加味左金丸對大腸癌裸鼠ERK/MAPK信號通路的干預(yù)作用

胡麗娟

廣東省中醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 廣州510006

加味左金丸對大腸癌裸鼠ERK/MAPK信號通路的干預(yù)作用

胡麗娟

廣東省中醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 廣州510006

目的：探討加味左金丸通過MAPK信號通路對人大腸癌裸鼠移植瘤的影響。方法：建立人大腸癌裸鼠皮下移植瘤模型，采用皮下注射HT29大腸癌細胞株制作大腸癌裸鼠模型。45只實驗裸鼠隨機分為3組：生理鹽水組、加味左金丸高劑量組、加味左金丸低劑量組；觀察不同組別對裸鼠致瘤的影響，動態(tài)觀察各組裸鼠腫瘤體積變化，繪制腫瘤生長曲線。采用免疫印記法（Western blot）檢測移植瘤ERK/MAPK活性及RT-PCT法檢測組織ERK/MAPK mRNA的表達。結(jié)果：移植瘤接種成功率100%。裸鼠成瘤潛伏期一般3～5天，最長不超過7天。成瘤初表現(xiàn)為皮下黃白色結(jié)節(jié)，成瘤早期癌體基本成橢圓形，表面光滑，2周后逐漸增大為紫藍色結(jié)節(jié)，邊界清，略可活動，觸之質(zhì)中，逐漸不規(guī)則，表面凹凸不平，呈結(jié)節(jié)狀。瘤體表面可見皮下有較多血管進入。裸鼠接種2周內(nèi)，生理鹽水組瘤體生長較快，加味左金丸各劑量組生長較慢。特別在后期，生理鹽水組裸鼠顯得尤為消瘦，擁擠少動，飲食方面各組差異不明顯。當腫瘤直徑達1cm以后，生長速度較慢，荷瘤鼠漸呈消瘦、精神萎靡、消瘦及惡病質(zhì)衰竭狀態(tài)發(fā)展。剖視腫瘤，大部分呈類圓形，個別形態(tài)不規(guī)則，色灰白，質(zhì)硬。尸檢未見腹腔臟器轉(zhuǎn)移以及心、肝、脾、肺、腎、腦等重要臟器的損傷。加味左金丸各劑量組裸鼠皮下腫瘤組織生長較生理鹽水組明顯減慢（P＜0.05）。加味左金丸各劑量組組間比較，差異無顯著性意義（P＞0.05）。加味左金丸各劑量組腫瘤組織ERK/MAPK相對活性明顯較低（P＜0.05）。加味左金丸各劑量組組間比較，差異無顯著性意義（P＞0.05）。結(jié)論：加味左金丸抑制人大腸癌裸鼠移植瘤的增殖，延緩腫瘤的生長，其機制之一可能是與抑制MAPK信號通路相關(guān)的ERK/MAPK的表達有關(guān)。

加味左金丸；裸鼠；移植瘤；ERK/MAPK信號通路

MAPK信號通路的失調(diào)出現(xiàn)在結(jié)直腸癌發(fā)展的早期，很多證據(jù)顯示MAPK通路涉及結(jié)直腸癌的腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。筆者采用人大腸癌細胞株HT29裸小鼠皮下移植瘤模型，觀察含黃連、吳茱萸等中藥組成的加味左金丸對裸鼠移植瘤的作用，并初步揭示其作用機制，為臨床更好應(yīng)用中藥抗腫瘤提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 癌細胞株HT29 HT29培養(yǎng)于37℃、5%CO2濃度的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)液為含10%FBS的RPM I 1640。隔天更換培養(yǎng)液一次，每周傳代1～2次，傳代時用0.25%的胰酶消化處理和PBS洗滌。

1.2 藥品與試劑 加味左金丸由黃連、吳茱萸、青黛組成，藥物購自廣東省中醫(yī)院。中藥煎煮過程：每次煎煮好一周劑量，先煮黃連和吳茱萸，用紗布濾出藥液，裝入大號研鉑中，倒入青黛慢慢研磨，盡量使青黛慢慢溶入藥液中，最后煎取所需藥液量，放入4℃冰箱備用。

