超高效液相色譜-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜快速篩查保健品中23 種非法添加西藥成分

張曉光，李　強(qiáng)，孫　磊，夏　靜，張　巖，*

（1.河北省食品檢驗(yàn)研究院，河北 石家莊 050091；2.河北省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050091）

超高效液相色譜-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜快速篩查保健品中23 種非法添加西藥成分

張曉光1，2，李強(qiáng)1，2，孫磊1，2，夏靜1，2，張巖1，2，*

（1.河北省食品檢驗(yàn)研究院，河北 石家莊 050091；2.河北省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050091）

建立基于超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜的快速篩查和確證保健品中可能非法添加的23 種降壓類(lèi)西藥成分的方法。樣品經(jīng)過(guò)甲醇提取，用Acquity UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）分離，以甲醇和體積分?jǐn)?shù)0.1% 甲酸溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，采用正、負(fù)離子同時(shí)切換的掃描模式，在9 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)23 種西藥成分 的檢測(cè)。在全掃描模式下測(cè)定目標(biāo)化合物的精確相對(duì)分子質(zhì)量，與理論精確相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)比，相對(duì)質(zhì)量偏差在 0.2×10－6～2.8×10－6之間，有效地去除了基質(zhì)干擾；建立了23 種西藥成分二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)23 種西藥成分的定性篩查及同步定量。添加水平為0.2、0.5 μg/kg和5.0 μg/kg時(shí)， 方法的回收率范圍在72.3%～118.2%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.5%～8.4%之間，檢測(cè)限在0.2～0.5 μg/kg之間。該方法可以作為降壓功效保健品中非法添加的西藥成分的高通量篩選和確認(rèn)檢測(cè)方法。

超高效液相色譜；靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)；降壓類(lèi)藥物；保健品

近年來(lái)，保健品產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展，其中用于輔助降壓的保健品尤為居多，根據(jù)我國(guó)食品衛(wèi)生法的相關(guān)規(guī)定，保健品中嚴(yán)禁添加任何西藥成分，但仍有部分生產(chǎn)廠家為追求利益，向具有降壓類(lèi)保健品中違規(guī)添加西藥成分?；颊咴诓恢榈那闆r下服用此類(lèi)保健品，可能會(huì)對(duì)身體造成心跳加速、頭疼、嘔吐、貧血、顱內(nèi)壓增高、傳導(dǎo)阻滯、出現(xiàn)幻覺(jué)、肝硬化等嚴(yán)重危害［1-3］。為遏制保健品中非法添加西藥的行為，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局于2009年頒布了降壓類(lèi)中成藥中非法添加化學(xué)藥物檢驗(yàn)方法，但該方法僅適用于7 種常見(jiàn)降壓藥物的檢測(cè)［4］。由于降壓類(lèi)新藥的不斷出現(xiàn)，非法添加的西藥成分越來(lái)越復(fù)雜，并且非法添加西藥成分種類(lèi)呈現(xiàn)擴(kuò)大趨勢(shì)，因此研究快速準(zhǔn)確篩查和精確定量降壓藥中非法添加西藥成分的方法是很有必要的。目前，對(duì)于降壓藥中非法添加的西藥成分的測(cè)定方法多為液相色譜法［5-6］、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［7-10］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［11］，檢測(cè)的非法添加西藥種類(lèi)較少，樣品前處理復(fù)雜，且由于儀器性能限制問(wèn)題，檢出限無(wú)法滿足要求，存在造成假陽(yáng)性誤判風(fēng)險(xiǎn)。

靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜是近來(lái)發(fā)展起來(lái)的新式的質(zhì)譜，它的原理是利用不同物質(zhì)在阱中運(yùn)動(dòng)軌跡不同而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的精確定量。它具有分辨率、靈敏度高的特點(diǎn)，能提供精確相對(duì)分子質(zhì)量，可一次性采集高通量的數(shù)據(jù)，滿足檢測(cè)需求，由此彌補(bǔ)傳統(tǒng)三重四極桿質(zhì)譜方法檢出限低、假陽(yáng)性誤判的不足；其數(shù)據(jù)依賴性掃描可以在篩查的同時(shí)，通過(guò)碎片離子進(jìn)行定性確證［12］。近年來(lái)靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜在食品農(nóng)藥及生物毒素檢測(cè)［13-17］、紡織品中禁用物質(zhì)檢測(cè)［18-19］、化妝品中激素檢測(cè)［20］、代謝組學(xué)［21-22］等領(lǐng)域已開(kāi)始應(yīng)用，但在降壓藥物檢測(cè)方面的應(yīng)用未見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)利用高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜快速檢測(cè)保健品中可能非法添加的23 種降壓西藥成分，采用全掃描和正、負(fù)離子切換模式進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)提取的二級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行定性，提取一級(jí)質(zhì)譜的精確相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行定量，利用基于母離子列表的數(shù)據(jù)依賴采集構(gòu)建二級(jí)質(zhì)譜庫(kù)保證了測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。該方法用實(shí)際添加實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，在較低質(zhì)量濃度添加水平條件下仍可以保證良好的檢測(cè)結(jié)果。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

