氣調(diào)包裝醬鹵鴨翅貯藏過(guò)程中菌群結(jié)構(gòu)分析

葉可萍，劉　佳，劉　梅，李春保，郭成祥

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，食品安全與營(yíng)養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，國(guó)家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210095；2.南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京 211800）

氣調(diào)包裝醬鹵鴨翅貯藏過(guò)程中菌群結(jié)構(gòu)分析

葉可萍1，劉佳1，劉梅1，李春保1，郭成祥2

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，食品安全與營(yíng)養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，國(guó)家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210095；2.南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京 211800）

運(yùn)用傳統(tǒng)細(xì)菌平板培養(yǎng)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電脈方法研究氣調(diào)包裝醬鹵鴨翅15 ℃貯藏過(guò)程中微生物菌群結(jié)構(gòu)變化。細(xì)菌總數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果表明，產(chǎn)品生產(chǎn)的衛(wèi)生條件較好，細(xì)菌初始污染菌數(shù)較低（小于2（lg（CFU/g））），至貯藏第9天左右產(chǎn)品細(xì)菌總數(shù)超過(guò)4（lg（CFU/g））。變性梯度凝膠電脈指紋圖譜結(jié)果表明，貯藏初期產(chǎn)品的初始污染菌主要為不動(dòng)桿菌屬，至貯藏末期，產(chǎn)品中的主要菌群有嗜冷桿菌、莫拉氏菌、鏈球菌等，其中嗜冷桿菌屬成為產(chǎn)品貯藏末期的優(yōu)勢(shì)菌。

醬鹵鴨翅；氣調(diào)包裝；貯藏；菌群結(jié)構(gòu)；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電脈法

醬鹵肉類制品是我國(guó)傳統(tǒng)的一類肉制品，是指肉在水中加食鹽或醬油等調(diào)味料和香辛料一起煮制而成的一類熟肉類制品［1］，其主要特點(diǎn)是產(chǎn)品酥軟、色香味俱全，深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)［2］。近年來(lái)一些地方特色的醬鹵產(chǎn)品已成規(guī)?；a(chǎn)，如北京烤鴨、湖北周黑鴨、南京鹽水鴨、北京天福號(hào)的醬肘子、德州扒雞等。其中湖北傳統(tǒng)醬鹵鴨類產(chǎn)品以其入口微甜爽辣、吃后回味悠長(zhǎng)的獨(dú)特口味深受大眾的喜愛(ài)，在國(guó)內(nèi)有著廣泛的市場(chǎng)。而醬鹵鴨翅產(chǎn)品就是一種銷量較大的醬鹵鴨類產(chǎn)品，在許多工業(yè)化生產(chǎn)的企業(yè)中作為主要銷售產(chǎn)品。該產(chǎn)品通過(guò)先對(duì)原料肉焯水，加香辛料和調(diào)味料及水煮制，后再經(jīng)過(guò)攤涼、切割、氣調(diào)包裝等環(huán)節(jié)，完成產(chǎn)品的制作過(guò)程。但是，此類產(chǎn)品為帶有鹵液的熟肉制品，煮制后的包裝處理環(huán)節(jié)較多，生產(chǎn)出來(lái)的產(chǎn)品貨架期較短［3-4］，難以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)途運(yùn)輸和銷售，一定程度限制了醬鹵肉制品在與西式肉制品共存市場(chǎng)中的發(fā)展。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外許多即食肉制品采用氣調(diào)包裝、超高壓等保鮮技術(shù)來(lái)延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期，解決產(chǎn)品不易包裝和貯存運(yùn)輸?shù)膯?wèn)題。由于醬鹵鴨翅屬于中國(guó)傳統(tǒng)特色產(chǎn)品，無(wú)國(guó)外可借鑒的相關(guān)研究，而國(guó)內(nèi)對(duì)于醬鹵鴨類制品研究較少，主要集中在對(duì)醬鹵鴨肉制品的工藝改進(jìn)、貯藏特性變化（如硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid-reactive substances，TBARS）值、pH值、顏色、細(xì)菌總數(shù)等）、風(fēng)味物質(zhì)分析等［4-10］，如殷雪［5］通過(guò)傳統(tǒng)細(xì)菌計(jì)數(shù)方法對(duì)鹵鴨脖中不同屬細(xì)菌的消長(zhǎng)規(guī)律進(jìn)行了分析；海丹等［6］分析了氣調(diào)包裝醬牛肉貯藏過(guò)程中細(xì)菌總數(shù)、TBARS值、揮發(fā)性鹽基氮、pH值等品質(zhì)變化；謝彬［7］研究了真空包裝鹵鴨脖低溫微波殺菌和復(fù)合防腐劑最佳配比等綜合保鮮技術(shù)；段昌圣［3］研究了普通和真空包裝條件下醬鹵鴨脖的貯藏特性（包括細(xì)菌總數(shù)、品質(zhì)特性等）。

