液液微萃取-氣相色譜/質(zhì)譜法測定黃酒麥曲中揮發(fā)性酸及香草醛

莫新良， 徐 巖， 范文來

(1.浙江工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江紹興 312000；2.江南大學(xué)釀酒科學(xué)與酶技術(shù)中心釀酒微生物與應(yīng)用酶學(xué)實驗室，教育部工業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫 214122)

黃酒是我國的一種傳統(tǒng)發(fā)酵酒，因其營養(yǎng)豐富且風(fēng)味獨特而深受人們喜愛。麥曲是黃酒釀造的動力，是黃酒發(fā)酵的糖化發(fā)酵劑，具有“糖化、發(fā)酵、生香”功能，被稱作“酒之骨”[1]。通常來說，黃酒風(fēng)味的好壞很大程度上由麥曲質(zhì)量的優(yōu)劣決定，而麥曲的風(fēng)味香氣成分直接影響麥曲的質(zhì)量[2]。傳統(tǒng)的提取固體基質(zhì)中香氣物質(zhì)的方法有索氏提取[3]，但具有消耗大量溶劑、費時及效率低等缺點。為此，研究者們開發(fā)了分析固體樣品的新技術(shù)，如加壓溶劑提取[4]、微波輔助提取[5]和超聲輔助提取[6]等。其中，超聲提取技術(shù)具有省時、無需加熱及高得率等優(yōu)點，能夠加速固體基質(zhì)中成分的浸出、提取[7]。

麥曲揮發(fā)性香氣成分含量甚微，需要先對樣品進行濃縮預(yù)處理。常見的有：液-液萃取法[8]、固相萃取法[9]、固相微萃取(SPME)法[10]等。其中，SPME法在食品行業(yè)的應(yīng)用較為廣泛。本課題組曾用SPME-氣/質(zhì)(GC/MS)聯(lián)用方法系統(tǒng)地分析了麥曲中的香氣物質(zhì)。盡管SPME法具有非常多的優(yōu)點，但對麥曲中一些極性極強的物質(zhì)，如揮發(fā)性酸及香草醛等物質(zhì)的萃取效果卻不盡人意，有些揮發(fā)酸即使能被檢測出，但回收率很低[10]。目前，對食品中有機酸的分析應(yīng)用較多的有高效液相色譜法[11]和氣相色譜法[12]。液-液微萃取法通過少量的溶劑一步萃取，能夠快速地萃取基質(zhì)中的強極性物質(zhì)[13,14]。本研究采用超聲提取和液-液微萃取富集，并結(jié)合GC-MS法實現(xiàn)了快速分析黃酒麥曲樣品中揮發(fā)性酸及香草醛。

1 實驗部分

1.1 主要儀器、試劑及材料

Agilent 6890-5973氣-質(zhì)聯(lián)用儀(美國，Agilent公司)；J-E高速冷凍離心機(美國，Beckman公司)；MPS2自動進樣器(德國，Gerstel公司)；D -78224超聲水浴清洗器(德國，Elma公司)。

標準品：乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、3-甲基丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、香草醛和2-丙烯酸均為色譜純(純度>99%)，4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮為色譜純(純度>98%)，均購自美國Sigma-Aldrich公司。NaCl、CaCl2、(NH4)2SO4、二氯甲烷和乙醚為分析純，購自中國醫(yī)藥(集團)上海化學(xué)試劑公司。無水乙醇為色譜純，購于美國TEDIA試劑公司。實驗用水為Milli-Q超純水。

黃酒麥曲樣品均由黃酒廠提供，包括傳統(tǒng)腳踏曲(JT)和機制麥曲(JX)。來自浙江地區(qū)的3個廠家的麥曲樣品分別命名為ZJ-1-JT、ZJ-1-JX、ZJ-2-JX、ZJ-3-JX；江蘇地區(qū)的2個廠家的麥曲分別名為JS-1-JX、JS-2-JX；上海地區(qū)的麥曲分別命名為SH-JT、SH-JX。

1.2 實驗方法

1.2.1標準溶液的配制準確稱取一定量上述標準品，用無水乙醇配制得到混合標準儲備液，儲存于4 ℃ 冰箱中備用。再取一定量混合標準儲備液加入到模擬麥曲中，配制成系列濃度梯度的混合標準溶液。內(nèi)標溶液為2-丙烯酸和4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮，用無水乙醇配制，濃度分別為8.71 mg/L和155.5 μg/L。模擬麥曲采用煮沸的超純水配制，用乳酸將pH值調(diào)整到6.4。

