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    乙型肝炎肝衰竭患者血清細(xì)胞因子與肝功能指標(biāo)的關(guān)系

    2015-10-17 13:44:08白潔王曉霞
    肝臟 2015年10期
    關(guān)鍵詞:微球乙型肝炎細(xì)胞因子

    白潔 王曉霞

    乙型肝炎肝衰竭患者血清細(xì)胞因子與肝功能指標(biāo)的關(guān)系

    白潔王曉霞

    目的探討患有慢加急性乙型肝炎肝衰竭(ACHBLF)的患者體內(nèi)輔助性T細(xì)胞1/2(Th1/Th2)所分泌的細(xì)胞因子的含量,并探討其含量變化在ACHBLF中的作用。方法 收集17例本院體檢中心健康志愿者,35例患有ACHBLF以及18例患有慢性乙型肝炎(CHB)的患者的血清,利用流式細(xì)胞微球芯片捕獲技術(shù)(CBA)檢測血清中腫瘤壞死因子α(TNFα)、白細(xì)胞介素4(IL4)、γ干擾素(IFNγ)、白細(xì)胞介素10(IL10)、白介素2(IL2)以及白介素6(IL6)的含量,并且分析ACHBLF患者血清內(nèi)Th1/Th2細(xì)胞因子的變化情況。結(jié)果 健康對照組以及CHB組外周血循環(huán)中的IFNγ、IL4、TNFα以及IL6較ACHBLF顯著降低(P=0.016、0.020、0.017、0.018)。IL2和IL10在健康組和CHB組中的含量與ACHBLF患者中的含量相比,差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。ACHBLF患者血清中的凝血酶原活動度(PTA)、總膽紅素(TBil)以及白蛋白(Alb)的含量與IFNγ、IL4、IL6以及TNFα的含量之間沒有顯著的相關(guān)性(P>0.05)。結(jié)論 可能ACHBLF患者病情發(fā)展與血清中的細(xì)胞因子IL6、IFNγ、IL 4以及TNFα有一定的相關(guān)性,沒有發(fā)現(xiàn)肝功能與上述細(xì)胞因子之間的相關(guān)關(guān)系。CBA可以應(yīng)用于對各種細(xì)胞因子的檢測。

    慢加急性乙型肝炎肝衰竭;流式細(xì)胞微球芯片捕獲技術(shù);細(xì)胞因子

    慢加急性乙型肝炎肝衰竭(ACHBLF),即由慢性乙型肝炎(CHB)發(fā)展而成的急性肝衰竭,屬于重型慢性乙型肝炎。ACHBLF的病死率高達70%,是慢性重型肝炎中比較常見的一種疾病,通常起病急,預(yù)后差。ACHBLF的具體發(fā)病機制目前尚未闡明,但是相當(dāng)復(fù)雜,很多的ACHBLF患者都是由于感染病毒,病毒在機體內(nèi)活動活躍,使機體的免疫力下降,繼而產(chǎn)生大面積的炎癥反應(yīng),進而導(dǎo)致病情加重。在機體免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用的輔助性T細(xì)胞(Th),通過誘導(dǎo)其它重要的免疫細(xì)胞的活化而在機體中發(fā)揮重要的作用。Th細(xì)胞可以分為兩個亞群,Th1和Th2亞群,這兩個亞群的細(xì)胞在正常情況下處于一定的平衡狀態(tài),Th1、Th2分泌的細(xì)胞因子相互抑制,使彼此都不會大幅度的升高或者降低。但是在病理情況下Th1、Th2常失衡。近年來,有研究發(fā)現(xiàn),肝細(xì)胞免疫損傷與乙型肝炎病毒(HBV)的持續(xù)性感染以及Th1、Th2的失衡有關(guān)。但目前對Th1、Th2產(chǎn)生的細(xì)胞因子的研究多采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA),該方法樣本需求量很大,每次又只能檢測一種因子,無法真實地反映各種細(xì)胞因子之間的聯(lián)系?,F(xiàn)代化的研究需要一種更加高效,低用量的方法來對細(xì)胞因子進行檢測。流式細(xì)胞微球芯片捕獲術(shù)(cytometric beadar ray,CBA)高通量、精確性高,最大的優(yōu)點是可以同時檢測很多種細(xì)胞因子。本研究通過運用CBA檢測患者Th1,Th2分泌的細(xì)胞因子的含量來探究患有ACHBLF患者的肝功能指標(biāo)與細(xì)胞因子變化的聯(lián)系。

