果汁原漿中葡萄糖含量測(cè)定的酶電極設(shè)計(jì)

綦翠華，李一葦，張曉偉

（1.濟(jì)南大學(xué)酒店管理學(xué)院，山東 濟(jì)南 250022；2.山東省科學(xué)院生物研究所，山東省 生物傳感器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014；3.濟(jì)南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山東 濟(jì)南 250022）

果汁原漿中葡萄糖含量測(cè)定的酶電極設(shè)計(jì)

綦翠華1，李一葦2，3，張曉偉1

（1.濟(jì)南大學(xué)酒店管理學(xué)院，山東 濟(jì)南 250022；2.山東省科學(xué)院生物研究所，山東省 生物傳感器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014；3.濟(jì)南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山東 濟(jì)南 250022）

利用易于制備的水不溶性普魯士藍(lán)制備了介體摻入式絲網(wǎng)印刷電極，并以該電極作為電化學(xué)換能器制備葡萄糖氧化酶電極。電化學(xué)表征結(jié)果顯示，酶電極對(duì)葡萄糖的電流響應(yīng)特征良好，其線性范圍為8.0 μmol/L～2.2 mmol/L，檢測(cè)限達(dá)0.082 7 μmol/L（RSN=3），靈敏度為1.016 μA·L/mmol，響應(yīng)時(shí)間5 s，其抗干擾性能、穩(wěn)定性及重復(fù)性良好。實(shí)驗(yàn)還確定了該酶電極的最佳制備配方及工作條件。該電極制作簡(jiǎn)單、廉價(jià)，適用于成分復(fù)雜的果汁原漿的快速分析測(cè)試。

果汁原漿；葡萄糖；絲網(wǎng)印刷電極；工業(yè)應(yīng)用

果汁原漿是指用新鮮的水果榨成果漿的果汁，其與新鮮水果本身的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值接近，是果汁工業(yè)的重要原料或半成品，可作為各種不同濃度果汁的基料。果汁原漿中的糖類(lèi)含量是監(jiān)控其品質(zhì)及濃度的重要指標(biāo)之一。其中，單一組分糖類(lèi)物質(zhì)的檢測(cè)，對(duì)于果汁原漿類(lèi)產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)分析及改善、加工過(guò)程及產(chǎn)品質(zhì)量控制等具有重要意義。果汁原漿成分復(fù)雜，濃度高、黏度大，其單一成分的定量分析難度較大。目前，尚缺乏對(duì)果汁原漿單一糖分分析的相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。葡萄糖與其他重要糖類(lèi)如果糖、蔗糖、乳糖及海藻糖等一同作為水果及果汁原漿中的主要糖類(lèi)組分，在果汁類(lèi)產(chǎn)品的分析、評(píng)價(jià)中具有特殊意義［1］。迄今已發(fā)展出多種葡萄糖的檢測(cè)方法，如光學(xué)法［2-3］、色譜法［4］、酶法［5］等。這些方法雖然具備分析精度足夠高、測(cè)試重復(fù)性良好和目標(biāo)組分分辨能力強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，但這些方法往往需要昂貴的分析儀器或分析成本、儀器往往體積較大，且要求檢測(cè)環(huán)境苛刻、需要專(zhuān)業(yè)人員的操作及較長(zhǎng)的測(cè)定時(shí)間而較難大規(guī)模進(jìn)入食品工業(yè)應(yīng)用。此外，對(duì)于果汁原漿的檢測(cè)，通常還存在需要樣本前處理的問(wèn)題。

葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOx）電極具有靈敏度高、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，且市場(chǎng)上已出現(xiàn)了用途多樣的商品化GOx電極［6］。GOx電極多是通過(guò)測(cè)定有氧條件下GOx對(duì)其底物葡萄糖進(jìn)行生物催化氧化時(shí)所產(chǎn)生的H2O2實(shí)現(xiàn)的。目前，能夠?qū)崿F(xiàn)H2O2的低電位還原的技術(shù)方案有2 種，即過(guò)氧化物酶及鐵氰化物修飾電極。相比過(guò)氧化物酶法，普魯士藍(lán)（Prussian blue，PB）靈敏度高［7］、成本低廉、穩(wěn)定性良好、檢測(cè)電位低且能夠有效避免雙酶?jìng)鞲衅麟娮觽髻|(zhì)速率低［8］的缺陷。學(xué)界已有大量基于PB構(gòu)建的酶?jìng)鞲衅鞯难芯繄?bào)道，可應(yīng)用于葡萄糖［9-10］、氨基酸［11］、有機(jī)酸［12］、乙醇［13］等食品組分的分析測(cè)定。PB可在極低的電位條件下［11，14］（0 mV附近）完成對(duì)H2O2的電催化，相比傳統(tǒng)電極［14］可以有效避免實(shí)際樣品中多種物質(zhì)的干擾。當(dāng)前研究中，PB的合成主要有電化學(xué)沉積法及化學(xué)沉積法2 類(lèi)［15-16］。電化學(xué)沉積法需要沉積液現(xiàn)用現(xiàn)配、設(shè)備要求較高、操作復(fù)雜。此外，化學(xué)沉積法制得的PB在堿性環(huán)境中具備較高的穩(wěn)定性［7］。在化學(xué)沉積法的應(yīng)用中，多數(shù)研究者使用水溶性PB［17-18］。該方法雖然易獲得粒徑更小、更為均質(zhì)的PB粒子，但沉積周期長(zhǎng)，合成后仍需要丙酮的誘導(dǎo)以加速沉降［19］。以化學(xué)沉積法獲得水不溶性PB，制備簡(jiǎn)易、廉價(jià)、便于批量制取，更適合在食品工業(yè)中應(yīng)用。

殼聚糖（chitosan，CHIT）具有無(wú)毒、成膜性良好、分子易于進(jìn)行修飾、在多數(shù)酶的工作環(huán)境中不溶等優(yōu)點(diǎn)，已成為酶固定化的一種優(yōu)良載體。CHIT具有良好的成膜特性［20］，在其成膜過(guò)程中，具有線性結(jié)構(gòu)的CHIT分子可形成網(wǎng)狀的空間結(jié)構(gòu)。同時(shí)，CHIT可與碳納米管、石墨烯、石墨等碳系材料良好融合。利用這些特性，可以將CHIT作為GOx的載體將之固定于電極表面制成酶電極。張彥等［21］利用雞蛋殼膜為載體固載GOx后，滴加CHIT固定后制成了葡萄糖生物傳感器。其研究表明，CHIT固定化的GOx較戊二醛固定化的效果更為理想。避免使用具有一定毒性的戊二醛，將使固定化修飾后的GOx電極在食品行業(yè)中具有更大的推廣價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)旨在介紹一種適合食品工業(yè)中果汁原漿葡萄糖含量的高效分析檢測(cè)方法。該方法采用比合成方法更為簡(jiǎn)便的水不溶性PB構(gòu)建對(duì)H2O2具有線性電化學(xué)響應(yīng)的換能元件，并以CHIT制成GOx膜將其固定于電化學(xué)換能元件上構(gòu)成酶電極，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)樣本中的葡萄糖含量的測(cè)定。結(jié)合特別適于大規(guī)模生產(chǎn)的絲網(wǎng)印刷技術(shù)［22］用以PB修飾的電化學(xué)換能器的制備，為該方法的實(shí)用化提供技術(shù)方案。以消費(fèi)量大、成分復(fù)雜且較具代表性的蘋(píng)果汁原漿［23］作為分析樣本，對(duì)其性能進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)證明，此電極的檢測(cè)限低、靈敏度高、線性范圍寬。同時(shí)，其所需響應(yīng)時(shí)間極短，能夠有效抵抗分析樣本中其他單糖或雙糖、有機(jī)酸、抗壞血酸、酚類(lèi)等組分的干擾，且生產(chǎn)成本極低，完全能夠滿足食品工業(yè)中果汁原漿的分析測(cè)試要求，可作為開(kāi)發(fā)食品工業(yè)質(zhì)量檢驗(yàn)儀器、便攜式測(cè)試儀器等的核心部件。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

