微流控芯片中磁珠表面免疫反應(yīng)動力學(xué)研究

韓 雪， 龐代文， 張志凌

(武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，生物醫(yī)學(xué)分析化學(xué)教育部重點實驗室，湖北武漢 420072)

免疫分析因其靈敏度高、特異性好已成為生物分析中重要分析方法[1]，目前已在生化分析、臨床檢驗、環(huán)境監(jiān)測、食品安全等領(lǐng)域得到非常廣泛的應(yīng)用。微流控芯片具有微型化、集成化和便攜化的特點，將微流控芯片與免疫分析結(jié)合可以改善免疫分析性能，減少試劑和樣品消耗，縮短分析時間[2 - 4]。磁珠具有易于操控、比表面積大、偶聯(lián)效率高的特點[5]。在微流控非均相免疫分析中，磁珠作為固相載體已引起了廣大研究者的興趣。因此，了解微流控芯片中磁珠表面免疫反應(yīng)動力學(xué)行為對于免疫分析技術(shù)的改進與提高具有非常重要的意義，并可為設(shè)計和優(yōu)化芯片結(jié)構(gòu)提供參考。

本文建立了一種實時監(jiān)測微流控芯片中磁珠表面免疫反應(yīng)的方法。采用該方法探究了流速、分析物濃度等對磁珠表面偶聯(lián)的小鼠IgG與溶液中Cy3標記的羊抗小鼠IgG的反應(yīng)動力學(xué)的影響，并求出了磁球表面免疫反應(yīng)的結(jié)合速率常數(shù)和解離速率常數(shù)。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

Olympus IX-70型倒置熒光顯微鏡(日本);IIC-200型增強型電荷耦合器件(ICCD，Princeton Instruments);旋轉(zhuǎn)式恒溫振蕩器(太倉實驗設(shè)備廠)；恒流泵(保定蘭格恒流泵有限公司)。

Cy3標記的羊抗小鼠IgG，小鼠IgG，2-嗎啉乙磺酸(MES)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，均購于Sigma公司；牛血清白蛋白(BSA)購于BIOSHARP公司；磁珠購于AdemTech公司；聚二甲基硅氧烷(PDMS)購于GE Toshiba silicones公司；AZ400K，AZ9260購于AZ Electronic Materials公司；ITO玻璃購于深圳萊寶高科技股份有限公司。所有實驗用水均為超純水(18.2 MΩ·cm,美國Millipore公司)。

1.2 免疫磁珠的制備

免疫磁珠參考文獻方法[6,7]制備：取10 μL 300 nm羧基修飾的磁珠，用1×磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=7.4)洗滌，除去NaN3。將磁珠分散在含有EDC和NHS的MES溶液(pH=6.0)中活化30 min。用磁力架分離磁珠，去除上層清液后，加入12 μL 1 mg/mL小鼠IgG溶液和88 μL 1×PBS溶液，在搖床上于37 ℃、150 r·min-1孵育反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后，用磁力架分離，棄去上層清液，用1×PBS清洗3～4次，以除去未反應(yīng)的小鼠IgG。加入100 μL 1%BSA溶液，混勻后置于搖床上于37 ℃、150 r·min-1孵育30 min。磁力架分離后，分別用含有0.05%Tween的1×PBS清洗三次和1×PBS清洗一次。最后將偶聯(lián)有IgG的磁珠分散在含有1%BSA，0.05%NaN3的1×PBS溶液中，在冰箱中4 ℃保存?zhèn)溆?。依?jù)文獻方法[8]，測定得到每個磁珠表面平均偶聯(lián)約300個IgG分子。

1.3 含有鎳點陣的微流控芯片的制備

芯片設(shè)計圖如圖1a所示，主要包括兩部分：一是含有反應(yīng)通道的PDMS層，二是含有鎳點陣的ITO玻璃基底。芯片制作參考文獻方法[9]進行。

PDMS層制作步驟如下：在硅片上旋涂AZ50XT光刻膠，75 ℃烘4 min，再于105 ℃烘8 min，在掩模下紫外曝光35 s，顯影得硅陽模；將聚二甲基硅氧烷預(yù)聚體(A膠)和交聯(lián)劑(B膠)按10∶1比例混勻后澆注在硅陽模上，75 ℃固化3 h，即可得到帶有反應(yīng)通道的PDMS層，其反應(yīng)通道寬約31 μm，高約505 μm。