1.3 人大腸癌細胞株HT29裸小鼠移植瘤模型的制備HT29細胞生長至鋪滿培養(yǎng)瓶80%～90%，用0.25%的胰酶消化后收集，制成單細胞懸液，懸浮于生理鹽水中。BALB/C裸鼠45只，飼養(yǎng)于廣東省中醫(yī)院科學(xué)研究中心無菌飼養(yǎng)間內(nèi)（SPF級），裸鼠所用水、飼料、籠具一切器具均經(jīng)高壓蒸汽消毒法滅菌。

1.4 動物分組及處理BALB/C裸小鼠（購自廣州維柏鑫生物科技有限公司，合格證號：1215708），4～6周齡，重量：18～22 g，45只，雌雄各半。觀察裸鼠均健康，取腫瘤細胞懸液，于每只裸鼠左側(cè)或右側(cè)脅腹部皮下注射0.2m L，細胞量為2×106/只。將人大腸癌皮下移植的裸小鼠隨機分為3組，盡量做到雌雄各半。①生理鹽水組：15只，生理鹽水0.5m L灌胃；②加味左金丸低劑量組：15只，以中藥湯藥0.67 g/kg灌胃，相當于60 kg成人用量；③加味左金丸高劑量組：15只，2 g/kg灌胃，相當于60 kg成人用量3倍。7天造模成功后，每組均連續(xù)灌胃1月。

1.5 抑瘤率 觀察裸鼠成瘤時間，腫瘤生長特性。待腫瘤生長至15～75mm3時用于下一步實驗。每組灌胃結(jié)束后，用游標卡尺測量每組裸鼠移植瘤的大小。抑瘤率=1-（加味左金丸各劑量組結(jié)束時平均體積-加味左金丸各劑量組開始時平均體積）/（生理鹽水組結(jié)束時平均體積-生理鹽水組開始時平均體積）×100%。

1.6 移植瘤ERK/MAPK活性 灌胃結(jié)束后的第2天，將裸鼠斷頸處死，快速取下移植瘤體，放入液氮中保存，后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中保存待測。細胞經(jīng)實驗因素處理后，離心收集。使用冰冷的PBS洗滌細胞3次，加入裂解緩沖液振蕩混勻，冰浴30m in，4℃12000 rpm、離心半徑10 cm離心10m in，取上清，即為胞質(zhì)蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。調(diào)整樣品的蛋白量進行SDS—PAGE，將電泳分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。PBST洗膜5m in。室溫下用5%脫脂奶粉（PBST溶解）封閉PVDF膜1 h。隨后加入抗ERK1/2或抗β-actin（1∶2000）4℃孵育過夜。PBST洗脫3次，加入相應(yīng)的二抗，孵育1 h，漂洗3次。將PVDF膜用發(fā)光試劑ECL顯色，暗室中曝光到X光片上，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。

1.7 移植瘤ERK/MAPK mRNA表達量 灌胃結(jié)束后的第2天，將裸鼠斷頸處死，快速取下移植瘤體，放入液氮中保存，后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中保存待測。RT-PCT法檢測組織ERK/MAPK m RNA的表達。采用Trizol試劑（美國IBCO公司），參照說明對各組組織總RNA進行提取。取2μLRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2m in后，94℃變性45 s、52℃退火45 s、72℃延伸1 min，35個循環(huán)，最后72℃延伸7m in。取3μL擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠（EB）顯色，目的條帶用圖像分析系統(tǒng)作吸光度測定，以β-actin為內(nèi)參照，ERK/MAPKm RNA與β-actin吸光度的比值作為ERK/MAPKm RNA的相對含量進行半定量分析，比較不同組ERK/MAPKm RNA表達的差異。ERKMAPKm RNA的引物序列按cDNA文庫查獲，引物由上海賽百勝生物技術(shù)公司合成。β-actin的引物序列：上游引物5-GGATCAGCA AGCAGGAGTATGA-3，下游引物5-CGCAAGTTAGGTTTTT GTCAAGAAAGGGT-3，擴增片段長度為116 bp。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況觀察 見圖1、圖2、圖3。移植瘤接種成功率100%。裸鼠成瘤潛伏期一般3～5天，最長不超過7天。成瘤初表現(xiàn)為皮下黃白色結(jié)節(jié)，成瘤早期癌體基本成橢圓形，表面光滑，2周后逐漸增大為紫藍色結(jié)節(jié)，邊界清，略可活動，觸之質(zhì)中，逐漸不規(guī)則，表面凹凸不平，呈結(jié)節(jié)狀。瘤體表面可見皮下有較多血管進入。裸鼠接種2周內(nèi)，生理鹽水組瘤體生長較快，加味左金丸各劑量組生長較慢。特別在后期，生理鹽水組裸鼠顯得尤為消瘦，擁擠少動，飲食方面各組差異不明顯。當腫瘤直徑達1 cm以后，生長速度較慢，荷瘤鼠漸呈消瘦、精神萎靡、消瘦及惡病質(zhì)衰竭狀態(tài)發(fā)展。剖視腫瘤，大部分呈類圓形，個別形態(tài)不規(guī)則，色灰白，質(zhì)硬。尸檢未見腹腔臟器轉(zhuǎn)移以及心、肝、脾、肺、腎、腦等重要臟器的損傷。

