內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子XBP1S在1型糖尿病大鼠認知功能障礙中作用探討

邵德翠，李佳嘉，黃順國，孔亞麗

（1.皖南醫(yī)學(xué)院生理科學(xué)研究所，安徽蕪湖241002；2.皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院病理科；3.皖南醫(yī)學(xué)院生物學(xué)研室；4.復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海200032）

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子XBP1S在1型糖尿病大鼠認知功能障礙中作用探討

邵德翠1，李佳嘉2，黃順國3，孔亞麗4

（1.皖南醫(yī)學(xué)院生理科學(xué)研究所，安徽蕪湖241002；2.皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院病理科；3.皖南醫(yī)學(xué)院生物學(xué)研室；4.復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海200032）

目的：本研究通過觀察tau蛋白和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路關(guān)鍵分子XBP1S在糖尿病大鼠海馬表達的變化，探討XBP1S在糖尿病大鼠腦認知功能障礙的作用.方法：大鼠經(jīng)腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）建立1型糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）大鼠模型，注射STZ16周末，取大鼠海馬組織，采用Western Blots和免疫組織化學(xué)方法，觀察大鼠海馬組織中XBP1S和Tau的變化.結(jié)果：注射STZ16周，Western Blots結(jié)果顯示：糖尿病大鼠海馬組織中XBP1S蛋白表達明顯降低，Tau蛋白表達明顯升高；免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：DM大鼠海馬CA1區(qū)Tau陽性細胞數(shù)較多，顏色深；DM大鼠海馬CA1區(qū)XBP1陽性細胞數(shù)較少，顏色淺.結(jié)論：XBP1S在DM大鼠海馬區(qū)表達比正常大鼠減少，提示XBP1S在可能參與糖尿病大鼠認知損傷.

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；XBP1S；學(xué)習(xí)記憶；Tau；海馬

糖尿病（diabetes mellitus，DM）并發(fā)癥的發(fā)病機制一直是研究熱點，糖尿病腦病是糖尿病晚期并發(fā)癥之一，指因糖尿病引起的認知功能障礙和大腦的神經(jīng)生理功能和結(jié)構(gòu)改變，最終導(dǎo)致神經(jīng)元的損害，是以獲得性認知和行為缺陷為特征，臨床主要表現(xiàn)為輕、中度認知功能障礙，學(xué)習(xí)和記憶能力下降［1］.既往的研究表明，DM小鼠存在明顯的學(xué)習(xí)、記憶功能障礙，其海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)明顯損害，與認知障礙相關(guān)的蛋白如：tau蛋白，β淀粉樣肽類蛋白質(zhì)表達增加［2］.目前糖尿病性腦病的發(fā)病機制還不十分清楚，給其治療帶來一定困難.

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）與糖尿病的關(guān)系逐漸引起研究者的關(guān)注［3］.正常情況下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)具有非常強大的維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的功能，當(dāng)某種原因（葡萄糖或營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏、脂質(zhì)過度負荷、毒素或分泌蛋白合成過多、Ca2+代謝失衡、缺血再灌注與氧化應(yīng)激等）打破了細胞穩(wěn)態(tài)，使細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成速度過快，超過了E R折疊能力，導(dǎo)致E R處于一種生理功能紊亂的狀態(tài)，即形成ERS.XBP1是ERS的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，XBP1存在兩種蛋白形式，分子量為29 kDa的XBP1U以及分子量為54 kDa的XBP1S.由未剪切型（XBP1U mRNA）編碼的蛋白是不穩(wěn)定的，而剪接型XBP1 mRNA（XBP1S mRNA）編碼的XBP1S蛋白則較穩(wěn)定［4］；XBP1功能廣泛而復(fù)雜，參與細胞增殖、凋亡與分化，以及調(diào)節(jié)免疫以及炎癥反應(yīng)等［5，6］.在2型DM小鼠模型的海馬部位，XBP1S mRNA與蛋白表達水平明顯減少，Western blot結(jié)果也顯示了XBP1S/XBP1U比例降低，提示XBP1S水平的降低，可能與糖尿病所致的中樞神經(jīng)損害有關(guān)［7］.