蘋(píng)果汁原漿 萊州姜之源飲料食品有限公司。

GOx（E.C1.1.3.4，177 U/mg） 美國(guó)Sigma公司；葡萄糖 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%戊二醛溶液、CHIT（脫乙酰度≥95%，黏度＞400 mPa·s）、鐵氰化鉀、六水合氯化鐵 美國(guó)Aladdin試劑公司；JUJO CH-8型碳基導(dǎo)電油墨 日本十條公司；透析袋（截留分子質(zhì)量8 000～14 000 D） 美國(guó)Spectrum公司；水系微孔濾膜（35 mm×0.15 μm）上海市新亞凈化器件廠；其他試劑皆為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

CHI760d型電化學(xué)工作站、Ag/AgCl（飽和KCl溶液）電極 上海辰華儀器有限公司；JB-2型磁力攪拌器、PHSJ-3F型酸度計(jì) 上海雷磁公司。

1.3方法

1.3.1化學(xué)沉積法制備PB

配制含有K3Fe（CN）6、鹽酸及KCl各0.03 mol/L溶液50 mL，在快速攪拌條件下向其中逐滴加入含0.04 mol/L FeCl3溶液50 mL，溶液隨即變?yōu)樯钏{(lán)色。以此比例制備的PB粒子不易在近中性溶液環(huán)境中溶解［24］，從而降低其作為介體材料在修飾電極上流失的可能。持續(xù)攪拌過(guò)夜后，將溶液轉(zhuǎn)入透析袋內(nèi)以蒸餾水不斷透析至透析液透明無(wú)色、無(wú)法檢出Cl－，且袋內(nèi)PB完全沉降于袋底部為止（約2 d）。經(jīng)此處理后，粒徑過(guò)小的PB粒子得以去除，使制備的PB更加適于穩(wěn)定性更佳的絲網(wǎng)印刷電極（screen-printed electrode，SPE）片的制作。傾去上層水液后置于烘箱內(nèi)，95 ℃條件下將多余水分揮發(fā)干凈，再于100 ℃條件下烘烤1 h，使PB粒子得到活化。將活化后的PB置于瑪瑙研缽內(nèi)研細(xì)，置于干燥器內(nèi)待用。

1.3.2PB修飾的SPE（PB/SPE）的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取一定質(zhì)量的PB粉末置于瑪瑙研缽內(nèi)，與一定質(zhì)量的導(dǎo)電油墨及0.3 mL N，N-二甲基甲酰胺（N，N-dimethylformamide，DMF）充分混合并研磨成質(zhì)地均一、無(wú)顆粒感的PB修飾印漿。

取厚度為0.5 mm聚氯乙烯基片，以1 mol/L NaOH溶液浸泡處理4 h后洗凈晾干備用。手工制作網(wǎng)版，在聚氯乙烯基片上以未添加PB的導(dǎo)電油墨手工印制如圖1A所示的雙電極體系。溶劑揮發(fā)后以PB修飾的導(dǎo)電油墨印制工作電極部分，其工作電極部分為直徑3 mm的圓形面。印刷完成后，置于90 ℃的烘箱內(nèi)鼓風(fēng)干燥2 h使有機(jī)溶劑充分揮發(fā)并使基底電極活化。除工作電極、對(duì)電極和電極接口外，在充分揮發(fā)溶劑后以硅酮膠印刷覆蓋其余部分形成絕緣層，構(gòu)成完整的PB/SPE。

圖1　CHIT/PB/SPE結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1　Schematics of the structure of CHIT/PB/SPE

電極在使用前以蒸餾水清洗其工作面積后于室溫條件下晾干待用，進(jìn)行電化學(xué)表征時(shí)，電極片接口與專(zhuān)門(mén)制作的轉(zhuǎn)接口連接后同電化學(xué)工作站連接。

