楂酸0.054 0 mg/mL、科羅索酸0.082 4 mg/mL、齊墩果酸0.244 4 mg/mL和熊果酸0.317 2 mg/mL的混合對(duì)照品貯備液。

2.1.2樣品溶液 線紋香茶菜樣品按部位分離后置恒溫干燥箱中于70℃下干燥4 h，高速粉碎機(jī)粉碎后過40目篩。精密稱取線紋香茶菜各樣品粉末約1.0g，分別置于50 mL具塞錐形瓶中，加入95%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量。超聲提取45 min，冷卻后用95%乙醇補(bǔ)足損失質(zhì)量，搖勻，用0.45μm濾膜過濾，取續(xù)濾液作為樣品溶液。

2.2色譜條件 Kromasil C18色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇-2.0%乙酸水溶液（88∶12，V/V），體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；柱溫為25℃；運(yùn)行壓力為1 365 psi（1 psi=6.894 kPa）。對(duì)照品溶液中坡模酸、山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸和熊果酸分離度分別為2.29、3.08、2.33、14.15和1.88，對(duì)稱因子分別為1.03、1.01、1.00、1.01和1.01，外標(biāo)法定量分析。對(duì)照品和線紋香茶菜樣品色譜見圖1。

圖1　對(duì)照品溶液（A）和線紋香茶菜樣品溶液（B）HPLC色譜Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances（A）and sample（B）

2.3精密度試驗(yàn) 分別精密吸取同一質(zhì)量濃度坡模酸、山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸和熊果酸對(duì)照品溶液20μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，以峰面積計(jì)算色譜系統(tǒng)精密度，坡模酸、山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸和熊果酸峰面積RSD（n=5）分別為1.4%、1.0%、1.5%、1.4%和1.3%，表明儀器精密度良好。

2.4線性關(guān)系試驗(yàn) 分別吸取坡模酸、山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸和熊果酸對(duì)照品混合貯備液0.2、0.5、1、5、10、15 mL置20 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得混合對(duì)照品系列溶液。分別吸取對(duì)照品混合系列溶液20μL進(jìn)樣分析，按色譜條件測(cè)定峰面積，以對(duì)照品的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制線性標(biāo)準(zhǔn)曲線。5種三萜酸組分的線性方程、線性范圍和線性相關(guān)系數(shù)見表1。

表1　三萜酸的線性關(guān)系Tab.1 Linear relations of five triterpenic acids

2.5重復(fù)性試驗(yàn) 取線紋香茶菜同一樣品（全草）6份，每份各約1.0 g，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液。精密吸取各樣品溶液20μL，注入液相色譜儀，測(cè)定5個(gè)組分峰面積積分值，外標(biāo)法計(jì)算坡模酸、山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸和熊果酸量，其RSD（n=6）分別為2.4%、1.9%、2.1%、1.4%和1.9%。結(jié)果表明，樣品制備方法重復(fù)性良好。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取線紋香茶菜全草樣品約1.0 g，按“2.1.2”項(xiàng)下步驟制備樣品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，進(jìn)樣量20 μL，測(cè)定5種三萜酸的峰面積，計(jì)算得坡模酸、山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸和熊果酸峰面積的RSD值分別為1.6%、1.7%、1.5%、2.1%和1.3%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知坡模酸、山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸和熊果酸含有量的線紋香茶菜樣品（全草）6份，每份約0.5 g，分別加入對(duì)照品適量，按“2.1.2”項(xiàng)下步驟制備樣品溶液，進(jìn)樣20μL測(cè)定5種三萜酸的峰面積，外標(biāo)法計(jì)算，結(jié)果見表2。

2.8樣品測(cè)定 精密吸取制備的樣品溶液各20μL進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣3次，測(cè)定坡模酸、山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸和熊果酸峰面積積分值，外標(biāo)法計(jì)算5種三萜酸的量。測(cè)定結(jié)果見表3。