ITO玻璃上的鎳點陣圖案制作步驟如下：在ITO玻璃上旋涂光刻膠AZ9260， 75 ℃ 烘3 min，105 ℃烘5 min，在掩模下紫外曝光70 s后顯影；然后利用電鍍將鎳沉積在ITO玻璃上，依次用丙酮、乙醇、超純水洗去光刻膠，即得到含有鎳點陣的ITO玻璃。將A膠和B膠以15∶1的比例均勻混合后旋涂在帶有鎳點陣的ITO玻璃上，75 ℃固化1 h，即可得到表面覆蓋有PDMS的含有鎳點陣的ITO玻璃。鎳點陣由大小約為47 μm的正方形組成，正方形水平間距約為33 μm，垂直間距約為77 μm。將PDMS微流控芯片和含有鎳點陣的ITO玻璃在氧等離子器中處理1 min后，對準鍵合即得到實驗所用芯片。在外置磁鐵作用下，鎳點陣產(chǎn)生感應(yīng)磁場，捕獲磁珠形成磁珠陣列，可用于磁珠表面免疫反應(yīng)過程的實時監(jiān)測。當外磁場撤去時，鎳柱磁性消失，通過簡單沖洗即可更新芯片。

1.4 動力學(xué)實驗

動力學(xué)實驗步驟如下：(1)用含1%BSA的1×PBS的封閉液對通道進行封閉，流速5 μL·min-1。(2)封閉完成后用1×PBS沖洗通道，除去多余的封閉劑，流速5 μL·min-1。(3)通入偶聯(lián)有小鼠IgG的免疫磁珠溶液，在鎳點陣前端形成均勻穩(wěn)定的磁結(jié)構(gòu)，流速10 μL·min-1。(4)通入1×PBS溶液對進樣孔和通道進行清洗，除去進樣孔和通道中未被捕獲的磁珠，流速5 μL·min-1。(5)通入Cy3標記的羊抗小鼠IgG溶液。(6)采用ICCD在線實時監(jiān)測免疫磁珠表面熒光強度隨時間的變化。(7)用IPP軟件分析并處理實驗結(jié)果。

2 實驗原理

與常規(guī)免疫分析不同，微流控免疫分析通常以持續(xù)流方式將目標分析物運送到固相載體表面。微流控中免疫分析信號是固相表面免疫反應(yīng)過程和溶液中分析物傳質(zhì)過程共同作用的結(jié)果。將免疫磁珠通入微流控芯片，在外加磁場作用下形成均勻的磁珠陣列，在不同條件下通入Cy3標記的羊抗小鼠IgG與免疫磁珠反應(yīng)，用ICCD記錄芯片中磁珠表面熒光信號變化，通過分析即可研究不同因素對磁珠表面免疫反應(yīng)動力學(xué)的影響。芯片的設(shè)計、實驗原理和實驗流程見圖1。

圖1 芯片的設(shè)計圖(a)、實驗原理圖(b)和實驗流程圖(c)Fig.1 Schematic diagrams of the designed microfluidic chip(a), the heterogeneous immunoassay in a microfluidic channel(b) and the experimental process(c)

將含有Cy3標記的羊抗小鼠IgG(A)溶液以一定流速持續(xù)流過微流控芯片通道中偶聯(lián)小鼠IgG(B)的磁珠表面，磁珠表面的免疫反應(yīng)可表示為：

(1)

其中,A代表抗體，B代表抗原，AB為磁珠表面免疫復(fù)合物，kf和kr分別為結(jié)合速率常數(shù)和解離速率常數(shù)。

設(shè)注射泵中羊抗小鼠IgG初始濃度為[A0]，微流控芯片通道中羊抗小鼠IgG濃度為[A]，磁珠表面小鼠IgG的反應(yīng)位點濃度為[B]，磁珠表面免疫復(fù)合物的濃度為[AB]。由磁珠表面免疫復(fù)合物質(zhì)量平衡可知磁珠表面免疫復(fù)合物濃度為：

(2)