湖北傳統(tǒng)醬鹵鴨翅是禽肉制品中中式醬鹵制品的典型代表，主打開(kāi)袋即食的理念，使用阻隔性材料的氣調(diào)包裝方式已成為發(fā)展趨勢(shì)。氣調(diào)包裝（modified atmosphere packaging，MAP）就是近年來(lái)發(fā)展的一種新型包裝技術(shù)，即用阻氣性材料將肉類食品密封于一個(gè)改變了的氣體環(huán)境中，抑制腐敗微生物的生長(zhǎng)及生化活性，達(dá)到延長(zhǎng)貨架期的目的，由于該技術(shù)在保持食品原有的口感、色澤、形狀及營(yíng)養(yǎng)的同時(shí)，還能起到延長(zhǎng)保質(zhì)期的作用，已越來(lái)越受到食品生產(chǎn)者的青昧［11-14］。國(guó)內(nèi)對(duì)于傳統(tǒng)醬鹵肉制品氣調(diào)包裝的研究處于初級(jí)階段，對(duì)氣調(diào)包裝醬鹵產(chǎn)品中微生物的菌群結(jié)構(gòu)分析甚少，但此類研究是提高產(chǎn)品貨架期的依據(jù)。因此，本實(shí)驗(yàn)將醬鹵鴨翅氣調(diào)包裝，放置15 ℃條件下貯藏，在不同貯藏時(shí)期監(jiān)測(cè)氣調(diào)包裝產(chǎn)品中的氣體成分變化，并直接提取產(chǎn)品中細(xì)菌DNA，應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術(shù)，研究貯藏過(guò)程中微生物的生長(zhǎng)和菌群結(jié)構(gòu)變化規(guī)律，揭示貯藏末期產(chǎn)品的主要優(yōu)勢(shì)菌，為進(jìn)一步研究氣調(diào)包裝醬鹵鴨翅的保鮮措施提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

醬鹵鴨翅產(chǎn)品取自某醬鹵鴨類制品公司，該產(chǎn)品經(jīng)原料鴨翅、焯水、鹵制、攤涼、切割、氣調(diào)包裝等環(huán)節(jié)完成產(chǎn)品的制作過(guò)程，其中一個(gè)氣調(diào)包裝盒放置約300 g鴨翅，包裝盒內(nèi)充N2。

平板計(jì)數(shù)瓊脂 北京陸橋有限公司；瓊脂糖凝膠 西班牙Biowest公司；DNA提取試劑盒（離心柱型TIANamp Bacteria DNA Kit） 北京天根生物科技有限公司；PCR預(yù)混液、2倍GoTaq?Green Master Mix預(yù)混液 美國(guó)Promega公司；DNA Marker（DL2000 bp）、溶菌酶（100×）、Gelred（10 000×）、TAE電泳緩沖液（50×） 北京Solarbio科技有限公司；過(guò)硫酸銨國(guó)藥集團(tuán)；四甲基乙二胺 南京生興生物技術(shù)有限公司；引物均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.2儀器與設(shè)備