    資料和方法

    一、臨床資料

    收集2014年1月到12月本院患有ACHBLF的患者35例,女6例,男29例。CHB患者18例,女8例,男10例。另外收集本院體檢中心的17名健康志愿者作為對照組,女7名,男10名?;颊呷朐? d后清晨空腹取靜脈血,檢測其HBV DNA,血液學(xué),HBV血清學(xué)標(biāo)志物以及肝功能等相關(guān)指標(biāo)。排除標(biāo)準(zhǔn)為藥物性肝病,病毒感染,自身免疫性疾病,酒精性肝病,原發(fā)性肝癌、惡性腫瘤以及合并甲、丙、戊型肝炎病毒感染。所有參與研究的志愿者以及患者,須確保在3個月內(nèi)沒有使用過免疫調(diào)節(jié)藥物。

    二、研究方法

    將Th1/Th2細(xì)胞因子的標(biāo)準(zhǔn)品溶解在2.0 m L稀釋液中,在室溫靜置15 min以后稀釋。稀釋方法:取300μL的稀釋液加入300μL的標(biāo)準(zhǔn)液,混勻,此時就是進行了1∶2稀釋。使用倍比稀釋依次進行1∶4,1∶8,1∶16,1∶32,1∶64,1∶128,1∶256以及1∶512的倍數(shù)進行稀釋。將6種捕獲了細(xì)胞因子的磁珠等體積混勻,取50μL于分析管里。依次加入50μL標(biāo)準(zhǔn)品、50μL血清樣本以及50μL藻紅蛋白,混勻以后避光室溫放置3 h。再加入1 m L的洗液,200×g離心5 min。加入300μL的洗液使磁珠懸浮,上儀器前震蕩3~5 s。分析采集的圖譜用Cell Quest軟件,而將分析結(jié)果換算成濃度則使用BD FACSComp軟件。Alb、ALT、TBil、PTA等均在本院檢驗中心檢測,而HBV DNA以及HBV血清學(xué)標(biāo)志物等均在本實驗室進行檢驗。

    三、統(tǒng)計學(xué)分析

    使用GraphPad Prism 5進行統(tǒng)計分析。使用ANOVA方差分析進行組間比較,運用(ˉx±s)的形式表示正態(tài)分布資料,用Pearson的方法進行臨床指標(biāo)與細(xì)胞因子的相關(guān)性分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    結(jié) 果

    一、健康對照者及患者的基本臨床資料

    對健康對照組、CHB組與ACHBLF組患者的臨床資料進行比較。在TBil、ALT以及HBV DNA方面的比較結(jié)果顯示,ACHBLF組的血清中TBil、ALT的含量明顯高于健康對照組和CHB組(P=0.023、0.012),HBV DNA低于其它兩組(P<0.001),見表1。

    表1 健康對照者及患者臨床基本資料

    二、健康對照組、CHB組以及ACHBLF組血清中Th1、Th2細(xì)胞因子含量的變化

    標(biāo)準(zhǔn)品共9個濃度點,整個過程由計算機自動處理,曲線的適配度在95%以上,曲線見圖1。

    三、CBA檢測健康對照者與患者細(xì)胞因子濃度對照

    對健康對照組、CHB組與ACHBLF組患者的血清細(xì)胞因子濃度進行比較。在IL10、IL6、IFNγ、TNFα、IL2以及IL4等方面的比較結(jié)果顯示,ACHBLF組的血清中含量明顯高于健康對照組和CHB組(P=0.014、0.018、0.016、0.017、0.015、0.020),見表2。

