肖永華*, 梁高道, 革麗亞, 黃常剛, 王 勝, 麥 琦
(武漢市疾病預防控制中心,湖北武漢 430022)
全氟化合物(Perfluorinated Compound,PFCs)是一類氟化有機物,它具有疏水、疏油、熱穩(wěn)定性及化學穩(wěn)定性好、表面活性高,已廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)與消費領(lǐng)域。有報道稱含氟聚合物生產(chǎn)廠以及污水處理廠是全氟化合物的主要污染源[1]。研究表明,PFCs在魚肉、蝦、豬肉、雞蛋以及飲用水中均有檢出,同時PFCs具有很高的穩(wěn)定性,在環(huán)境中不易被降解,進入生物體后會隨著食物鏈不斷累積,而人類處于食物鏈的最末端,所攝入的PFCs要遠遠高于其他生物體。毒理學研究表明,PFCs在一定劑量下具有肝毒性、免疫毒性、神經(jīng)毒性、內(nèi)分泌干擾效應(yīng)及潛在致癌性等多種毒性效應(yīng)[2]。隨著PFCs的污染越來越受到重視,因此通過檢測人體血清中PFCs的含量來評價人群PFCs的暴露具有重要的意義。
目前檢測PFCs大多采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[3 - 18],其優(yōu)點是抗干擾能力強、選擇性好、靈敏度高,在檢測痕量PFCs時具有顯著的優(yōu)勢。在樣品處理時采用較多的有石墨化炭黑分散萃取[2]、酸水解[3]、堿水解[4]、離子對試劑提取[5]以及聚酰胺粉提取[6]等。在上述研究的基礎(chǔ)上,本實驗采用酶解法來提取血清中PFCs,提取液經(jīng)沉淀蛋白以及WAX固相萃取小柱凈化后,采用超高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法測定。該方法能有效地去除基質(zhì)干擾,穩(wěn)定性好,準確度高,可作為評價人群PFCs暴露的重要技術(shù)支撐。
UPLC-TQD超高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國,Waters公司),配備電噴霧離子源(ESI)及Masslynx4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng);AL204電子天平(瑞士,Mettler Toledo公司);固相萃取裝置(美國,Agilent公司);氮氣吹干儀(美國,Organomation Associates公司);渦旋儀(德國,IKA公司);電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學儀器有限公司);低速臺式離心機(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)。
標準品:全氟己烷磺酸(PFHxS)、全氟庚酸(PFHpA)、全氟辛酸(PFOA)、全氟辛烷磺酸(PFOS)、全氟壬酸(PFNA)、全氟癸酸(PFDA)、全氟十一酸(PFUnDA),均購自Sigma-Aldrich公司;內(nèi)標:13C4全氟辛酸(MPFOA)、13C4全氟辛烷磺酸(MPFOS),均購自美國Sigma公司。β-葡萄糖醛苷酶(美國Sigma公司);甲醇、乙腈(色譜純,美國天地公司);NaAc、NaOH、NH4Ac(分析純,國藥集團化學試劑有限公司);HClO4(優(yōu)級純,天津市東方化工廠);氨水(分析純,開封東大化工有限公司試劑廠);WAX固相萃取小柱(60 mg,3 mL,美國Waters公司)。實驗用水為超純水。
標準、內(nèi)標儲備液(100 mg/L):分別準確稱取0.0100 g全氟化合物標準品于100 mL棕色容量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度;內(nèi)標用甲醇溶解,轉(zhuǎn)移至100 mL棕色容量瓶中,-18 ℃冷凍保存。標準、內(nèi)標中間液(1 mg/L):分別準確吸取1.00 mL儲備溶液于100 mL棕色容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,4 ℃保存。內(nèi)標工作液(50 μg/L):準確吸取5.00 mL內(nèi)標工作液于100 mL棕色容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,4 ℃保存。標準工作液:臨用時將標準中間液稀釋至合適濃度標準系列,標準系列中內(nèi)標濃度均為5 μg/L。
稱取1.00 g血清樣品于15 mL離心管中,加入5.0 mL 0.2 mol/L的NaAc緩沖溶液以及100 μL內(nèi)標工作液,充分混勻,再加入50 μLβ-葡萄糖醛苷酶,混勻后,于溫度37 ℃酶解提取12 h。在提取液中加入200 μL HClO4,充分渦旋后離心10 min,將上清液轉(zhuǎn)移至另一15 mL離心管中,用NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH值至中性。
將WAX固相萃取小柱分別用3 mL甲醇和3 mL水活化后,取提取液過柱,用5 mL 50%甲醇水溶液淋洗,最后用5%氨水甲醇溶液洗脫,洗脫液經(jīng)氮氣吹干后用1.0 mL甲醇溶解,以0.22 μm濾膜過濾后,用超高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜儀進行分析。
1.4.1色譜條件色譜柱:ACQUITY UPLC?HSS C18柱(100×2.1 mm,1.8 μm);流動相:A:乙腈,B:5 mmol/L NH4Ac緩沖溶液。梯度洗脫程序:0~3.0 min,30%~70%A;3.0~6.0 min,70%A;6.0~6.1 min,70%~30%A;流速:0.2 mL/min;柱溫:30 ℃;進樣量:10 μL。
1.4.2質(zhì)譜條件離子源:電噴霧(ESI),負離子模式;毛細管電壓:-2.3 kV;脫溶劑氣溫度:350 ℃;離子源溫度:120 ℃;掃描模式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)。采用質(zhì)譜直接進樣的方式優(yōu)化各全氟化合物的采集參數(shù),7種全氟化合物及2種內(nèi)標的MRM參數(shù)見表1。
表1 7種全氟化合物及2種內(nèi)標的MRM參數(shù)Table 1 The MRM parameters of 7 PFCs and 2 internal standards
圖1 7種全氟化合物及2種內(nèi)標的總離子流色譜圖(TIC)Fig.1 TIC of 7 PFCs and 2 internal standards 1,2:PFHxS,PFHpA;3,4:MPFOA,PFOA;5,6,7.PFOS,MPFOS,PFNA;8:PFDA;9:PFUnDA.