氣體比例測(cè)定儀 德國(guó)Witt公司；ICP500培養(yǎng)箱德國(guó)Memmert公司；均質(zhì)器 法國(guó)Interscience公司；J-E立式冷凍高速離心機(jī) 美國(guó)Beckman Coulter公司；9902型基因擴(kuò)增儀 美國(guó)Applied Biosystems公司；DY602S型穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀 南京生興生物技術(shù)有限公司；Ⅱ型凝膠成像儀 美國(guó)Bio-Rad公司；NANODROP-2000核酸蛋白分析儀 美國(guó)Thermo Scientific公司；MB-102金屬浴 杭州博日科技有限公司；HVE-50型高溫高壓滅菌鍋 日本株式會(huì)社平山制作所。

1.3方法

1.3.1生產(chǎn)過(guò)程微生物監(jiān)控

對(duì)工廠中醬鹵鴨翅生產(chǎn)過(guò)程的攤涼車、裝框人員手掌、裝產(chǎn)品框的內(nèi)袋、裝盒人員手掌等的細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群進(jìn)行監(jiān)控，了解產(chǎn)品生產(chǎn)中的衛(wèi)生條件。菌落總數(shù)測(cè)定按照GB 4789.2—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)：菌落總數(shù)測(cè)定》方法進(jìn)行；大腸菌群計(jì)數(shù)按照GB 4789.3—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)：大腸菌群計(jì)數(shù)》方法進(jìn)行。

1.3.2貯藏實(shí)驗(yàn)

取工廠生產(chǎn)的醬鹵鴨翅產(chǎn)品，由冷藏車運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，放置于15 ℃條件下貯藏，間隔不同時(shí)間取樣，測(cè)定樣品中細(xì)菌總數(shù)，每次實(shí)驗(yàn)作3 個(gè)重復(fù)。

1.3.3氣體比例測(cè)定

將氣體比例測(cè)定儀的探頭插入不同貯藏時(shí)間的產(chǎn)品氣調(diào)包裝盒中，測(cè)定其O2和CO2的氣體比例，每次實(shí)驗(yàn)作3 個(gè)重復(fù)。

1.3.4直接提取樣品中細(xì)菌DNA

取1.3.2節(jié)細(xì)菌總數(shù)測(cè)定中樣品前處理1∶10稀釋液30 mL于50 mL離心管中，800 r/min離心2 min后，吸取上清液，12 000 r/min離心10 min，取菌體沉淀，用2 mL生理鹽水淋洗取上清液，加入180 μL溶菌酶（20 mg/mL）緩沖液37 ℃處理1 h，后按照細(xì)菌DNA提取試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行，提取的細(xì)菌DNA經(jīng)Nano Drop蛋白核酸濃度定量?jī)x和1.2%瓊脂糖電泳驗(yàn)證后，置于－20 ℃冰箱凍存。

1.3.5細(xì)菌16S rRNA基因V3區(qū)PCR擴(kuò)增

采用巢氏PCR對(duì)提取的細(xì)菌16S rRNA基因V3可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，引物見(jiàn)表1。首先第一輪PCR利用8f/798r引物擴(kuò)增約800 bp的細(xì)菌16S rRNA基因序列，再以上述PCR產(chǎn)物為模板利用引物GC338f/518r對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因的V3區(qū)片段進(jìn)行第二輪的“touchdown”P(pán)CR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（50 ?L）：GoTaq?Green Master Mix（2×）25 ?L，引物各1 ?L（0.2 ?mol/L），DNA模板1 ?L，ddH2O 9.5 ?L。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min，然后采用touchdown PCR程序，即20 個(gè)循環(huán)（94℃變性1 min，退火溫度從65 ℃到55 ℃，退火30 s，72 ℃延伸3 min），之后于恒定退火溫度條件下進(jìn)行10 個(gè)循環(huán)（94 ℃變性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min），最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，置于－20 ℃冰箱凍存。