1.2.2樣品前處理取10 g麥曲樣品，加入0.1 g CaCl2和20 mL 10%乙醇，超聲浸提30 min，以8 000 r/min、4 ℃離心10 min,取上清液，重復(fù)兩次，合并上清液，取20 mL于50 mL離心管中，加9.0 g(NH4)2SO4和10 μL濃度分別為8.71 mg/L和155.5 μg/L的2-丙烯酸和4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮的混合內(nèi)標溶液，用1 mL重蒸乙醚溶劑萃取，吸取有機相，用于GC-MS分析。

1.2.3GC-MS分析GC條件：CP-Wax色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度為250 ℃；進樣量1 μL，不分流進樣；載氣He，流速2 mL/min；升溫程序：80 ℃保持2 min，以10 ℃/min的速度升溫至230 ℃，保持15 min。MS條件：EI電離源，電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃，傳輸線溫度280 ℃；質(zhì)譜檢出溶劑延遲180 s，質(zhì)量掃描范圍30～550 amu，采集頻率100 spectrums/s。

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲提取參數(shù)的優(yōu)化

2.1.1超聲時間的選擇實驗分別選擇0、10、20和30 min四個不同的超聲時間來考察其對麥曲中香氣物質(zhì)浸提的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著超聲時間的延長，揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積相應(yīng)增加，但兩者并不呈線性關(guān)系，當(dāng)超聲時間超過30 min后，揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積并未增加相反有所下降，故本實驗選擇30 min超聲時間為最佳浸提時間。

2.1.2乙醇濃度的選擇溶劑對麥曲香氣物質(zhì)的浸提和后續(xù)的萃取有很大的影響作用。分別選取0、10%和20% 3個不同濃度的乙醇溶液對麥曲進行浸提后，用乙醚進行液-液微萃取。結(jié)果表明，當(dāng)乙醇濃度為10%時，萃取效果最好。

2.2 液-液微萃取參數(shù)的優(yōu)化

2.2.1萃取溶劑的選擇由于所要分析的揮發(fā)性酸及香草醛均為極性較強的物質(zhì)，根據(jù)“相似相溶”原理，考察了極性較強的溶劑如乙醚、二氯甲烷和乙醚∶二氯甲烷=1∶1(V/V)的混合溶劑對各成分萃取效果的影響(取峰面積值做比較)。結(jié)果表明，乙醚對香氣成分萃取效果比乙醚∶二氯甲烷=1∶1(V/V)和二氯甲烷好。因此，選擇乙醚作為萃取溶劑。

2.2.2鹽種類及離子強度對萃取效果的影響在萃取復(fù)雜樣品基質(zhì)中的揮發(fā)性物質(zhì)時，常利用鹽析效應(yīng)來提高萃取效果。本研究考察了樣品中添加NaCl和(NH4)2SO4，或不添加鹽類的影響。結(jié)果顯示，添加了鹽后總的吸附結(jié)果明顯優(yōu)于未添加鹽的結(jié)果，添加(NH4)2SO4時效果最佳。由于不同離子強度的鹽析效果影響較大，因此比較了(NH4)2SO4濃度分別為35%、45%和55%時的萃取效果。發(fā)現(xiàn)加入45%(NH4)2SO4時所有物質(zhì)的萃取效果最佳。

2.2.3萃取溶劑體積的選擇當(dāng)萃取溶劑乙醚的體積為1 mL時，為合適回收有機相及自動進樣的體積，而當(dāng)體積小于0.8 mL時，由于存在少量的乳化現(xiàn)象而使乙醚有機相的回收比較困難。因此，選擇1 mL 乙醚進行液-液微萃取。

2.3 揮發(fā)性酸和香草醛的總離子流色譜圖及定量離子的選擇

采用全掃描的方式(SCAN)對麥曲及標樣中揮發(fā)酸及香草醛進行檢測，其總離子流色譜圖見圖1。為消除其它雜質(zhì)峰的干擾，采用選擇特征離子的方法(SIM)對標準品和麥曲樣品中的相應(yīng)化合物進行掃描，化合物的選擇離子和定量離子的結(jié)果見表1。

圖1 揮發(fā)酸及香草醛標樣總離子流色譜圖(A)和麥曲樣品(B)的總離子流色譜圖 Fig.1 Total ionic chromatograms of the standards mixtures of organic acids and vanillin(A) and Wheat Qu sample (B)meanings of number 1-14 were the same as those described in Table 1.