3　討論

在線紋香茶菜樣品不同部位中，5種三萜酸類成分含有量高低均依次為葉＞全草＞莖＞根。而同一部位中，坡模酸和熊果酸含有量高于其他3種三萜酸，且含有量差異較大，由測(cè)定結(jié)果可知三萜酸類成分主要存在于線紋香茶菜葉中。

本實(shí)驗(yàn)采用甲醇-乙酸水溶液體系的分離效果較好，乙酸形成的弱酸環(huán)境抑制了三萜酸類成分在流動(dòng)相中的解離，組分色譜峰對(duì)稱性良好。分析時(shí)采用等度洗脫，操作簡(jiǎn)便，分離度較好，且保留時(shí)間適中，單個(gè)樣品分析可在25 min內(nèi)完成。

表2　5種三萜酸成分的回收率（n=6）Tab.2 Results of recovery rates for five triterpenic acids（n=6）

表3　樣品測(cè)定結(jié)果（mg/g）Tab.3 Quantitative determ ination of sam ples（mg/g）

坡模酸、山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸和熊果酸均屬三萜類化合物，且山楂酸和科羅索酸、齊墩果酸和熊果酸互為同分異構(gòu)體，結(jié)構(gòu)和極性相似，在C18色譜柱上保留時(shí)間相近。本實(shí)驗(yàn)建立RPHPLC法同時(shí)測(cè)定線紋香茶菜中的5種三萜酸成分時(shí)，優(yōu)化流動(dòng)相的配比和pH，有效地將5種三萜酸成分加以分離，樣品中坡模酸、山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸和熊果酸分離度均大于1.5。方法定量準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)便，可用于同時(shí)測(cè)定線紋香茶菜樣品中坡模酸、山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸和熊果酸。

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Simultaneous determ ination of five triterpenic acids in different parts of Rabdosia lophanthoides by RP-HPLC

ZOU Sheng-qin， JIANG Qiong*
（Key Laboratory of Jiangxi Proυince for Research on Actiυe Ingredients in Natural Medicines，College of Chemistry and Bioengineering，Yichun Uniυersity，Yichun 336000，China）

AIM To establish the method for simultaneously determining pomolic acid，hawthorn acid，corosolic acid，oleanolic acid and ursolic acid in total grass，root，stem，and leaf of Rabdosia lophanthoides.METHODS The separation was achieved on a Kromasil C18column（4.6 mm×250 mm，5μm）at25℃using methanol-2.0%CH3COOH solution（88∶12，V/V）as themobile phase at a flow rate of1.0 mL/min.The detection wavelength was setat210 nm.RESULTS Linearities of pomolic acid，hawthorn acid，corosolic acid，oleanolic acid and ursolic acid were in the ranges of 0.552-41.4 mg/L（r=0.999 5），0.540-40.5 mg/L（r= 0.999 6），0.824-61.8 mg/L（r=0.999 9），2.444-183.3 mg/L（r=0.999 7）and 3.172-237.9 mg/L（r=0.999 7），respectively.The average recoveries were 98.1%，98.0%，96.3%，99.7%and 99.0%with RSD（n=6）less than 2.2%.CONCLUSION The five triterpenic acids from R.Lophanthoides distributed from high to low are leaf＞total grass＞stem＞root in turn.

Rabdosia lophanthoides；triterpenic acid；pomolic acid；hawthorn acid；corosolic acid；oleanolic acid；ursolic acid；RP-HPLC

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-1528（2015）03-0570-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.024

2014-04-03

國(guó)家“863”計(jì)劃重點(diǎn)資助項(xiàng)目（2002AA2Z3217）；江西省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2007BG07200）

鄒盛勤（1970—），男，教授，碩士，研究方向?yàn)樗幬锓治?。Tel：13507058127，E-mail：zsqycxy@163.com

姜 瓊（1980—），男，講師，碩士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物研究與開發(fā)。Tel：13707050417，E-mail：qqj2000@163.com