其中，DAB為免疫復(fù)合物的擴散系數(shù)，等號右邊第一項是磁珠表面免疫復(fù)合物的擴散項，室驗中此項可忽略。且溶液中A的濃度保持不變時，符合“Well-mixed”模式[10]，磁珠表面的反應(yīng)可視為準一級反應(yīng)，由于檢測信號熒光強度與抗原抗體復(fù)合物濃度正相關(guān)，因此磁珠表面反應(yīng)動力學(xué)方程可表示為：

(3)

其中，F(xiàn)(t)為磁珠表面的熒光強度，F(xiàn)max為磁珠表面所有小鼠IgG反應(yīng)位點都參與反應(yīng)時的熒光強度。由公式(3)可得：

(4)

其中,表觀速率常數(shù)kapp=kf[A0]+kr。

3 結(jié)果與討論

3.1 流速對磁珠表面免疫反應(yīng)動力學(xué)影響

圖2 流速對磁珠表面免疫動力學(xué)的影響Fig.2 Effect of flow velocity on immunoassay kinetics on magnetic bead surface

為了探究分析物的流速對磁珠表面免疫反應(yīng)動力學(xué)影響，在固定抗體濃度為1 nmol·L-1時，分別在流速為0、66.7、133.3、333.3、466.7、666.7、1 666.7、3 333.3 μm·s-1時進行實驗，相應(yīng)條件下得到的熒光強度歸一化后得到圖2。由實驗結(jié)果可知，注射泵中抗體濃度為1 nmol·L-1時，隨著流速的增加，磁珠表面熒光強度顯著增加，當流速增加到一定程度時，熒光強度不再隨流速的改變而變化。這是因為微流控芯片通道中磁珠表面熒光強度是流體中分析物傳質(zhì)過程和磁珠表面免疫反應(yīng)共同作用的結(jié)果[11]。分析物(抗體)以濃度c0進入通道并與磁珠表面的抗原發(fā)生免疫反應(yīng)。流速較小時，分析物補充較慢，此時反應(yīng)處于傳質(zhì)限制區(qū)域；當增加流速時，佩克萊數(shù)(對流項與擴散項的比值，Pe=uw/D，u為流速，w為混合長度，D為擴散系數(shù))增加，對流作用的比例增加，分析物得到較快補充，直至分析物的傳質(zhì)速率大于磁珠表面免疫反應(yīng)的速率，此時磁珠表面的免疫反應(yīng)不再受傳質(zhì)限制，進入反應(yīng)限制區(qū)域[11]，此時由于分析物補充充分，增大流速對反應(yīng)影響不大。由上述分析可知，當反應(yīng)在傳質(zhì)限制區(qū)域時，增大流速免疫反應(yīng)速率加快，能在較短的時間內(nèi)得到較大的檢測信號，然而這是以試樣的消耗為代價的，當樣品稀少時可以選擇較低的流速反應(yīng)較長的時間。

3.2 濃度對磁珠表面免疫反應(yīng)動力學(xué)影響

分別采用濃度為1、3、5、7、10 nmol·L-1的Cy3標記的羊抗小鼠IgG溶液，以666.7 μm·s-1的流速持續(xù)流過磁珠表面，得到相應(yīng)的熒光強度如圖3所示。由圖可知，隨著分析物濃度的增加，磁珠表面的熒光強度變大。由于流速為666.7 μm·s-1時抗體濃度≥1 nmol·L-1，磁珠表面的免疫反應(yīng)進入反應(yīng)限制區(qū)域，實驗條件滿足“Well-mixed”模式對于通道中分析物濃度保持不變的要求，實驗結(jié)果良好的符合“Well-mixed”模式。圖4為磁珠表面免疫反應(yīng)的結(jié)合率(Binding%)在不同濃度下隨時間的變化。結(jié)合率為每點的熒光強度與理論擬合得到的反應(yīng)平衡時最大熒光強度的比值。由圖可知，反應(yīng)相同時間，分析物濃度越大，反應(yīng)達到平衡所需時間越短。

圖3 抗體濃度對磁珠表面免疫反應(yīng)動力學(xué)的影響Fig.3 Effect of antibody concentration on immunoassay kinetics on magnetic bead surface

圖4 不同濃度抗體的結(jié)合率隨時間的變化Fig.4 Plots of binding ratio vs time at different antibody concentrations

圖5 表觀速率常數(shù)隨濃度的變化Fig.5 Relationship between apparent rate constant and antibody concentration