    四、ACHBLF患者血清中的IFNγ、TNFα及IL4、IL6與TBil、Alb及PTA的相關(guān)性分析

    ACHBLF患者中,反映肝功能與血清內(nèi)IFNγ、TNFα及IL4、IL6的含量無顯著相關(guān)性(P>0.05)。對TBil、Alb、PTA分別與IFNγ、IL4、IL6、TNFα的相關(guān)性進行了Spearman分析,統(tǒng)計結(jié)果見表3。

    圖1Th1、Th2細(xì)胞因子擬合曲線

    表2 CBA檢測健康對照與患者細(xì)胞因子濃度

    表3ACHBLF患者血清中IFNγ、TNFα及IL4、IL6 與TBil、Alb及PTA相關(guān)數(shù)據(jù)的r值

    討 論

    T淋巴細(xì)胞可以被分為不同種類,相同的種類又可以分為不同亞群[1]。不同種類的細(xì)胞之間依靠所分泌細(xì)胞因子的不同而相互促進,相互制約,包括調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)、Th2和Th1[2]。T淋巴細(xì)胞還在宿主移植排異、感染性及很多自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要的意義。近年來,已經(jīng)有很多研究表明,HBV和HCV的感染過程中有T淋巴細(xì)胞的參與,且在HBV感染中影響頗大的Th1和Th2可能影響HBV感染后機體的結(jié)局[3]。

    細(xì)胞因子在抵抗內(nèi)源性以及外源性的抗原和調(diào)節(jié)機體自身的狀態(tài)需求時起到非常重要的作用。細(xì)胞因子是由體內(nèi)的細(xì)胞合成以及分泌的多肽。現(xiàn)在檢測細(xì)胞因子的技術(shù)有3種:(1)分子雜交檢測;(2)生物活性檢測;(3)免疫學(xué)直接定量細(xì)胞因子[4]。目前最常用的檢測方法是ELISA,因生物活性檢測以及雜交檢測要求的實驗條件較高,不是所有的實驗室均能滿足其所需條件。ELISA具有經(jīng)濟,操作簡單等優(yōu)點,但同時也有缺點,它樣本需求量大,精確性低,且1次只能檢測1種細(xì)胞因子,耗時耗力。CBA是一種多重蛋白的液相定量檢測技術(shù),其基本原理為:首先要形成捕獲微球,具體做法是在微球上包被捕獲的不同熒光強度的抗體,接著和樣本溶液混合,樣本中能與微球上的抗體特異性結(jié)合的蛋白或者抗原就會結(jié)合到微球上,然后加入已經(jīng)熒光標(biāo)記過的檢測抗體,最后放上流式細(xì)胞儀對其進行檢測[5]。和傳統(tǒng)的ELISA法相比,CBA具有很多優(yōu)點:(1)所需的樣本量大大降低,為傳統(tǒng)檢測的1/6;(2)可以同時檢測很多種蛋白,因它是分別針對不同的抗體,且使用了在熒光強度方面各有不同的微球群;(3)穩(wěn)定性好,有效避免了酶聯(lián)放大技術(shù)容易出現(xiàn)的假陽性[6]。