保健品 市購(gòu)；23 種西藥標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%）中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、甲酸（色譜純） 德國(guó)Merck公司；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水；標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇配制，系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液用甲醇-水（1∶9，V/V）配制。

1.2儀器與設(shè)備

Q-Exactive四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜（配有H-ESI Ⅱ源）、Ultimate 3000液相色譜系統(tǒng) 美國(guó)Thermo Fisher Scientifi c公司。

1.3方法

1.3.1樣品前處理

準(zhǔn)確稱取一定量降壓類(lèi)保健品（固體樣品2.0 g、液體樣品5.0 g、膠囊狀態(tài)樣品除去囊殼后稱量），精確至0.01 g，于50 mL離心管中，加5 mL水、25 mL甲醇，40 ℃渦旋混勻，超聲提取15 min。冷卻后用甲醇定容至50 mL。10 000 r/min離心5 min，取上清液25 mL，于45 ℃水浴條件下氮?dú)獯蹈?。?zhǔn)確加入甲醇1.0 mL，渦旋30 s，過(guò)0.45 μm有機(jī)濾膜到進(jìn)樣瓶中，供液相色譜-質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.3.2儀器條件

1.3.2.1色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC BEH C18柱（50 mm× 2.1 mm，1.7 μm）。流動(dòng)相：A，甲醇；B，體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液。梯度洗脫，洗脫程序：0～0.5 min，10% A；0.5～3.0 min，10%～95% A；3.0～7.5 min，95% A；7.5～8.0 min，95%～10% A；8.0～9.0 min，10% A。流速0.30 mL/min；柱溫：室溫；進(jìn)樣體積2 μL；分析時(shí)間9 min。

1.3.2.2質(zhì)譜條件

電噴霧離子源溫度310 ℃；毛細(xì)管電壓3 800 V（正、負(fù)離子同時(shí)進(jìn)行模式）；一級(jí)質(zhì)譜駐留時(shí)間100 ms；二級(jí)質(zhì)譜駐留時(shí)間50 ms；質(zhì)量掃描范圍：m/z 200～700；分辨率（R）：70 000；掃描模式：全掃描+自動(dòng)觸發(fā)二級(jí)質(zhì)譜掃描；氣化溫度300 ℃；鞘氣壓（N2）35 arb；輔助氣壓（N2）10 arb；離子傳輸管溫度320 ℃；二級(jí)質(zhì)譜采用自動(dòng)觸發(fā)方式產(chǎn)生碎片離子，碰撞裂解氣為高純氮?dú)?，碰撞能量?5%。

2　結(jié)果與分析

2.1樣品的提取與色譜柱的選擇

樣品提取可以選擇的溶劑有水、甲醇、乙腈、乙醇等。根據(jù)23 種化合物的物理溶解性質(zhì)，決定采用水加有機(jī)溶劑的混合溶液作為提取溶劑，選取了具有代表性的固體樣品和液體樣品，加入23 種西藥成分混合標(biāo)準(zhǔn)品至1 μg/g，以1.3.1節(jié)方法進(jìn)行樣品前處理，以平均加標(biāo)回收率對(duì)比甲醇-水、乙腈-水、乙醇-水3 種溶劑體系，發(fā)現(xiàn)以甲醇-水作為混合溶劑提取時(shí)23 種西藥成分平均回收率相對(duì)較高，最終選取了甲醇-水混合溶劑進(jìn)行提取。在色譜柱的選擇方面，比較了不同類(lèi)型的C18反相色譜柱：Acquity UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）、Broshell 120 SB-C18柱（100 mm×3.0 mm，2.7 μm）、Hypersil Gold C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm），在相同的液相體系條件下，Acquity UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）和Broshell 120 SB-C18柱（100 mm×3.0 mm，2.7 μm）均能實(shí)現(xiàn)較好分離度，而Acquity UPLC BEH C18柱用時(shí)更短；從分離效果和出峰時(shí)間兩方面綜合考慮，最終選擇了Acquity UPLC BEH C18柱。