圖1 2周加味左金丸低劑量組

圖2 2周加味左金丸高劑量組

圖3 2周生理鹽水組

2.2 各組腫瘤生長抑制情況比較 見表1。加味左金丸各劑量組裸鼠皮下腫瘤組織生長較生理鹽水組明顯減慢（P＜0.05）。加味左金丸各劑量組組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組腫瘤生長抑制情況比較±s）

表1 各組腫瘤生長抑制情況比較±s）

與同期生理鹽水組比較，①P＜0.05；與同期加味左金丸高劑量組比較，②P＞0.05

組別加味左金丸低劑量組加味左金丸高劑量組生理鹽水組n 15 15 15開始時（cm3）0.095±0.005 0.074±0.004 0.067±0.007用藥第15天（cm3）0.512±0.074①②0.584±0.052①0.678±0.023結(jié)束時（cm3）0.741±0.065①②0.853±0.083①1.254±0.032抑瘤率（%）55.5 58.3

2.3 各組腫瘤組織ERK/MAPK相對活性比較 見表2。加味左金丸各劑量組腫瘤組織生長ERK/MAPK相對活性明顯較低（P＜0.05）。加味左金丸各劑量組組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組腫瘤組織ERK/MAPK相對活性比較?s）

表2 各組腫瘤組織ERK/MAPK相對活性比較?s）

與同期生理鹽水組比較，①P＜0.05；與同期加味左金丸高劑量組比較，②P＞0.05

組別加味左金丸低劑量組加味左金丸高劑量組生理鹽水組n 15 15 15吸光值0.195±0.045①②0.235±0.025①0.364±0.057

2.4 各組腫瘤組織ERK/MAPK mRNA表達量比較 見表3。加味左金丸各劑量組腫瘤組織生長ERK/MAPK相對活性明顯較低（P＜0.05）。加味左金丸各劑量組組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組腫瘤組織ERK/MAPKm RNA表達量比較±s）×106

表3 各組腫瘤組織ERK/MAPKm RNA表達量比較±s）×106

與同期生理鹽水組比較，①P＜0.05；與同期加味左金丸高劑量組比較，②P＞0.05

組別加味左金丸低劑量組加味左金丸高劑量組生理鹽水組n 15 15 15 ERK/MAPKmRNA表達量2.344±0.395①②2.613±0.103①4.045±0.200

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，MAPK信號傳導(dǎo)通路是與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)的重要信號傳導(dǎo)通路之一，MAPK信號傳導(dǎo)通路及機制的闡明對于靶向干預(yù)相關(guān)疾病藥物的研究具有重要意義，必將為惡性腫瘤等重大疾病的治療提供新的思路［1］。雖然并行存在5條MAPK信號通路，其中ERK/MAPK途徑是細胞增殖調(diào)節(jié)最主要的途徑之一，該通路的活化在腸上皮細胞的分化中起了重要作用。ERK/MAPK信號通路的激活涉及結(jié)直腸癌的發(fā)病、進展和致瘤行為的證據(jù)越來越多［2］。ERK/MAPK途徑所有的激酶可能都是治療結(jié)直腸癌的有效靶點，現(xiàn)在許多研究小組在研制新的抑制劑。各條MAPK通路在結(jié)直腸癌中的精確作用成為研究熱點。