1.3.3GOx電極的制備

將1 g CHIT片狀固體加入100 mL含0.1 mol/L冰乙酸溶液的蒸餾水中，加熱至90 ℃至完全溶解，冷卻至室溫后以針頭式過(guò)濾器過(guò)濾，得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%稀溶液，貯存于4 ℃冰箱內(nèi)待用。將150 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% CHIT溶液與200 μL 0.1 mol/L磷酸緩沖鹽（pH 5.5）緩沖液均勻混合；準(zhǔn)確稱(chēng)取2 mg GOx凍干粉末（約300～340 U），將其充分溶 解于CHIT混合液內(nèi)，使其在室溫條件下靜置1 h。以移液器吸取15 μL GOx-CHIT混合溶膠，小心滴涂于切割至合適尺寸的微孔濾膜一側(cè)表面，于室溫條件下靜置2 h使水分充分揮發(fā)制成酶膜。將酶膜固定有GOx的一側(cè)小心貼附于PB/SPE片的工作電極面上，以新調(diào)配的環(huán)氧樹(shù)脂作為黏合劑使酶膜邊緣與電極片緊密黏合。室溫條件下靜置，待樹(shù)脂固化后形成如圖1B、1C中所示的GOx修飾的酶電極（CHIT/GOx/PB/SPE）。同時(shí)，以完全相同的方法制備不含GOx的修飾電極（CHIT/PB/ SPE）作為對(duì)照，以闡明酶電極的工作原理。進(jìn)行電化學(xué)表征前，以蒸餾水充分沖洗電極表面，使未同酶膜緊密結(jié)合的成分被徹底清除。不使用時(shí)，將此電極于4 ℃條件下進(jìn)行保存。

1.3.4酶電極的電化學(xué)表征及實(shí)際樣品測(cè)試

以手工印制的CHIT/GOx/PB/SPE雙電極電極片作為工作電極和輔助電極，參比電極為Ag/AgCl電極，連接至電化學(xué)工作站的對(duì)應(yīng)電極夾上。反應(yīng)池為10 mL小燒杯。進(jìn)行安培法表征時(shí)，以磁力攪拌器不斷進(jìn)行攪拌，反應(yīng)溫度為室溫。

實(shí)驗(yàn)選用工廠生產(chǎn)的新鮮蘋(píng)果汁原漿作為模式分析樣本，以檢驗(yàn)此電極測(cè)試實(shí)際樣品的能力。蘋(píng)果汁原漿樣品在獲得后迅速以CHIT/GOx/PB/SPE進(jìn)行安培法檢測(cè)，檢測(cè)前樣品不經(jīng)過(guò)任何預(yù)處理步驟，直接稀釋至所需濃度后完成檢測(cè)。

2　結(jié)果與分析

2.1檢測(cè)條件優(yōu)化

2.1.1PB修飾量

按照本實(shí)驗(yàn)方法合成 的雖為水不溶性PB粒子，但PB本身仍為親水性組分，在長(zhǎng)期處于水溶液環(huán)境中依然可以從修飾電極上發(fā)生部分泄漏。此外，在較低電位條件下，PB存在式（1）反應(yīng)：

其中，真正對(duì)H2O2起到電還原作用的物質(zhì)為普魯士白（Prussian white，PW）［25］，PW為水溶性組分，在施加檢測(cè)電位時(shí)易發(fā)生流失。PB修飾量過(guò)高，雖然電極的靈敏度有所提高，但所修飾的PB容易發(fā)生泄漏而導(dǎo)致檢測(cè)信號(hào)不斷減小，且易造成PB/SPE均一性降低。修飾量過(guò)低，電極的靈敏度及信號(hào)強(qiáng)度則明顯降低。因此，合適的PB修飾量是PB/SPE性能的首要影響因素。