2.2快速篩查驗(yàn)證及譜庫(kù)的建立

2.2.1理論精確相對(duì)分子質(zhì)量的驗(yàn)證

正負(fù)離子掃描有不分段切換和分段切換2 種方式，在常規(guī)多目標(biāo)物定量分析時(shí)常采用正、負(fù)離子切換方式以提高分析檢測(cè)的通量。本方法為避免分段式采集容易出現(xiàn)的保留時(shí)間漂移導(dǎo)致漏檢的現(xiàn)象，提高篩查的準(zhǔn)確性，采用正、負(fù)離子切換不分段全掃描的方式，23 種降壓藥出峰圖譜見(jiàn)圖1，23 種降壓藥物色譜-質(zhì)譜檢測(cè)在9 min內(nèi)完成，同時(shí)保持較好的質(zhì)量精度。正、負(fù)離子同時(shí)采集的質(zhì)量精度見(jiàn)表1。

表1　23種化合物同時(shí)采集的質(zhì)譜分析參數(shù)Table1　Analytic parameters of 23 target compounds using UPLC Orbitrap MSap MS

表1中，23 種物質(zhì)中吲達(dá)帕胺、氫氯噻嗪、氯沙坦鉀為負(fù)模式掃描，其余均為正模式掃描。負(fù)模式掃描得到為［M－H］－圖譜，正模式掃描得到［M+H］+圖譜，鹽酸可樂(lè)定、鹽酸貝那普利、鹽酸哌唑嗪、鹽酸尼卡地平均為去掉［HCl］基團(tuán)精確相對(duì)分子質(zhì)量，馬來(lái)酸依那普利為去掉［C4H4O4］基團(tuán)得到的精確相對(duì)分子質(zhì)量；苯磺酸氨氯地平為去掉［C6H6O3S］基團(tuán)得到的精確相對(duì)分子質(zhì)量；酒石酸美托洛爾分子式以［C15H25NO3］計(jì)［23］，在分辨率為70 000的情況下，23 種降壓藥物精確度相對(duì)質(zhì)量偏差在0.2×10－6～2.8×10－6之間（表1），相對(duì)分子質(zhì)量變化較小，可以滿足根據(jù)保留時(shí)間，理論相對(duì)分子質(zhì)量和多電荷同位素特征峰對(duì)樣品進(jìn)行快速篩查［24-25］。

圖1　23種目標(biāo)化合物提取一級(jí)質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectra of 23 target compounds

2.2.2篩查準(zhǔn)確性的驗(yàn)證

采用Extract Finder軟件對(duì)保健品中西藥成分進(jìn)行初步篩查，首先構(gòu)建降壓類(lèi)藥物化合物列表，設(shè)置相應(yīng)的檢索參數(shù)，如保留時(shí)間、相對(duì)分子質(zhì)量偏差、二級(jí)質(zhì)譜匹配度等。軟件會(huì)計(jì)算實(shí)際樣品和理論標(biāo)準(zhǔn)品之間的分子離子的精確相對(duì)分子質(zhì)量偏差、同位素分布匹配度、同位素比例和保留時(shí)間偏差，綜合多個(gè)參數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)于檢索結(jié)果得分不小于70的化合物，本方法確認(rèn)其為陽(yáng)性樣品。

2.2.3基于二級(jí)質(zhì)譜圖庫(kù)的篩查方法的建立

使用高分辨質(zhì)譜分析藥物，只采集一個(gè)母離子不能滿足相關(guān)法規(guī)指令中規(guī)定的定性最低要求，必須進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描獲得足夠多的定性信息。圖2是23 種降壓藥物標(biāo)準(zhǔn)樣品的二級(jí)質(zhì)譜圖。利用Exact Finder軟件將23 種標(biāo)準(zhǔn)品的二級(jí)譜圖建立成二級(jí)質(zhì)譜庫(kù)，以保留時(shí)間、一級(jí)精確相對(duì)分子質(zhì)量、二級(jí)圖譜匹配度、同位素峰形匹配度等4 個(gè)指標(biāo)作為打分依據(jù)，將4 個(gè)指標(biāo)設(shè)定不同的閾值，實(shí)際樣品分析可以通過(guò)軟件進(jìn)行打分判定，綜合打分不小于70 分即判定為疑似陽(yáng)性樣品。

圖2　23種目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)樣品的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.2　Tandem mass spectra of 23 target compounds

2.3同步定量方法的線性范圍、檢測(cè)限、回收率和精密度

本方法在快速篩查的基礎(chǔ)上通過(guò)提取一級(jí)質(zhì)譜的精確相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行定量從而實(shí)現(xiàn)同步定量分析，無(wú)需陽(yáng)性樣品的重新定量分析。