為此，本研究選擇STZ制造1型糖尿病大鼠模型（16周），觀察大鼠海馬部位XBP1S和Tau的表達變化，以期為進一步的XBP1S藥物干預(yù)治療糖尿病腦病提供理論支持.

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物：健康雄性S D大鼠25只，體重180-220g，6-8周齡，購自上海斯萊克實驗動物中心.飼以大鼠常規(guī)顆粒飼料，自由飲水.實驗動物飼養(yǎng)房內(nèi)通風(fēng)良好.室溫保持在18-22℃.

1.1.2主要試劑：鏈脲佐菌素（STZ）購于美國Sigma公司；XBP1（Cat#SC-7160）購于美國Santa Cruz公司，Tau（Cat#B A0140）購于武漢博士德公司，Actin（Cat#AA128）購于碧云天生物技術(shù)研究所；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）購于碧云天生物技術(shù)研究所，HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L）購于碧云天生物技術(shù)研究所；PVDF膜購于Millipore；Prestained protein ladder（10-180k Da）購于Fementas；十二烷基磺酸鈉、甘氨酸、Tris與甲醇購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司；丙烯酰胺購于迪申生物技術(shù)有限公司.

1.2實驗方法

1.2.1STZ糖尿病動物模型的建立：大鼠正常喂養(yǎng)一周.隨機選取10只作為正常對照組，予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng).其余大鼠禁食12小時后，按60mg/kg體重一次性腹腔內(nèi)注射STZ（對照組注射等量的檸檬酸緩沖液），注射后給予充分飲水及食物.尾靜脈測空腹血糖，稱體重.注射STZ后第7天檢測血糖，大于16.7mmol/L者為穩(wěn)定模型.16周末處死大鼠，取2側(cè)大腦海馬組織，左側(cè)用于免疫組織化學(xué)染色，右側(cè)用于Western Blots檢測.

1.2.2Western Blots：取100m g存放于-70℃的海馬組織置于玻璃勻漿器中，按照組織重量（克數(shù)）:裂解液體積（μl）=1: 8，加入相應(yīng)量的1×SDS裂解液（預(yù)先加入蛋白酶抑制劑），充分研磨后，在冰上靜置10分鐘，然后裝入1.5m l離心管中；置于沸水中煮沸約5min；4℃12，000r pm離心10min，取上清進行蛋白質(zhì)定量.將50u g的樣本加入5×SDS凝膠加樣緩沖液，與蛋白質(zhì)marker一起進行SDS-PAGE電泳，電泳完畢后恒流270m A電轉(zhuǎn)2h將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，放入5%脫脂牛奶（M/V，溶于TBST）溶液中，置于搖床上約1小時后加入一抗XBP1S（1:500稀釋），Tau（1:500），Actin（1: 1000）過夜；第二天，TBST洗膜完畢后用5%脫脂牛奶溶液配制二抗（1:1000），室溫孵育2h，待二抗結(jié)合完畢，TBST洗膜加入EC L，用G E公司的Amersham Imager 600分子成像系統(tǒng)拍照和分析.

1.2.3免疫組織化學(xué)染色大鼠處死后一側(cè)大腦海馬置于4%多聚甲醛中固定24h，然后進行石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片，片厚5um.將石蠟切片進行烤片、脫蠟、水化，然后滴入3%H2O2封閉非特異性抗原，加入Anti-tau和Anti-XBP1S抗體4度過夜，PBST洗三次，每次5min，加二抗室溫孵育2h，PBS T洗三次，每次5min，DAB顯色，常規(guī)樹脂封片，光學(xué)顯微鏡觀察.陰性對照以PBS代替一抗，.采用ImageJ圖像分析系統(tǒng)分別計數(shù)每只大鼠5張切片內(nèi)一側(cè)海馬CA1區(qū)全部XBP1和Tau陽性細胞數(shù).