固定DMF的用量0.3 mL，分別將新制的0、10、20、30、40、50、60 mg PB粉末與相應(yīng)質(zhì)量的導(dǎo)電油墨混合成總質(zhì)量為3 g，PB含量不同的PB/SPE，并按1.3.2節(jié)及1.3.3節(jié)所述方法制得相應(yīng)的CHIT/PB/SPEs，在0.1 mol/L pH 6.0的PBS中通過(guò)循環(huán)伏安（cyclic voltammetry，CV）法進(jìn)行表征，結(jié)果如圖2所示。CV掃描結(jié)果顯示，PB的摻入使得PB/SPE在約100 mV及約200 mV處出現(xiàn)一對(duì)對(duì)稱(chēng)性良好的氧化還原峰，該氧化還原峰的存在可以由式（1）的反應(yīng)進(jìn)行解釋。隨著PB在PB/SPE中含量的增加，電極的基底電流信號(hào)總體表現(xiàn)出增大趨勢(shì)。但同時(shí)，峰電位差（ΔE）也有所增大，說(shuō)明電極的可逆性隨之略有降低；當(dāng)PB含量大于50 mg時(shí)，電極可逆性銳減。因此，選擇50 mg（即PB與導(dǎo)電油墨質(zhì)量比為1∶59）為最佳PB添加量。

圖2　不同PB含量CHIT/GOx/PB/SPEs在PBS中的循環(huán)伏安圖Fig.2　Cyclic voltammograms of CHIT/GOx/PB/SPEs with varying PB to paste ratios in 0.1 mol/L PBS at pH 6.0

取以此比例新制的CHIT/PB/SPE一支，以蒸餾水清洗其工作面后進(jìn)行CV表征，結(jié)果如圖3所示。由圖3a可以看出，CHIT/PB/SPE在PBS中的CV響應(yīng)中得到一對(duì)對(duì)稱(chēng)性良好的氧化還原峰，此為PB的特征氧化還原峰，可由式（1）的反應(yīng)加以解釋?zhuān)?9］。當(dāng)向反應(yīng)液中加入葡萄糖后，響應(yīng)曲線未出現(xiàn)變化；而當(dāng)加入H2O2后，可以明顯觀察到還原峰電位處的響應(yīng)電流值增大并伴隨氧化峰電位處響應(yīng)電流值的減小。該現(xiàn)象說(shuō)明PB修飾的電極片對(duì)葡萄糖并無(wú)電化學(xué)響應(yīng)，而H2O2則可在電極上被高效氧化，產(chǎn)生靈敏響應(yīng)。

圖3　循環(huán)伏安響應(yīng)Fig.3　Cyclic voltammograms

以相同方法制備CHIT/GOx/PB/SPE，CV表征結(jié)果見(jiàn)圖3b。當(dāng)緩沖體系內(nèi)有葡萄糖存在時(shí)，其還原峰電流顯著增大，而氧化峰電流略有減小。說(shuō)明在酶的催化條件下，葡萄糖被氧化并產(chǎn)生一定濃度的H2O2，所產(chǎn)生的H2O2在PB的電催化條件下發(fā)生氧化反應(yīng)。可利用此反應(yīng)完成酶電極對(duì)其底物的定量檢測(cè)。相比于CHIT/PB/SPE的響應(yīng)結(jié)果，CHIT/GOx/PB/SPE的響應(yīng)電流信號(hào)強(qiáng)度減小，這主要是由于在電極表面增加了酶膜部分，從而導(dǎo)致電極表面的電導(dǎo)率有所下降產(chǎn)生的。

2.1.2檢測(cè)電位

對(duì)于安培型電化學(xué)傳感器而言，檢測(cè)電位對(duì)分析結(jié)果是一個(gè)極其重要的影響因素。傳感器的靈敏度和抗干擾性能等皆可因檢測(cè)電位的不同而不同。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以PB對(duì)導(dǎo)電油墨的質(zhì)量比為1∶59配制的修飾碳漿制作PB/SPE的電極片為基底電極制作CHIT/GOx/PB/ SPE，在含有葡萄糖及抗壞血酸各0.5 mmol/L的pH 6.0的PBS中，分別于－150、－100、－50、0、50、100 mV與150 mV電位（飽和Ag/AgCl電極）條件下進(jìn)行安培檢測(cè)，檢測(cè)溫度25 ℃。測(cè)量結(jié)果如圖4所示，以相應(yīng)的電流響應(yīng)值作為衡量CHIT/GOx/PB/SPE對(duì)葡萄糖響應(yīng)靈敏度及受氧化型干擾組分影響程度的依據(jù)。