以23 種降壓藥物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的質(zhì)量濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得到線性方程和相關(guān)系數(shù)。23 種分析物的線性方程相關(guān)系數(shù)均大于0.99。確定該方法的檢出限、定量限、線性方程、線性范圍具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

表2　23種化合物線性方程、檢測(cè)限及定量限Table2　Regression equations with correlation coefficients， LOD and LOQ for 23 target compounds

表3　23種降壓藥物的回收率和精確度Table3　Recoveries and RSDs of 23 target compounds spiked into blank matrix sample

在空白基質(zhì)中添加23 種降壓藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加水平分別為0.2、0.5 μg/kg和5 μg/kg，每個(gè)添加水平平行測(cè)定6 次，回收率范圍在72.3%～118.2%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）范圍為0.5%～8.4%；23 種降壓藥物在3 個(gè)水平條件下的回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

2.4實(shí)際樣品的測(cè)定

利用本方法對(duì)購(gòu)自超市的10 個(gè)不同品牌的10 份保健品進(jìn)行了篩查分析，均未檢出上述23 種降壓類(lèi)西藥成分。

3　結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜對(duì)保健品中可能非法添加的降壓類(lèi)藥物進(jìn)行測(cè)定，9 min內(nèi)可完成23 種降壓類(lèi)藥物的高通量篩選和確認(rèn)。高分辨率質(zhì)譜在樣品分析中消除了基質(zhì)干擾，提高了定性和定量的準(zhǔn)確性，自動(dòng)觸發(fā)全掃描二級(jí)質(zhì)譜進(jìn)一步提高了定性的準(zhǔn)確性。以精確相對(duì)分子質(zhì)量和二級(jí)質(zhì)譜圖為基礎(chǔ)，構(gòu)建了降壓類(lèi)藥物數(shù)據(jù)庫(kù)，建立了保健品中非法降壓類(lèi)藥物的快速篩查和確證方法。該方法靈敏度較高，并且自建的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)可以不斷擴(kuò)充。該方法作為一種快速篩選和確證檢測(cè)技術(shù)必將在保健品中非法添加物篩查和確認(rèn)中得到廣泛應(yīng)用。

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Rapid Screening and Confirmation of 23 Illicit Western Medicine Components in Health Food Products by Ultra High Performance Liquid Chromatography-Orbitrap High Resolution Mass Spectrometry

ZHANG Xiaoguang1，2， LI Qiang1，2， SUN Lei1，2， XIA Jing1，2， ZHANG Yan1，2，*
（1. Hebei Food Inspection and Research Institute， Shijiazhuang 050091， China；2. Key Laboratory of Food Safety of Hebei Province， Shijiazhuang 050091， China）

A high performance liquid chromatography-linear ion trap/orbitrap high-resolution mass spectrometry（Orbitrap MS） method was developed for rapid screening and detection of 23 illicit western medicine components with antihypertensive effi cacy in health foods. The samples were extracted with methanol， and the extracts were then separated on an Acquity UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm， 1.7 μm） using a binary solvent system composed of methanol and 0.1% formic acid in water by gradient elution. Both positive ion scan mode and negative ion scan mode were used to detect 23 western med icine components within 9 m inutes. The relative molecular masses of the target compounds were obtained in full scan mode with a relative deviation in the range of 0.2×10-6to 2.8×10-6compared to the theoretical value， indicating effective elimination of the matrix interference. Tandem mass spectrometric database based on characteristic fragment ions for the 23 western medicines was built. This method allowed qualitative screening and quantitative analysis at the same time. Recoveries of the proposed method were in range of 72.3%-118.2% at spike levels of 0.2， 0.5 and 5.0 μg/kg with relative standard deviations （RSDs） between 0.5% and 8.4%， and the limits of detection were between 0.2 and 0.5 μg/kg. As a high-throughput and confi rmatory method， it is useful for the determination of illicit western medicines as antihypertensive agents in health foods.

ultra high performance liquid chromatography （UPLC）； orbitrap high resolution mass spectrometry；antihypertensive medicines； health food products

TS207.3

A

1002-6630（2015）14-0187-05

10.7506/spkx1002-6630-201514036

2014-12-10

河北省科技條件建設(shè)項(xiàng)目（13965504D）

張曉光（1983—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：daniou2002@foxmail.com

張巖（1979—），男，高級(jí)工程師，博士，研究方向?yàn)榛瘜W(xué)生態(tài)學(xué)。E-mail：snowwinglv@126.com