表1　實(shí)驗(yàn)中所用引物［1155］Table1　Primers used in this study

1.3.6DGGE分析

對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因V3區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行DGGE分析。采用Biorad Dcode apparatus電泳儀，聚丙烯酰胺凝膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%（丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺質(zhì)量比為37.5∶1），經(jīng)實(shí)驗(yàn)摸索確定變性梯度為32%～47%（100%變性劑含有7 mol/L尿素和40%甲酰胺），在0.5×TAE緩沖液中，60 ℃恒溫條件下，先200 V電壓下預(yù)電泳10 min，后在85 V電壓下電泳16 h。

電泳結(jié)束后，將DGGE膠片用Gelred染料（15 mL超純水+1 mol/L NaCl 5 mL+60 ?L Gelred染料）染色15 min。棄去染色液，再用ddH2O漂洗。染色后用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.3.7特殊條帶的序列測(cè)定和結(jié)果分析

將Gelred染料染色后的DGGE膠片置于紫外燈下，利用無(wú)菌刀片切下不同位置的條帶，分別放入滅過(guò)菌的1.5 mL離心管，加入20 ?L DEPC水置于4 ℃條件下過(guò)夜。取2 ?L作為模板以GC338f/518r為引物進(jìn)行16S rRNA基因V3區(qū)擴(kuò)增（條件同1.3.5節(jié)），PCR產(chǎn)物經(jīng)DGGE后證明與所割條帶位于相同的遷移位置，割膠回收，用不含GC夾板的338f/518r引物再次擴(kuò)增16S rRNA基因V3區(qū)序列，純化后測(cè)序（Invitrogen，上海）。登錄NCBI（www.ncbi.nlm.nih，gov/blast/），將所得序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列進(jìn)行相似性比對(duì)。

1.4數(shù)據(jù)處理分析

應(yīng)用Quantity One軟件對(duì)DGGE圖譜進(jìn)行分析，其中采用非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）進(jìn)行相似性分析。

2　結(jié)果與分析

2.1加工過(guò)程微生物監(jiān)控

通過(guò)對(duì)醬鹵鴨翅生產(chǎn)過(guò)程中攤涼車、裝框人員手掌、裝產(chǎn)品框的內(nèi)袋、裝盒人員手掌等產(chǎn)品二次污染的工藝點(diǎn)進(jìn)行細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群檢測(cè)，了解產(chǎn)品生產(chǎn)的衛(wèi)生環(huán)境情況，結(jié)果如表2所示。由表2可看出，產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中衛(wèi)生環(huán)境良好，4 個(gè)產(chǎn)品工藝點(diǎn)中的菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)量均較低，對(duì)產(chǎn)品不會(huì)產(chǎn)品較大污染。

表2　產(chǎn)品加工過(guò)程中各工藝點(diǎn)的細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群數(shù)量Table2　Total numbers of bacteria and coliforms at each process point during the production of products

2.2貯藏過(guò)程細(xì)菌總數(shù)變化

圖1　氣調(diào)包裝醬鹵鴨翅貯藏過(guò)程中細(xì)菌總數(shù)變化Fig.1　Changes in total number of bacteria of pot-stewed duck wings during storage

由圖1可知，醬鹵鴨翅的初始污染細(xì)菌數(shù)小于2（lg（CFU/g）），表明醬鹵鴨翅產(chǎn)品初始污染菌數(shù)較低，產(chǎn)品質(zhì)量控制較好。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品從第5天開(kāi)始細(xì)菌呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，至貯藏第9天左右產(chǎn)品細(xì)菌總數(shù)超過(guò)4（lg（CFU/g））。至產(chǎn)品貯藏第12天，細(xì)菌生長(zhǎng)減緩，數(shù)量為5（lg（CFU/g））以上。

2.3貯藏過(guò)程氣體比例變化

圖2　貯藏過(guò)程中醬鹵鴨翅包裝袋中氣體比例的變化Fig.2　Changes in gas proportion in the package of pot-stewed duck wings during storage