    感染HBV的機體通過正常免疫應(yīng)答來抵御HBV的繼續(xù)入侵。在受到抗原刺激后,T淋巴細(xì)胞立即分化為Th和細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)。CTL主要通過分泌TNFα以及IFNγ等來清除病毒,通過介導(dǎo)非溶解細(xì)胞途徑,另一方面也可以通過溶解受感染的細(xì)胞來清除靶病毒[7]。由于Th1細(xì)胞主要產(chǎn)生IL2以及IFNγ,Th1細(xì)胞占優(yōu)勢時,有利于完全清除病毒[8]。Th2細(xì)胞分泌的IL4以及IL10等,可以介導(dǎo)體液免疫以及抑制Th1的細(xì)胞因子的產(chǎn)生,此時可以使病毒感染呈現(xiàn)緩慢的趨勢[9]。當(dāng)機體的免疫應(yīng)答異常以及病毒攻擊重癥肝炎患者時,患者體液免疫功能亢進、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞以及單核巨噬細(xì)胞的活性增高。此時CTL細(xì)胞增殖分化增多,大量炎癥細(xì)胞,特別是中性粒細(xì)胞,浸潤肝組織,使大量的肝細(xì)胞出現(xiàn)壞死。

    IL2必須與靶細(xì)胞膜表面的IL2受體raiL-2R結(jié)合才能發(fā)揮其正常的生物學(xué)功能[11]?;加蠥CHBLF的患者,細(xì)胞膜上sIL2R的含量與正常對照組相比顯著升高。sIL2R是活化的淋巴細(xì)胞膜上raiL-2R的a鏈,它和rai L-2R一樣,可以結(jié)合血液中的IL2,此時血液中的IL2本來含量已經(jīng)降低,加上sIL2R的競爭結(jié)合作用,封閉了細(xì)胞因子,使免疫系統(tǒng)功能紊亂加劇,免疫功能更加低下,病情加重[12]。而HBV,HCV等的持續(xù)感染使機體產(chǎn)生更多sIL2R,使很多淋巴細(xì)胞又被活化,且這種活化效應(yīng)是不正常的,會使病情惡化[12]。此時大量庫普弗細(xì)胞活躍增生,單核巨噬細(xì)胞大面積浸潤,IL6產(chǎn)生增多,而肝臟此時清除IL6的功能已經(jīng)減弱,清除效果不理想。

    在重癥肝炎中,IFNγ起到非常重要的作用。當(dāng)Th1呈現(xiàn)優(yōu)勢應(yīng)答時,IFNγ的表達水平較高,是引起肝細(xì)胞壞死的重要原因。重癥肝炎時,TNFα不僅可以通過細(xì)胞免疫激活體內(nèi)的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生更多的TNFα,還可以激活CTL細(xì)胞,激活其殺傷作用[13]。此外,它還可以使內(nèi)皮細(xì)胞損傷,通過中性粒細(xì)胞的粘附作用。本研究中,ACHBLF組患者的血清IFNγ以及TNFα顯著升高,而在CHB組以及健康對照組的血清中,IFNγ和TNFα的含量則非常低。通過分析,造成這一結(jié)果的原因可能是重癥肝炎時分泌了較多的IFNγ和TNFα,T細(xì)胞要清除病毒的感染,從而造成了大量肝細(xì)胞的損傷,也使HBV DNA的含量下降。另外一種可能的原因就是ACHBLF患者很容易合并感染,而TNFα是一種促炎因子,感染會使它的含量急劇升高[14]。TNFα和IL4相互協(xié)調(diào),共同介導(dǎo)炎癥的發(fā)展,兩者共同升高可以反映全身或者局部感染存在[15]。本研究證實,肝炎時TNFα的血清濃度變化趨勢與IL6與IL4相同,可能是由于肝炎患者多合并全身或者局部的感染,促炎因子的升高,發(fā)生級聯(lián)瀑布反應(yīng),但具體原因還有待進一步觀察。

    本研究分析了凝血因子全套指標(biāo)以及肝功能衰竭指標(biāo)ALb、TBil等與Th1、Th2細(xì)胞因子的關(guān)系,結(jié)果顯示兩者并無顯著的相關(guān)性(P>0.05)。同時可能由于機體啟動了免疫反應(yīng),使促炎因子和免疫抑制因子含量急劇升高,使Th1、Th2的變化不完全符合規(guī)律。CBA的特異性以及敏感性,還需要進一步的驗證。同時上述假設(shè)還需要擴大病例進行研究。由于本研究僅限于分析外周血中細(xì)胞因子的變化情況,但是外周血中的細(xì)胞因子具有多源性,所以它的含量變化并不能直接反映肝臟中Th1、Th2細(xì)胞因子的含量變化情況,因此有待進一步檢測肝臟中細(xì)胞因子的含量來反映患者的細(xì)胞因子變化情況。

    1李秋菊,黨二樂,呼蕾,等.天皰瘡和大皰性類天皰瘡患者外周血濾

    泡輔助性T細(xì)胞水平的研究.中華皮膚科雜志,2012,45:155-157.