圖4　不同檢測(cè)電位條件下的響應(yīng)信號(hào)Fig.4　Response signal intensity and interference of ascorbic acid recorded at varying detection potentials

在負(fù)電位區(qū)段，隨檢測(cè)電位的負(fù)向移動(dòng)，酶電極對(duì)葡萄糖的電流響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度增大，且由抗壞血酸產(chǎn)生的干擾信號(hào)強(qiáng)度明顯減小；在－100 mV時(shí)，酶電極對(duì)待測(cè)底物的電流響應(yīng)信號(hào)達(dá)到增高水平，而受到抗壞血酸的影響水平最低（約為相應(yīng)葡萄糖響應(yīng)值的0.6%）。當(dāng)檢測(cè)電位大于0 V時(shí)，酶電極對(duì)葡萄糖的電流響應(yīng)強(qiáng)度降低而受到抗壞血酸干擾的程度明顯增高。因此，綜合考慮各指標(biāo)性能，確定酶電極的最佳檢測(cè)電位為－100 mV。

2.1.3pH值

GOx是目前所應(yīng)用的酶制劑中穩(wěn)定性較理想的一種，其純酶制劑在pH值3.5～6.5的范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好，最適pH值為5.0［26］。在經(jīng)歷固定化操作后，酶的化學(xué)動(dòng)力學(xué)參數(shù)及其最適催化條件會(huì)有所改變，尋找固定化后酶電極的最適pH值對(duì)增強(qiáng)其測(cè)試性能、延長(zhǎng)其穩(wěn)定期限等有重要意義。

通過(guò)向0.1 mol/L PBS中滴加不等量的0.5 mol/L NaOH溶液配制得pH值5.0～8.0的梯度溶液，用于實(shí)驗(yàn)操作。分別測(cè)定CHIT/GOx/PB/SPE于不同pH值條件下的電流-時(shí)間響應(yīng)，如圖5所示。pH值小于6.5時(shí)，響應(yīng)電流強(qiáng)度隨pH值的增加而增大，至pH 6.5時(shí)達(dá)到最大值。當(dāng)pH值水平高于中性條件后，電流響應(yīng)強(qiáng)度下降。同時(shí)，考慮到在偏堿性pH值條件下，GOx及PB的穩(wěn)定性均有所下降等因素，確定pH 6.0作為CHIT/GOx/PB/ SPE的最佳工作pH值。

圖5　pH值對(duì)CHIT/GOx/PB/SPE電流響應(yīng)強(qiáng)度的影響Fig.5　Effect of pH on the current response intensity of CHIT/GOx/PB/SPE

2.2葡萄糖在CHIT/GOx/PB/SPE上的安培型響應(yīng)及其校正曲線的建立

為闡明CHIT/GOx/PB/SPE對(duì)葡萄糖的電流響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度與所測(cè)定的葡萄糖濃度之間的關(guān)系，該實(shí)驗(yàn)通過(guò)安培法研究CHIT/GOx/PB/SPE在最佳工作條件下對(duì)葡萄糖的電流響應(yīng)特征，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6　CHIT/GOx/PB/SPE在0.1 mol/L PBS（pH 6.0）中連續(xù)加入0.04 mmol/L 葡萄糖的安培響應(yīng)圖Fig.6　Chronoamperometric responses of CHIT/GOx/PB/SPE in 0.1 mol/L PBS （pH 6.0） with successive addition of 0.04 mmol/L glucose

葡萄糖的加入使電流信號(hào)快速增大，經(jīng)歷約8 s后電流響應(yīng)達(dá)到其穩(wěn)定響應(yīng)值的95%。隨著底物葡萄糖濃度的增加，電流強(qiáng)度也隨之有規(guī)律地增大。通過(guò)對(duì)更大濃度范圍葡萄糖的測(cè)定分析，計(jì)算得校正曲線為：i/μA = 1.016 C/（mmol/L）+0.0911（R=0.999 4）。該酶電極對(duì)在8.0 μmol/L～2.2 mmol/L范圍內(nèi)的葡萄糖具有線性響應(yīng)，其靈敏度為1.016 μA·L/mmol。根據(jù)信噪比等于3的原則，該酶電極的檢測(cè)限為0.082 7 μmol/L（RSN=3）。