2.4 標準曲線、檢出限及定量限

配制一系列濃度梯度的有機酸及香草醛混合標準溶液，對8個不同濃度梯度的混合標準溶液的每個濃度水平進行3次重復(fù)測定，所得數(shù)據(jù)取3次的平均值。根據(jù)內(nèi)標標準曲線法，以標準物質(zhì)和內(nèi)標物質(zhì)的峰面積之比(y)為縱坐標，以二者的濃度之比(x)為橫坐標，得到化合物標準曲線的回歸方程，檢出限和定量限等，結(jié)果見表1。

表1 揮發(fā)酸和香草醛的選擇離子、定量離子、標準曲線、線性相關(guān)性系數(shù)、回收率、相對標準偏差、檢出限及定量限Table 1 Selected ions,quantative ions,calibration curves,correlation coefficients(R2),recoveries,relative standard deviations(RSDs),limits of detection(LODs) and limits of quantification(LOQs) of organic acids and vanillin

由表 1 可知，方法所定量的化合物的標準曲線的線性較好，線性相關(guān)系數(shù)R2在0.9988～0.9997之間?；衔锏幕厥章试?5.2%～109.2%之間，相對標準偏差(RSD)均在10%以內(nèi)，說明方法的準確度和 精密度較好，適于微量成分的分析。檢出限和定量限范圍分別為1.5～71.8 μg/L和5.0～237.7 μg/L，可滿足麥曲中相應(yīng)化合物的定性定量分析要求。

2.5 實際麥曲樣品中揮發(fā)酸及香草醛的定量分析

用本方法分別對來自江浙滬不同地區(qū)黃酒廠生產(chǎn)的麥曲樣品進行檢測，結(jié)果見表2。由表2可以看出，不同麥曲之間揮發(fā)酸及香草醛的含量差異較明顯。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，腳踏自然生麥曲ZJ-1-JT、SH-JT等中的揮發(fā)性有機酸及香草醛的總含量(含量在39 309.7～69 694.6 μg/kg)均高于機械自然生麥曲中的含量(含量在17 480.8～31 891.0 μg/kg)；浙江地區(qū)麥曲中揮發(fā)性有機酸及香草醛含量高于江蘇、上海地區(qū)相應(yīng)工藝生產(chǎn)的麥曲中的含量。由于人工踩曲，曲坯踩制是一個重復(fù)柔制的過程，因揉擠、搓壓、剪切力的共同作用，使得曲坯密而不實、松而不散、內(nèi)部均勻、且通透性好，使其能產(chǎn)生種類較多的有益微生物且分布均勻，因而其酶系和相應(yīng)的特征風(fēng)味物質(zhì)分布得也較為獨特；而機械制曲由于一次性將曲坯壓制而成，其曲坯過硬、過實、透氣性差，因而導(dǎo)致曲中有益微生物較少、分布不太均勻，導(dǎo)致酶系和風(fēng)味物質(zhì)分布各異[15]。由于麥曲是開放性自然發(fā)酵而成，每個地域的微生物差異較大，浙江地區(qū)可能有益麥曲發(fā)酵的微生物豐富而導(dǎo)致其生產(chǎn)的麥曲中的揮發(fā)性酸及香草醛等揮發(fā)性風(fēng)味成分含量高。由此不難推斷揮發(fā)性酸及香草醛這類風(fēng)味物質(zhì)在區(qū)分不同地區(qū)不同工藝麥曲的差異中起到了非常重要的作用。

表2 不同地區(qū)麥曲中揮發(fā)性酸及香草醛的含量(μg/kg)Table 2 Contents of organic acids and vanillin in different Wheat Qu samples(μg/kg)

3 結(jié)論

建立了液-液微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定不同麥曲中的揮發(fā)性有機酸及香草醛的分析方法，方法快速、簡便、重復(fù)性好、靈敏度高、定性定量準確。應(yīng)用該方法測定了不同地區(qū)不同工藝麥曲樣品，均能檢測出這些揮發(fā)性有機酸及香草醛，且腳踏自然生麥曲中的揮發(fā)性有機酸及香草醛的總含量均高于機械自然生麥曲中的含量，浙江地區(qū)麥曲中揮發(fā)性有機酸及香草醛含量高于江蘇、上海地區(qū)的含量。