由圖2可知，產(chǎn)品中的氣體成分主要為N2，殘留少量的O2和CO2。產(chǎn)品貯藏初期，盒子內(nèi)O2產(chǎn)生消耗，CO2氣體急劇上升，這可能是由于需氧細(xì)菌的呼吸作用導(dǎo)致O2的消耗，釋放CO2；隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，O2體積分?jǐn)?shù)未發(fā)生較大變化，而CO2氣體比例逐漸升高，至第12天時(shí)達(dá)到1.5%以上，這可能是貯藏過(guò)程中厭氧細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境開(kāi)始生長(zhǎng)，無(wú)氧呼吸產(chǎn)生CO2，而隨著O2含量的減少，需氧細(xì)菌受到抑制；貯藏期間O2氣體比例在0.5%之間浮動(dòng)。

2.4 菌群多樣性

圖3　不同貯藏時(shí)間醬鹵鴨翅中細(xì)菌16S rRNA基因V3區(qū)DGGE圖譜Fig.3　DGGE profile of V3 regions of bacterial 16S rRNA genes from pot-stewed duck wings during different storage periods

表3　DGGE條帶分離的細(xì)菌16S rRNA基因序列鑒定Table3　DGGE bands identified by means of 16S rRNA gene sequencing

直接提取貯藏第1～12天的醬鹵鴨翅中細(xì)菌DNA，對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因V3區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析。由圖3和表3可知，醬鹵鴨翅貯藏從第1～12天，條帶數(shù)量和顏色發(fā)生了明顯變化，貯藏初期條帶相對(duì)復(fù)雜，條帶不明顯且亮度相對(duì)均一，主要條帶為條帶2（Acinetobacter sp.）、條帶5（Moraxella sp.）、條帶6（Acinetobacter junii）、條帶8（Streptococcus iniae）和條帶10（Acinetobacter sp.）；隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，由于細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境（包括氣體環(huán)境、溫度、鹽濃度、食品成分等）的能力不同，條帶5（Moraxella sp.）、條帶8（Streptococcus iniae）及條帶10（Acinetobacter sp.）逐漸加深，說(shuō)明這3 種菌在貯藏過(guò)程中逐漸增多，而條帶2（Acinetobacter sp.）在貯藏過(guò)程中逐漸變淡，說(shuō)明貯藏環(huán)境對(duì)部分Acinetobacter菌株有一定抑制作用；從第2天開(kāi)始檢測(cè)到條帶3（Psychrobacter arenosus）、條帶4（Chryseobacterium sp.）、條帶7（Bergeriella denitrificans）及條帶9（Psychrobacter arcticus）；第7天之后泳道中條帶明顯加深，至貯藏末期條帶3（Psychrobacter arenosus）、條帶5（Moraxella sp.）、條帶7（Bergeriella denitrifi cans）、條帶8（Streptococcus iniae）、條帶9（Psychrobacter arcticus）及條帶10（Acinetobacter sp.）成為主要優(yōu)勢(shì)條帶，其中條帶8（Streptococcus iniae）和條帶10（Acinetobacter sp.）在樣品貯藏過(guò)程中均存在，且條帶清晰明顯；貯藏第12天樣品還檢測(cè)到條帶1（Psychrobacter sp.）、條帶11（Kurthia sp.）和條帶12（Psychrobacter nivimaris）。

通過(guò)以上結(jié)果分析，醬鹵鴨翅產(chǎn)品在貯藏初期的初始污染菌群有不動(dòng)桿菌、莫拉氏菌及鏈球菌等，其中不動(dòng)桿菌為貯藏初期的主要菌群（條帶2、6、10）。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，由DGGE圖譜可看出大部分不動(dòng)桿菌未發(fā)生明顯變化（條帶10除外），部分條帶變淡，且貯藏末期未產(chǎn)生新的不動(dòng)桿菌菌株，說(shuō)明本產(chǎn)品受不動(dòng)桿菌初始污染，但可能受產(chǎn)品成分和環(huán)境條件的抑制，在貯藏過(guò)程中未見(jiàn)增長(zhǎng)。同時(shí)，產(chǎn)品貯藏末期主要菌群為嗜冷桿菌、莫拉氏菌、鏈球菌等，由DGGE圖譜發(fā)現(xiàn)嗜冷桿菌在產(chǎn)品初期未檢出，在貯藏過(guò)程中條帶出現(xiàn)并逐漸加深，最終成為貯藏末期的優(yōu)勢(shì)菌（條帶1、3、9、12）。