3.3 結(jié)合速率常數(shù)和解離速率常數(shù)

表觀速率常數(shù)與濃度的關(guān)系見圖5。可知，當抗體濃度≥1 nmol·L-1，流速為666.7 μm·s-1時，磁珠表面的免疫反應(yīng)進入反應(yīng)限制區(qū)域。此時微流控芯片通道中分析物濃度保持不變，磁珠表面的免疫反應(yīng)可用準一級速率方程來描述，其中表觀速率常數(shù)為：kapp=kfc+kr。表觀速率常數(shù)與抗體濃度成正比，通過將不同濃度的抗體溶液持續(xù)流過微流控芯片通道中磁珠表面，即可求出免疫反應(yīng)的結(jié)合速率常數(shù)。由實驗結(jié)果可知kapp=7.9×104c+1.7×10-4·s-1，kf=7.9×104L·mol-1·s-1，kr=1.7×10-4s-1。

在不受傳質(zhì)限制的條件下，實驗發(fā)現(xiàn)在磁珠表面免疫反應(yīng)最初結(jié)合階段(0～600 s)，磁珠表面的熒光強度隨時間線性增大(圖6)。對前600 s的數(shù)據(jù)點進行線性擬合得到不同抗體濃度時的斜率值，然后將斜率(y)對相應(yīng)濃度(x)作圖。結(jié)果表明斜率值隨Cy3標記的羊抗小鼠IgG濃度增大而呈線性增長，線性方程為：y=0.15x+0.048，也就是說反應(yīng)開始10 min后就可以估計通入的抗體濃度。此方法可用于分析物濃度的初步確定。

3.4 濃度和流速對磁珠表面免疫反應(yīng)動力學(xué)共同影響結(jié)果

為評估不同抗體濃度在不同流速下對磁珠表面免疫反應(yīng)的影響，進行了如下實驗：采用濃度分別為1、10、100 nmol·L-1的分析物溶液，在流速分別為66.7、333.3、666.7 μm·s-1時進行實驗，直到磁珠表面的熒光強度不再變化，反應(yīng)達到平衡，記錄平衡時間。

由圖7可知，當分析物濃度為1 nmol·L-1，流速為667 μm·s-1時達到平衡所需時間僅為流速為66.7 μm·s-1時的40%左右。這是因為磁珠表面免疫反應(yīng)受傳質(zhì)限制影響大，增大流速有效減少傳質(zhì)限制，在這種情況下，選擇較大流速有利于實現(xiàn)快速檢測。當分析物濃度為100 nmol·L-1時，改變流速對達到平衡所需時間無明顯影響。這是因為磁珠表面免疫反應(yīng)受傳質(zhì)限制影響小，在這種情況下可以選擇小流速進行實驗，在減少試劑消耗的情況下達到同樣的反應(yīng)效果?？傊侠淼拇钆淞魉俸头治鑫餄舛葘τ趯崿F(xiàn)快速、低消耗檢測具有重要意義。

圖6 流速和濃度對磁珠表面免疫反應(yīng)共同作用結(jié)果Fig.6 Effects of flow rate and concentration on the immunoassay on magnetic bead surface

圖7 不同濃度的分析物前600 s內(nèi)熒光強度隨時間的變化Fig.7 Fluorescence intensity changes of different concentration analytes within the first 600 seconds

4 結(jié)論

本文建立了一種實時監(jiān)測微流控芯片中磁珠表面免疫反應(yīng)的方法。通過該方法探究了流速、分析物濃度對磁珠表面免疫反應(yīng)動力學(xué)的影響，并獲得了相關(guān)的結(jié)合速率常數(shù)和解離速率常數(shù)。實驗結(jié)果表明，增加流速可以有效減小傳質(zhì)限制，提高免疫反應(yīng)效率，但當流速增大到一定程度時，繼續(xù)增大流速對免疫反應(yīng)的貢獻較小，并且會增加試劑消耗。溶液中分析物濃度較大時，磁珠表面的免疫反應(yīng)速度快，流速大小對免疫反應(yīng)的影響不大，此時選擇較小的流速有利于減少試劑消耗；當溶液中分析物濃度較小時，增大流速有利于分析物的快速補充，可以有效地縮短分析時間。因此根據(jù)實驗條件選擇合理的流速有利于實現(xiàn)快速、低消耗檢測。