四川裂腹魚同工酶研究

摘要：采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法，對四川裂腹魚（Schizothorax kozlovi Nikolsky）的眼球、心臟、腎臟、性腺、脾臟、肝臟、腦、鰓和肌肉9種組織中的乳酸脫氫酶同工酶、蘋果酸脫氫酶同工酶、谷氨酸脫氫酶同工酶、乙醇脫氫酶同工酶、酯酶同工酶5種同工酶進行了測定。結(jié)果表明，5種同工酶在四川裂腹魚9種組織均有表達，且具有明顯的組織特異性。

關鍵詞：四川裂腹魚（Schizothorax kozlovi Nikolsky）；乳酸脫氫酶；蘋果酸脫氫酶；谷氨酸脫氫酶；乙醇脫氫酶；酯酶

中圖分類號：S917.4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）18-4540-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.037

同工酶是一類不同基因位點或等位基因表達的產(chǎn)物，同工酶變異比較豐富且能穩(wěn)定遺傳，廣泛應用于種質(zhì)資源評價及魚類群體遺傳學研究中。同工酶技術試驗方法規(guī)范、簡便和快速，具有可以大量檢測分散于整個基因組中各基因座位等位基因間表型變異的特點，且不需要特殊的儀器設備，花費相對低廉，數(shù)據(jù)處理的方法也已被認可，是一種較好的種質(zhì)資源檢測方法[1]。魚類同工酶的研究已報道的主要有：姜建國等[2]對青魚（Mylopharyngodon piceus）不同組織中同工酶的表達模式的研究；張偉[3]對鄱陽湖泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）細胞遺傳與繁殖生物學的研究；馬波等[4]對興凱湖翹嘴紅鲌（Erythroculter ilishaeformis）的肌、肝、眼、心4種組織的8種同工酶（LDH、EST、MDH、IDH、SOD、ME、G-6-PDH、ADH）的研究；唐文家[5]對黃河裸裂尻魚[Schizopygopsis pylzovi Kessler （Kess-ler）.]乳酸脫氫酶同工酶的研究；王金秋等[6]對松江鱸魚（Trachidermus fasciatus）不同組織同工酶的研究；全成干等[7]對大黃魚（Larimichthys crocea）養(yǎng)殖群體遺傳多樣性的同工酶的研究；朱必鳳等[8]對鄱陽湖鱖魚（Siniperca chuatsi）、團頭魴（Megalobrama amblycephala）肌肉4種同工酶的研究；吳瑯虎等[9]對高背銀鯽（Silver prussian carp）、大口胭脂魚（Ictiobus cyprinellus）及胭脂鯽（F1）不同組織的同工酶的表型的分析；吳興兵[10]對江蘇水域7種重要養(yǎng)殖魚類的同工酶和ISSR的分析；段彪等[11]對細鱗裂腹魚[Schizothorax chongi（Fang）]同工酶組織特異性的研究；胡思玉等[12]對昆明裂腹魚（Schizothorax grahami）同工酶組織特異性的研究；劉鴻艷等[13]魚類同工酶的應用及研究進展等。對四川裂腹魚（Schizothorax kozlovi Nikolsky）同工酶的研究，僅見安苗等[14]對其4種組織5種同工酶的研究的報道。因此，本研究對四川裂腹魚9種組織中5種同工酶進行了研究，并與其他魚類同工酶進行了比較，評價其種質(zhì)特性。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用四川裂腹魚標本采自烏江上游總稽河，運回實驗室飼養(yǎng)1周以上。試驗時在冰盤中進行常規(guī)測量，解剖取眼球、肌肉、心臟、性腺、肝臟、鰓、脾臟、腎臟和大腦9種組織。先用0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.0）洗凈、吸去水分后取適量稱重，以樣品∶緩沖液=1∶3（W∶V）的比例混合，勻漿后于4 ℃下15 000 r/min 離心30 min，然后取上清液作電泳分析。

1.2 方法

采用聚丙烯酰胺作電泳支持物，電泳槽為DYCZ-24D型。電泳參考盧龍斗等[15]介紹的方法進行，濃縮膠占5%，分離膠占10%，電極緩沖液為Tris-Gly溶液（pH 8.3）。進樣量45～55 μL，指示劑為溴酚蘭，在4 ℃下進行電泳，染色方法參照盧龍斗等[15]、何忠效等[16]和吳興兵[10]的方法并略加改進，染色完畢后用TANON GIS1000凝膠圖像分析系統(tǒng)進行拍照及結(jié)果分析，同工酶的命名以向陽極方向泳動最快的編為1號，以下各酶分別編為2、3、4等號。

2 結(jié)果與分析

2.1 酯酶（EST）

魚類酯酶的多態(tài)現(xiàn)象非常普遍，酶譜表現(xiàn)復雜。四川裂腹魚EST同工酶的酶譜表現(xiàn)較為復雜，在9種組織中均有表現(xiàn)，各組織中的酶活性均較強，只有肌肉稍弱。9種組織共檢測到7條酶帶（圖1），其中EST1僅在腦中檢出，EST2、EST3僅在肝臟中檢出，分布較廣的是EST5、EST6、EST7，在9種組織中均檢出。

同工酶酶譜可明顯分為3個區(qū)域（圖1），推測至少由3個基因位點編碼，各組織間特異性小，9 種組織均具有EST5、EST6、EST7。EST1僅見于腦，且活性非常弱；EST2、EST3僅見于肝臟，可能與肝臟的解毒作用有關；EST4存在除了性腺和脾臟外的其他7種組織。從EST5、EST6、EST7的活性強度看，EST5在鰓中表現(xiàn)活性最強，EST6、EST7在肝臟中表現(xiàn)活性最強。