2.5相似性分析

圖4　氣調(diào)包裝醬鹵鴨翅16S rRNA基因V3區(qū)DGGE圖譜UPGMMAA相似性分析Fig.4　UPGMA cluster analysis of the DGGE profiles of the V3 region of bacterial 16S rRNA genes from pot-stewed duck wings

對(duì)DGGE圖譜采用UPGMA法進(jìn)行相似性分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。第1天的樣品與其他樣品不在同一簇中，相似性僅為65%，貯藏第12天的樣品也與其他樣品存在一定的差異，相似性小于75%。同時(shí)，貯藏前6 d和后6 d的樣品之間也存在一定不同，可進(jìn)一步表明產(chǎn)品貯藏前期與后期細(xì)菌相似性可能有所差異。

3　討 論

醬鹵肉制品是中國(guó)典型的傳統(tǒng)肉制品，通過(guò)氣調(diào)包裝來(lái)延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期已成為此類產(chǎn)品的發(fā)展趨勢(shì)。但是，此類產(chǎn)品的二次污染環(huán)節(jié)較多，導(dǎo)致產(chǎn)品中初始污染微生物種類和數(shù)量各不相同，對(duì)醬鹵肉制品的質(zhì)量安全產(chǎn)生重要影響。雖然許多醬鹵肉制品放置于低溫貯藏，但在初始污染的微生物中仍有許多嗜冷細(xì)菌的存在導(dǎo)致產(chǎn)品的腐敗，直接影響產(chǎn)品的質(zhì)量安全。同時(shí)，在產(chǎn)品的貯藏過(guò)程中細(xì)菌之間存在相互競(jìng)爭(zhēng)、拮抗、共生等作用，以適應(yīng)環(huán)境并促進(jìn)生長(zhǎng)和繁殖，從而構(gòu)成產(chǎn)品腐敗微生物的菌相。國(guó)內(nèi)外應(yīng)用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法和PCR-DGGE技術(shù)分析不同肉及肉制品中微生物的菌相變化已有相關(guān)報(bào)道，包括冷卻肉、發(fā)酵肉制品等［16-20］，對(duì)氣調(diào)包裝條件下醬鹵產(chǎn)品中微生物的菌群結(jié)構(gòu)了解甚少，因此，本實(shí)驗(yàn)以傳統(tǒng)醬鹵鴨翅為例，應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)分析醬鹵鴨翅15 ℃貯藏過(guò)程的菌群結(jié)構(gòu)變化。

醬鹵鴨翅的氣調(diào)包裝材料采用阻隔性較好的蓋膜（PE/EVOH/PE/黏合劑/OPP）和底膜結(jié)構(gòu)（APET/黏合劑/PE），可有效地阻隔外界空氣，保證產(chǎn)品包裝內(nèi)氣體成分的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，產(chǎn)品包裝盒內(nèi)氣體比例在貯藏過(guò)程中未發(fā)生很大變化，也證明包裝材料的阻隔性較好，可對(duì)產(chǎn)品中好氧細(xì)菌起到抑制作用。其中CO2含量在貯藏過(guò)程中有所升高，可能是由于產(chǎn)品中厭氧細(xì)菌的呼吸作用產(chǎn)生的。本實(shí)驗(yàn)傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)結(jié)果可看出，15 ℃貯藏條件下產(chǎn)品中的細(xì)菌在第5天左右度過(guò)遲滯期，開(kāi)始生長(zhǎng)，對(duì)不同初始污染菌數(shù)的樣品，該時(shí)間是一個(gè)影響產(chǎn)品貨架期的重要時(shí)間點(diǎn)。在本實(shí)驗(yàn)中，加工車間不同工序點(diǎn)微生物監(jiān)測(cè)結(jié)果表明此車間衛(wèi)生條件良好，可保證產(chǎn)品的初始污染菌數(shù)低，為了達(dá)到更好的貯藏效果，工廠在生產(chǎn)過(guò)程中嚴(yán)格控制產(chǎn)品初始污染菌量是非常必要的。但在本實(shí)驗(yàn)中，至貯藏第9天左右產(chǎn)品細(xì)菌總數(shù)超過(guò)4（lg（CFU/g）），之后可能超過(guò)GB 2726—2005《熟肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定醬鹵產(chǎn)品細(xì)菌總數(shù)80 000 CFU/g。