    2戴娟,張光波,高楠,等.炎癥性腸病患者外周血輔助性T細(xì)胞1和

    輔助性T細(xì)胞17水平及其臨床意義.中華內(nèi)科雜志,2013,52: 375-378.

    3陶凱,沈飛霞,陳景海等.甲狀腺腫瘤患者中輔助性T細(xì)胞22及白細(xì)胞介素-22的變化及意義.中華實驗外科雜志,2015,32:147-150.

    4Zheng YB,Xie DY,Yan Y,et al.495 Clinical features and dynamic patterns during clinical course of acute-on-chronic hepatitis B liver failure can predict the prognosis of ACHBLF:a retrospective cohort study.J Hepatol,2012,56(Suppl 2):S194-S195.

    5Zheng YB,Huang ZL,Wu ZB.Dynamic changes of clinical features that predict the prognosis of acute-on-chronic hepatitis B liver failure:a retrospective cohort study.Int J Med Sci,2013,10:1658-1664.

    6崔亞杰,管玉潔,劉煒,等.兒童原發(fā)免疫性血小板減少癥患者外周血濾泡調(diào)節(jié)性和輔助性T細(xì)胞的變化.中華血液學(xué)雜志,2014,35:980-984.

    7陳勇,唐發(fā)清.乙型肝炎及其相關(guān)病變中FoxB1檢測和臨床意義.國際免疫學(xué)雜志,2013,36:476-479.

    8趙琳,張思敏,黃玲,等.乙型肝炎核心抗體半定量檢測值在乙型肝炎診斷治療中的應(yīng)用.中華傳染病雜志,2014,32:301-303.

    9Wang LY,Meng QH,Zou ZQ,et al.Increased frequency of circulating Th17 cells in acute-on-chronic hepatitis B liver failure.Dig Dis Sci,2012,57:667-674.

    10Gao S,Ji XF,Li F,et al.Aberrant DNA methylation of G-protein-coupled bile acid receptor Gpbar1 predicts prognosis of acute-on-chronic hepatitis B liver failure.J Viral Hepat,2015,22:112-119.

    11滿昌軍,董香玉.外周血T細(xì)胞亞群、IL-32、IL-6水平在乙型肝炎患者的表達及相關(guān)性分析.中國實驗診斷學(xué),2014,18:62-65.

    12劉映霞,楊桂林,劉瑯妮等.乙型肝炎患者自然殺傷細(xì)胞G2D受體差異表達及其臨床意義.中華傳染病雜志,2012,30:421-424.

    13郭永紅,周云,張穎,等.慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者Th1/h2細(xì)胞的細(xì)胞因子變化及與肝功能指標(biāo)的關(guān)系.檢驗醫(yī)學(xué),2014,29:274-278.

    14Lin B,Pan CQ,Xie D,et al.Entecavir improves the outcome of acute-on-chronic liver failure due to the acute exacerbation of chronic hepatitis B.Hepatol Int,2013,7:460-467.

    15Siddique A,Nelson JE,Aouizerat B,et al.Iron deficiency in patients with nonalcoholic fatty liver disease is associated with obesity,female gender,and low serum hepcidin.Clin Gastroenterol Hepatol,2014,12:1170-1178.

    2015-04-16)

    (本文編輯:易玲)

    710086 陜西 西安北車醫(yī)院內(nèi)科

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