2.2 乳酸脫氫酶（LDH）

乳酸脫氫酶（LDH）是參與糖酵解的關鍵酶，現(xiàn)已知大多數(shù)脊椎動物的LDH同工酶由A、B、C 3個位點決定，通常C位點具有組織的差異，其編碼的蛋白質(zhì)電荷與A、B不同。本試驗中共檢測出約17條酶帶（圖2），并具有明顯的組織特異性，表明四川裂腹魚LDH同工酶至少由A、B、C 3個位點控制。LDH5、LDH9、LDH11、LDH14、LDH17等酶僅在肝臟中檢出，LHD8僅在眼球中檢出，LHD15僅在腦中檢出，LDH2僅在眼球和肌肉中檢出，LDH13僅在性腺和鰓中檢出。肝臟中檢出的6種酶，除LDH1在心臟、腎臟、脾臟檢出外，剩下的均未出現(xiàn)在其他組織中。活性最強為心臟中LDH10，最弱的是LDH1在肝臟中的表現(xiàn)。

2.3 蘋果酸脫氫酶（MDH）

蘋果酸脫氫酶（MDH）存在有相互不形成異聚體的線粒體型（m-MDH）和上清液型（s-MDH）兩部分，均是兩個基因編碼的二聚體。四川裂腹魚蘋果酸脫氫酶也有線粒體型（m-MDH）和上清液型（s-MDH）兩種類型（圖3），且具有明顯的組織特異性。線粒體型（m-MDH）的MDH7、MDH8、MDH9僅在脾臟、腦和肌肉中檢出，其中MDH8、MDH9僅在肌肉中檢出，MDH3僅在腦組織中檢出，MDH6僅在肝臟中檢出，MDH1、MDH8、MDH9僅在肌肉中檢出。9種組織共檢測到9條酶帶，多于理論上二聚體兩基因編碼最多形成3條酶帶，可能與m-MDH也存在基因編碼后的化學修飾有關，也有可能與四川裂腹魚的染色體多倍性相關。

2.4 谷氨酸脫氫酶（GDH）

谷氨酸脫氫酶為兩個位點編碼的二聚體，四川裂腹魚9種組織共檢測出13條酶帶（圖4），具有明顯的組織特異性。其中GDH1僅在肝臟中檢出，GDH10僅在鰓組織中檢出，GDH4僅存在性腺和脾臟組織中，GDH6僅存在于腦和肌肉組織中。谷氨酸脫氫酶在心臟和眼球組織中表達較為充分，活性較強，在肝臟、脾臟和性腺等組織中較弱。

2.5 乙醇脫氫酶（ADH）

乙醇脫氫酶為兩個位點編碼的二聚體，四川裂腹魚9種組織共檢測到12條酶帶，酶譜特征較為一致，活性較強，但表現(xiàn)出明顯的組織特異性（圖5）。肝臟中有特異帶ADH1，脾中有特異帶ADH6，腦中有特異帶ADH10。肝臟中ADH1的活性強于其他組織中的活性，可能與肝臟的解毒作用有關。ADH2僅在心臟和腎臟檢出，ADH5僅在眼球和脾臟中檢出。ADH12分布較為廣泛，分布在除眼球外的所有組織中，其次是ADH11和ADH4。酶活性最強的組織是眼球和心臟，最弱的是脾臟。

3 小結(jié)與討論

朱藍菲等[17]對20種鯉科魚類的LDH同工酶進行了比較研究，發(fā)現(xiàn)LDH在鯉科魚類進化中已分成兩種主要支系，一支起源于雅羅魚亞科，表現(xiàn)出A基因的保守性，其特點為LDH-B4同工酶的遷移率不斷變慢，直到與LDH-Aa同工酶接近；另一支起源于鲴亞科，表現(xiàn)出B基因的保守性，其特點是LDH同工酶的遷移率不斷加快，直到與LDH-B4同工酶接近。唐文家[5]對黃河裸裂尻魚的酶譜經(jīng)過比較研究，LDH-A基因和LDH-B基因保守性較差，兩種基因在黃河裸裂尻魚都有表達。

裂腹魚亞科魚類是原始鲃類長期適應高原特殊環(huán)境而產(chǎn)生的一個自然類群，陳毅峰[18]曾推測該亞科魚類應當是四倍體起源的魚類，在其演化中涉及了多倍體甚至多次多倍體過程。本研究中四川裂腹魚5種同工酶的基因位點、酶活性及同工酶類型都存在不同程度的組織特異性，與同為四倍體類型的黃河裸裂尻魚相似。其中，EST的位點和酶帶數(shù)目在歷次研究中起伏較大，除與試驗材料（魚的年齡、發(fā)育階段、生活環(huán)境、生理狀態(tài)、樣本采集與保存等）和試驗方法（電泳支持物、緩沖系統(tǒng)、電泳條件等）有關外，推測可能還與EST本身比較復雜且弱帶顯帶不穩(wěn)定有關。9種組織都有LDH同工酶，但活性有差異，且C基因只位于肝臟中，因而LDH4、LDH7、LDH9、LDH11、LDH13只在肝臟中表現(xiàn)。此外，在眼球和肌肉中還可能存在一些特殊的基因，LDH2僅在這兩種組織中得到表現(xiàn)。MDH在9種組織的分子類型完全不同，酶活性也不完全相同，除腦以外其他組織中都有m-MDH，且活性比較強。GDH和ADH僅在肝臟和肌肉中檢測到活性，而本研究中在幾種組織中均檢測到其活性，與胡思玉等[12]的研究結(jié)果一致，表明它們同屬魚體組織普遍表達的酶帶，這些酶可用于遺傳資源的評估。

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