實驗比較了甲醇-NH4Ac緩沖溶液和乙腈-NH4Ac緩沖溶液兩種體系的分離效果、靈敏度以及背景干擾。結(jié)果表明,在這兩種體系中,PFCs各組分峰形良好,靈敏度沒有明顯差異。但在甲醇-NH4Ac緩沖體系中,PFNA、PFOA以及PFHxS存在背景干擾現(xiàn)象,而乙腈-NH4Ac緩沖體系中沒有明顯的背景干擾,因而本實驗選擇乙腈-NH4Ac緩沖溶液體系作為流動相。PFCs各組分的總離子流色譜圖見圖1。
文獻報道樣品處理時采用較多的有酸水解、堿水解、離子對試劑提取以及石墨化炭黑分散萃取等。由于PFCs與蛋白結(jié)合在一起,常規(guī)的乙腈沉淀蛋白不能有效地提取血清中的PFCs,在回收率實驗中,血清樣品加入7種全氟化合物及2種內(nèi)標后,通過乙腈沉淀蛋白,離心后取上清液直接測定時7種全氟化合物及2種內(nèi)標的響應(yīng)值均明顯降低,回收率均小于50%。因而本實驗首先利用酶解的方法使與蛋白相結(jié)合的PFCs 釋放出來,再加入HClO4沉淀蛋白質(zhì),離心后上清液用NaOH溶液調(diào)節(jié)至中性,將溶液過WAX固相萃取小柱,用3.0 mL 50%甲醇水溶液淋洗小柱,最后用3.0 mL 5%氨水甲醇溶液作為洗脫液洗脫小柱所吸附的PFCs(本實驗曾分別用3.0 mL 5%氨水甲醇溶液洗脫兩次,結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有PFCs組分均在第一次被完全洗脫下來),洗脫液經(jīng)氮氣吹干后用1.0 mL甲醇復溶。
全氟羧酸類化合物PFHpA、PFOA、PFNA、PFDA、PFUnDA以MPFOA為內(nèi)標,全氟磺酸類化合物PFHxS、PFOS以MPFOS為內(nèi)標,7種全氟化合物在1.0~50.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)均在0.995以上;在血清樣品中添加濃度為25 μg/kg的7種全氟化合物標準,內(nèi)標MPFOS和MPFOA的添加濃度均為5 μg/kg,分別做6個加標平行樣和2個血清本底,7種全氟化合物的平均回收率為74.0%~105.6%,結(jié)果見表2。通過逐級稀釋法來確立本方法的檢出限,當7種PFCs進樣濃度為0.05 μg/L時,7種PFCs的信噪比均大于3,經(jīng)回收率校正后,選擇0.1 μg/kg作為本方法7種PFCs的檢出限。
表2 7種PFCs的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及回收率(n=6)Table 2 Regression equations,linear ranges,correlation coefficients and recoveries of 7 PFCs(n=6)
隨機選擇24位本單位健康體檢人群的血清樣品測定PFCs,結(jié)果表明:PFHxS、PFOA、PFNA、PFOS、PFDA、PFUnDA均有檢出。PFOA、PFNA、PFOS、PFDA、PFUnDA檢出率均為100%,其中PFOA和PFOS的含量要遠高于其他4種PFCs。血清中PFHpA均未檢出,檢出情況詳見表3。血清樣品中PFOA和PFOS多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)色譜圖見圖2。
圖2 人體血清樣品中PFOA和PFOS多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of PFOA and PFOS in human serum samples
表3 人體血清樣品中7種PFCs的測定結(jié)果Table 4 Determination results of 7 PFCs in human serum samples
隨著食物鏈的富集,人體中的PFCs含量要遠高于環(huán)境以及食品中PFCs的含量,如何通過保護以及改善環(huán)境來控制和降低人群PFCs的攝入量,需要引起更多人的重視。本文通過對樣品前處理、色譜以及質(zhì)譜條件的優(yōu)化,建立了固相萃取-超高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法測定人體血清中7種PFCs的分析方法。該方法靈敏度高,準確度好,可作為人群PFCs暴露監(jiān)測的技術(shù)支撐。