2.3抗干擾性測(cè)試

果汁原漿中的成分比較復(fù)雜，除單糖、雙糖外，氨基酸、抗壞血酸、有機(jī)酸、酚類(lèi)等成分的存在，都可能對(duì)酶電極的葡萄糖定量測(cè)試結(jié)果產(chǎn)生干擾［27］。本實(shí)驗(yàn)選擇了果糖、麥芽糖、蔗糖、檸檬酸、蘋(píng)果酸、草酸、抗壞血酸、甘氨酸、天冬氨酸、丁香酸10 種物質(zhì)作為酶電極抗干擾性能評(píng)價(jià)的模式干擾物質(zhì)。在最佳工作條件下，記CHIT/GOx/PB/SPE于含1 mmol/L葡萄糖的緩沖體系中的響應(yīng)值為100%，分別測(cè)定向緩沖體系內(nèi)添加與葡萄糖等濃度的10 種物質(zhì)，記錄其各自響應(yīng)信號(hào)的變化。測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　干擾組分測(cè)試結(jié)果Table1　Results obtained in the presence of different interfering components

測(cè)定結(jié)果顯示，酶電極對(duì)多種蘋(píng)果汁原漿內(nèi)所含的干擾組分皆表現(xiàn)出理想的抗干擾性能。其中，抗壞血酸所造成的干擾最明顯，但依然處于不足正常響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度1%的水平，說(shuō)明此酶電極具備良好的抗干擾性能，適合于在不經(jīng)歷樣本預(yù)處理?xiàng)l件下的果汁原漿實(shí)際樣本檢測(cè)。

2.4實(shí)際樣品測(cè)試及回收率實(shí)驗(yàn)

由于果汁原漿單糖含量較高且黏度大，分析前需進(jìn)行適當(dāng)稀釋。準(zhǔn)確量取5 mL果汁原漿，以0.1 mol/L的PBS（pH 6.0）稀釋定容至50 mL，再以同樣方法繼續(xù)稀釋定容一次，得到1/100的梯度稀釋溶液。準(zhǔn)確量取50 μL該稀釋液，注入含4.95 mL 0.1 mol/L的PBS（pH 6.0）的反應(yīng)池內(nèi)完成安培檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)以磁力攪拌器勻速攪拌。共完成5次平行測(cè)定，測(cè)得稀釋樣品中的葡萄糖含量的平均值為0.181 5 mmol/L。并進(jìn)行5 次加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果記錄于表2。

表2　實(shí)際樣品及回收率測(cè)試Table2　Spiked recoveries in real sample

實(shí)驗(yàn)測(cè)得回收率在96.17%～102.01%，表明酶電極對(duì)于果汁原漿實(shí)際樣品的檢測(cè)性能與被分析組分的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具有相同的響應(yīng)特征。該酶電極適用于果汁原漿的實(shí)際檢測(cè)。

2.5電極重復(fù)性及穩(wěn)定性測(cè)試

圖7　酶電極重復(fù)性測(cè)試結(jié)果Fig.7　Repeatability of the enzymatic electrode

表3　酶電極穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果Table3　Stability of the enzymacti electrode