加味左金丸為左金丸加青黛，青黛雖為后增藥物，但在處方配伍關(guān)系中居臣藥之位，黃連為君，青黛為臣，吳茱英為佐使。黃連性味苦寒，功效清熱、解毒、燥濕；青黛性味苦寒，功效清熱、解毒、瀉火；吳茱英性味辛溫，功效降逆止嘔、散寒止痛。方中重用黃連入胃、大腸經(jīng)以清熱毒、祛濕熱；青黛與之相須為用，更能增強君藥之功效；少佐辛溫之吳茱英以制君臣藥之過于寒涼，并降逆止嘔、止痛，以兼治惡心嘔吐、疼痛之癥狀。在本研究中，加味左金丸低劑量組對裸鼠移植瘤大腸癌的抑瘤率與高劑量組比較，差異不明顯；加味左金丸各劑量均能使ERK/MAPK的活性降低，抑制ERK/MAPK m RNA的表達，使大腸移植瘤的生長受到抑制。

既往研究表明，在離體的條件下，黃連小檗堿和吳茱萸堿可以誘導(dǎo)大腸癌HT29細胞的凋亡，對HT29細胞生長有明顯的抑制作用，對HT29細胞端粒酶催化亞基（hTERT）表達有抑制作用［3～5］；1，2-DMH誘導(dǎo)大腸癌實驗?zāi)Ｐ椭?，加味左金丸可以有效阻礙早期癌癥的發(fā)生和發(fā)展；在DMH誘導(dǎo)大腸癌的過程中，加味左金丸可以很顯著地干預(yù)癌癥的發(fā)生，在癌癥發(fā)展的進程中，加味左金丸可以有效地延緩癌癥的進程［6］。

加味左金丸在本次試驗中對裸鼠腫瘤組織大小及腫瘤相關(guān)因子有較好的抑制作用，提示中醫(yī)藥防治療大腸具有一定優(yōu)勢，為中醫(yī)藥治療大腸癌提供新的思路與方法，為加味左金丸的臨床應(yīng)用提供了新的實驗依據(jù)，為大腸癌患者的中藥防治、阻斷癌前病變、改善預(yù)后和提高生活質(zhì)量開辟了一條新途徑，拓寬了中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的領(lǐng)域。

［1］季宇彬，胡哲清，鄒翔.MAPK信號通路及其研究進展［J］.中國藥理通訊，2010，27（2）：17-18.

［2］徐偉麗，孫文廣，馬鶯.MAPK信號通路與結(jié)直腸癌［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2010，18（2）：389-392.

［3］譚宇蕙，陳冠林，郭淑杰，等.小檗堿對人胃癌MGC-803細胞生長抑制及誘導(dǎo)凋亡的作用［J］.中國藥理學(xué)通報，2001，17：40-43.

［4］常金榮，文彬，王汝俊，等.吳茱萸堿和小檗堿對HT29細胞凋亡及端粒酶催化亞基（hTERT）表達的影響［J］.中藥藥理與臨床，2008，24（2）：6-8.

［5］常金榮，文彬，王汝俊，等.吳茱萸堿和小檗堿對HT29細胞生長抑制和凋亡作用的影響［J］.中藥新藥與臨床藥理，2008，19（3）：191-195.

［6］文彬，熊曼利，戴偉怡.左金丸及反左金丸對實驗性大腸癌不同時期甲基轉(zhuǎn)移酶表達的影響［J］.世界華人消化雜志，2009，17（20）：2074-2078.

（責(zé)任編輯：駱歡歡）

R285.5

A

0256-7415（2015）02-0230-03

10.13457/j.cnki.jncm.2015.02.107

2014-09-11

廣東省中醫(yī)藥局資助項目（20111209）

胡麗娟（1978-），女，副主任中醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合脾胃病學(xué)。