DGGE圖譜分析表明，不動(dòng)桿菌為氣調(diào)包裝醬鹵鴨翅的主要初始污染菌群，由于此類細(xì)菌在環(huán)境中廣泛存在，可能在產(chǎn)品煮制后的切割、包裝等環(huán)節(jié)存在二次污染，因此，工廠應(yīng)盡量控制加工環(huán)境衛(wèi)生，減少初始污染菌數(shù)。而嗜冷桿菌在貯藏過(guò)程中出現(xiàn)并生長(zhǎng)，最終成為貯藏末期的優(yōu)勢(shì)菌，說(shuō)明此類細(xì)菌能適應(yīng)產(chǎn)品的環(huán)境，是產(chǎn)品衛(wèi)生控制的關(guān)鍵細(xì)菌之一。有許多文獻(xiàn)［21-25］報(bào)道，嗜冷桿菌屬耐鹽且具有滲透耐壓性，含低溫酶使其適應(yīng)寒冷環(huán)境，因此在本產(chǎn)品中具有一定的致腐作用?，F(xiàn)有醬鹵鴨肉制品菌相變化的研究甚少，大部分文獻(xiàn)主要監(jiān)測(cè)醬鹵鴨肉產(chǎn)品貯藏過(guò)程中細(xì)菌總數(shù)的變化，僅見(jiàn)殷雪［5］通過(guò)傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法對(duì)真空包裝鹵鴨脖中的菌落總數(shù)、大腸菌群、嗜冷菌、耐熱菌、乳酸菌、假單胞菌、腸桿菌科等進(jìn)行監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)貯藏過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌主要為熱殺索絲菌、腸桿菌科、假單胞菌等，而本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用DGGE結(jié)合16S rRNA基因序列，分析氣調(diào)包裝醬鹵鴨翅的菌群多樣性，確定產(chǎn)品貯藏末期的優(yōu)勢(shì)菌群為嗜冷桿菌，為進(jìn)一步研究氣調(diào)包裝醬鹵鴨翅的保鮮措施提供一定的科學(xué)依據(jù)。

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Analysis of Microbial Communities of Pot-Stewed Duck Wings Packaged in Modified Atmosphere during Storage

YE Keping1， LIU Jia1， LIU Mei1， LI Chunbao1， GUO Chengxiang2
（1. Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition， National Center of Meat Quality and Safety Control，College of Food Science and Technology， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China；2. College of Food Science and Light Industry， Nanjing Technology University， Nanjing 211800， China）

The changes in microbial communities and counts of pot-stewed duck wings packaged in modified atmosphere during storage at 15 ℃ were explored by traditional bacterial cultivation and polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis （PCR-DGGE）. Results showed that the sanitation condition during the process of pot-stewed duck wings was favorable， which led to lower initial contaminant bacteria counts （＜ 2 （lg（CFU/g）） and total bacterial counts of products after about 9 days of storage were more than 4 （lg（CFU/g））. Results of DGGE profiles indicated that Acinetobacter sp. was the main bacterial species at the early stage. In contrast， the major bacteria in pot-stewed duck wings at the end of storage included Psychrobacter sp.， Moraxella sp.， Streptococcus sp. etc.， with Psychrobacter sp. being the most predominant spoilage bacterial species.

pot-stewed duck wings； modified atmosphere packaging （MAP）； storage； microbial community； PCR-DGGE

TS205

A

1002-6630（2015）14-0201-05

10.7506/spkx1002-6630-201514039

2015-04-10

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31401558）；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（KJQN201548）

葉可萍（1986—），女，講師，博士，研究方向?yàn)槿馄焚|(zhì)量安全控制。E-mail：kpye@njau.edu.cn