表4　酶電極重復(fù)性測(cè)試結(jié)果Table4　Reproducibility of the enzymatic electrode

在最優(yōu)檢測(cè)條件下，以安培法對(duì)含有1 mmol/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)試樣的PBS緩沖體系獨(dú)立進(jìn)行30次電化學(xué)檢測(cè)。每次測(cè)定時(shí)令酶電極在無(wú)底物的PBS中首先進(jìn)行100 s掃描，以使電極充分極化、穩(wěn)定。隨后立刻向緩沖體系中注入固定濃度與體積的底物，讀取注入底物5 s后的電流響應(yīng)值作為底物定量結(jié)果。30 次重復(fù)測(cè)試的結(jié)果，平均響應(yīng)電流強(qiáng)度為1.137 μA，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.57%，結(jié)果見(jiàn)圖7。酶電極在不使用時(shí)，貯存于4 ℃冰箱中。每隔3 d對(duì)同一支電極進(jìn)行一次檢測(cè)，30 d后，響應(yīng)電流強(qiáng)度下降為初始值的91.6%，說(shuō)明酶電極的穩(wěn)定性良好（結(jié)果見(jiàn)表3）。另外，為測(cè)試電極的重復(fù)性，以相同方法制作10 支酶電極，分別記錄其對(duì)含有1 mmol/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)試樣的PBS緩沖體系的電流響應(yīng)值。計(jì)算得10 次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的平均響應(yīng)電流強(qiáng)度為1.087 μA，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.43%，表明CHIT/GOx/PB/S PE具有較理想的重復(fù)性，結(jié)果見(jiàn)表4。

3　結(jié) 論

本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定CHIT/GOx/PB/SPE的最佳制作方法及工作條件為：按照PB與導(dǎo)電油墨的質(zhì)量比為1∶59調(diào)制PB修飾的絲網(wǎng)印刷導(dǎo)電油墨用于酶電極制作；在0.1 mol/L的PBS（pH 6.0）中，以－100 mV（Ag/AgCl）作為檢測(cè)電位。通過(guò)電化學(xué)表征，證明CHIT/GOx/PB/ SPE對(duì)葡萄糖具有良好的電流響應(yīng)特征。該酶電極對(duì)8.0 μmol/L～2.2 mmol/L范圍內(nèi)的葡萄糖的電流響應(yīng)呈線性關(guān)系，檢測(cè)限達(dá)0.082 7 μmol/L（RSN=3），靈敏度為1.016 μA·L/mmol。同時(shí)，該電極對(duì)果汁原漿實(shí)際樣品表現(xiàn)出理想的響應(yīng)特征，且?guī)缀醪皇芊治鰳颖局袕?fù)雜成分的干擾，分析測(cè)定前無(wú)需對(duì)樣本進(jìn)行預(yù)處理，適合作為適用于食品工業(yè)分析檢測(cè)的一次性或重復(fù)使用的葡萄糖電化學(xué)分析儀器核心部件。

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Development of Enzymatic Electrode for the Detection of Glucose in Not-From-Concentrate （NFC） Fruit Juices

QI Cuihua1， LI Yiwei2，3， ZHANG Xiaowei1
（1. School of Hotel Management， University of Jinan， Jinan 250022， China； 2. Key Biosensor Laboratory of Shandong Province，Biology Institute of Shandong Academy of Sciences， Jinan 250014， China；3. School of Chemistry and Chemical Engineering， University of Jinan， Jinan 250022， China）

A glucose oxidase （GOx） electrode fabricated on the basis of an electron mediator b ulk-modifi ed screen-printed electrode as an electrochemical transducer made from water-insoluble prussian blue （PB）， which was easy to prepare， was reported in this study. Electrochemical characterizations revealed that the enzyme electrode exhibited robust current response properties. It possessed a linearity toward glucose within the range of 8.0 μmol/L-2.2 mmol/L. Its limit of detection （LOD）was 0.082 7 μmol/L （RSN= 3）， sensitivity was 1.016 μA·L/mmol， response time was 5 s and it showed satisfactory antiinterference capability， stability and reproducibility. The formulation and working conditions of the electrode were also optimized. This electrode is easy to prepare， economic and applicable for the rapid assay of glucose in not-from-concentrate（NFC） fruit juices.

not-from-concentrate （NFC） fruit juices； glucose； screen-printed electrode； industrial application

TS3

A

1002-6630（2015）14-0111-07

10.7506/spkx1002-6630-201514022

2014-09-09

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZR2014BP015）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（21375047）

綦翠華（1965—），女，副教授，碩士，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)與檢測(cè)。E-mail：st_qich@ujn.edu.cn