1.3統(tǒng)計方法

實驗結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SE M）表示.兩組間的比較用t檢驗，若p＜0.05，則認為組間有顯著性差異.

2　結(jié)果

2.1大鼠海馬組織XBP1S和tau的蛋白表達

注射STZ16周，如圖1所示，Western Blots結(jié)果表明：相比較于對照組大鼠，DM組大鼠，XBP1S蛋白表達明顯降低，而Tau蛋白表達明顯升高（圖1）.

2.2免疫組化檢測XBP1S和tau表達

注射STZ16周，如圖3所示，海馬H E染色顯示對照組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞排列較為稀疏、散亂，細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)比較清晰，核膜清晰，核仁明顯.DM組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞排列紊亂、松散，核固縮，數(shù)量較對照組減少.

圖4可見，對照組大鼠海馬CA1區(qū)XBP1S在細胞核和細胞漿表達，免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物呈棕褐色，且表達較強，與對照組比較，DM組海馬CA1區(qū)XBP1S表達強度減弱.

圖5可見，Tau在對照組大鼠海馬CA1區(qū)免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物呈棕褐色，主要分布于神經(jīng)元胞漿和胞膜；與對照組比較，DM組海馬CA1區(qū)Tau表達強度升高.

圖1　正常組和糖尿病組大鼠海馬XBP1S的蛋白表達變化

圖2　正常組和糖尿病組大鼠海馬Tau的蛋白表達變化

圖3　正常組和糖尿病組大鼠海馬CA1區(qū)的H E染色（×400倍）

圖4　正常組和糖尿病組大鼠海馬CA1區(qū)XBP1S陽性染色細胞（×400倍）

圖5　正常組和糖尿病組大鼠海馬CA1區(qū)Tau陽性染色細胞（×400倍）

3　討論

隨著糖尿病人口劇增，DM對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響引起越來越多的關(guān)注，長期的高血糖刺激將導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能損傷，產(chǎn)生慢性進行性認知功能障礙.本研究采用Western blots和免疫組織化學(xué)檢測大鼠Tau蛋白表達，發(fā)現(xiàn)與對照組比較，DM組大鼠海馬部位Tau蛋白表達明顯增加，免疫反應(yīng)陽性表達也增多，說明，在我們的動物模型中，DM大鼠存在認知障礙.但對于糖尿病導(dǎo)致的認知障礙機理目前仍不清楚，大量的研究表明，ERS是導(dǎo)致DM發(fā)生于發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，因此ERS也成為治療DM一個具有強大生命力的新靶點.

現(xiàn)已明確，ERS主要由E R膜上的三個跨膜蛋白，PERK、IRE1與ATF6分別介導(dǎo)，發(fā)揮作用截然不同，如PERK磷酸化后啟動下游的CC AA T增強子結(jié)合蛋白（CHOP），誘導(dǎo)細胞凋亡發(fā)生.國內(nèi)已有學(xué)者研究表明，糖尿病大鼠海馬組織的確發(fā)生ERS，如免疫組化顯示CHOP陽性細胞較對照組明顯增加，說明DM經(jīng)歷了長時間的ERS后，細胞啟動了凋亡途徑［8］.而其中IRE1/XBP1通路是ERS另外一條重要的通路.XBP1S在大部分組織具有保護作用，但在糖尿病認知障礙中，其變化如何？作用如何？為解決這一問題，在本研究中，我們通過腹腔注射STZ制造糖尿病模型發(fā)現(xiàn)，注射STZ16周后，與對照組比較，DM大鼠海馬部位XBP1S蛋白表達明顯降低，免疫組化結(jié)果也支持CA1區(qū)陽性產(chǎn)物表達減弱.這與Sims-Robins on等［7］在在2型DM的小鼠模型中，觀察到海馬部位XBP1S的mRNA與蛋白水平明顯減少，實驗結(jié)果一致.這些結(jié)果初步提示了，XBP1S水平的降低，可能與糖尿病所致的中樞神經(jīng)損害有關(guān)，提高XBP1S的表達可能起到改善DM導(dǎo)致的腦認知功能障礙.

相關(guān)的研究表明，XBP1S活性增強對糖尿病相關(guān)的并發(fā)癥可能具有改善作用，如具有抗炎、改善認知功能障礙與降血糖等.XBP1S具有改善糖尿病視網(wǎng)膜病變中炎癥反應(yīng)的作用，TM與TG預(yù)處理后XBP1S蛋白水平升高，XBP1S過表達后逆轉(zhuǎn)TN F-α刺激后引發(fā)的IC AM-1與VCAM-1蛋白表達升高，整體動物模型上也證實了T M眼球注射對視網(wǎng)膜白細胞停滯以及血管漏有改善作用［9］.Zhou等研究表明，在2型糖尿病小鼠模型中，XBP1S過表達可以明顯改善肝臟胰島素的敏感性，降低血糖，此外在1型糖尿病小鼠模型中，XBP1S過表達也具有明顯的降血糖作用［10］.而提高XBP1S的表達，對細胞中樞神經(jīng)系統(tǒng)認知功能否起到保護作用，值得我們進一步研究.

〔1〕Diaz-Gerevini G T，Repossi G，Dain A，et al.Cognitive and motor perturbations in elderly with longstanding diabetes mellitus［J］.Nutrition.2014，30（6）：628-635.

〔2〕Mehla J，Chauhan B C，Chauhan N B.Experimental induction of type 2 diabetes in aging-accelerated m ice triggered Alzheimer-like pathology and memory deficits［J］.J Alzheimers Dis.2014，39（1）：145-162.

〔3〕Ramirez S，Claret M.Hypothalamic ER stress：A bridge between leptin resistance and obesity［J］.FEBS Lett.2015.

〔4〕Wu R，Zhang Q H，Lu Y J，et al.Involvement of the IRE1alpha-XBP1 pathway and XBP1s-dependent transcriptional reprogramming in metabolic diseases［J］.DNA Cell Biol.2015，34（1）：6-18.

〔5〕Hasegawa D，Calvo V，Avivar-Valderas A，et al.Epithelial Xbp1 Is Required for Cellular Proliferation and Differentiation during Mammary Gland Development［J］.Mol Cell Biol.2015，35（9）：1543-1556.

〔6〕Yu Y，Zhang L，Liu Q，et al.Endoplasm ic reticulum stress preconditioning antagonizes low-density lipoprotein-induced inflammation in human mesangial cells through upregulation of XBP1 and suppression of the IRE1alpha/IKK/NF-kappaB pathway［J］.Mol Med Rep.2015，11（3）：2048-2054.

〔7〕Sims-Robinson C，Zhao S，Hur J，et al.Central nervous system endoplasm ic reticulum stress in a murine model of type 2 diabetes［J］.Diabetologia.2012，55（8）：2276-2284.

〔8〕閆穎，趙詠梅，趙志煒，等.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路相關(guān)分子GRP78及CHOP在糖尿病腦病小鼠海馬表達的變化［J］.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2011（01）：90-94.

〔9〕Li J，Wang J J，Zhang S X.Preconditioning with endoplasmic reticulum stress mitigates retinal endothelial inflammation via activation of X-box binding protein 1［J］.J Biol Chem.2011，286（6）：4912-4921.

〔10〕Zhou Y，Lee J，Reno C M，et al.Regulation of glucose homeostasis through a XBP-1-FoxO 1 interaction［J］.Nat Med.2011，17（3）：356-365.

R285.5

A

1673-260X（2015）06-0088-03

皖南醫(yī)學(xué)院中青年科研基金項目（WK201401），國家自然科學(xué)基金（81400695），安徽省自然科學(xué)基金（1508085QH153）