家蠶黑胸敗血病病原菌的分離鑒定

覃玥等

摘要：從廣西宜州蠶區(qū)暴發(fā)黑胸敗血病的養(yǎng)蠶農(nóng)戶處采集到病蠶樣本，分離到1株病原菌，通過形態(tài)學(xué)觀察和回復(fù)感染健康5齡家蠶試驗及16S rDNA基因序列同源性分析鑒定，結(jié)果顯示病原菌菌落呈橘黃色，光滑，圓形，邊緣整齊，有光澤，濕潤有黏性，革蘭氏染色呈陽性，該菌形態(tài)學(xué)符合葡萄球菌屬的特征；用菌液穿刺感染健康5齡家蠶10 h后蠶體胸部膨大，痙攣側(cè)倒而死，11 h后胸部變黑呈現(xiàn)黑胸敗血病病癥；從腹腔接種菌液的小白鼠16 h內(nèi)全部發(fā)病，從發(fā)病的家蠶體液和死亡小鼠的心血均能分離到與接種菌株形態(tài)一致的細菌，證實該菌為引起家蠶黑胸敗血病的病原菌。菌株16S rDNA片段為1 463 bp（GenBank ID：1811543），與GenBank數(shù)據(jù)進行比較，該菌株與松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri）同源性為99.9%，鑒定該菌株為松鼠葡萄球菌。

關(guān)鍵詞：家蠶細菌?。缓谛財⊙?；松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri）；16Sr DNA；分子鑒定

中圖分類號：S884.4+2 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）18-4529-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.034

細菌病是養(yǎng)蠶生產(chǎn)中最常見的病害，研究發(fā)現(xiàn)對家蠶有致病性的病原細菌主要有葡萄球菌屬（Staphylococcus）、沙雷氏菌屬（SerratiaBizio）、氣單胞菌屬（Aeromonas）、腸桿菌屬（Enterobacter Hormaeche and Edwards）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、鏈球菌屬（Streptococcus）和芽孢桿菌屬（Bacillus）[1]。黑胸敗血病是常見的家蠶細菌病之一，文獻報道其病原主要是芽孢桿菌屬，發(fā)病典型癥狀是在胸部背面或胸腹之間出現(xiàn)黑色斑，很快全身變黑腐爛。廣西宜州市是中國最大的桑蠶生產(chǎn)地，多批次養(yǎng)蠶模式及高溫多濕的氣候使蠶病的發(fā)生非常嚴(yán)重，蠶農(nóng)防治家蠶細菌病主要使用抗生素類藥物，抗生素的不科學(xué)使用容易造成家蠶病原菌耐藥性增強，導(dǎo)致耐藥菌株產(chǎn)生[2]，對桑蠶業(yè)的健康發(fā)展造成很大的威脅，同時細菌在生長繁殖過程中發(fā)生諸如大小改變、結(jié)構(gòu)變化及毒力增強或減弱等的變異現(xiàn)象。2012年6月，宜州市某養(yǎng)蠶戶2張5齡第四天蠶暴發(fā)細菌病，發(fā)病率高達40%，從發(fā)病癥狀判斷為家蠶黑胸敗血病，為了明確引起該例家蠶黑胸敗血病的病原及其特性，采集了家蠶黑胸敗血病蠶樣并分離其病原菌進行形態(tài)學(xué)觀察、革蘭氏染色、回復(fù)感染健康5齡家蠶試驗及分子生物學(xué)鑒定，旨在明確其病原菌的分類地位和特性，為蠶病的防控、蠶藥的合理使用及新藥研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試家蠶

家蠶黑胸敗血病樣本從廣西宜州市某農(nóng)戶家采集，表現(xiàn)為側(cè)倒死亡，胸部背面和胸腹之間出現(xiàn)黑色斑；健康5齡家蠶是兩廣2號，河池學(xué)院桑蠶研究所提供；昆明種小白鼠購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，每只體重約20 g。

1.2 試劑

PCR反應(yīng)試劑、Marker、連接酶、限制性內(nèi)切酶等均購自TaKaRa公司。

1.3 病原菌的分離純化

用75%乙醇對病蠶體表消毒，刺破體壁取體液，用無菌水稀釋后涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)16 h，挑取單個優(yōu)勢菌落進一步純化培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)特征，并進行革蘭氏染色，觀察細菌的形態(tài)和染色結(jié)果[3，4]。

1.4 細菌回復(fù)感染蠶體試驗和病原菌致病力的檢測

分離菌株編號為Cqy201201，將其接種于細菌培養(yǎng)基，30 ℃振蕩培養(yǎng)16 h，用分光光度計測菌液濃度，取1.62×106 CFU/mL的半數(shù)致死量菌液回復(fù)穿刺健康5齡家蠶體壁作回歸試驗，取60只健康5齡家蠶，均分成甲、乙兩組，甲組每只蠶從體壁注射接種2 μL菌液，乙組注射無菌生理鹽水作對照，接種后兩組均投桑葉置于28 ℃飼養(yǎng)。取健康小白鼠12只平均分成2組，其中1組為感染組，每只小白鼠腹腔接種0.1 mL菌液，對照組每只小白鼠腹腔注射0.1 mL無菌生理鹽水。觀察、記錄家蠶和小白鼠發(fā)病情況及死亡時間[5]，并對瀕死的家蠶和試驗鼠進行細菌分離、培養(yǎng)和鑒定。

1.5 細菌的16S rDNA基因擴增鑒定

用DNA抽提試劑盒提取細菌基因組DNA作為PCR模板擴增16S rDNA序列，參照文獻[5]設(shè)計細菌16S rDNA通用引物，上游引物16SF：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′，下游引物16SR：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′，反應(yīng)體系為：2×Es Taq Master Mix 12.5 μL， 10 μmol/L 16SF 1 μL，10 μmol/L 16SR 1 μL，基因組DNA（20～50 ng/μL）1 μL，加9.5 μL ddH2O至總體積為25 μL；反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min， 30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應(yīng) 。取5 μL PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，PCR產(chǎn)物委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序結(jié)果在NCBI進行Blast比對鑒定菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌形態(tài)學(xué)特征

從表現(xiàn)家蠶黑胸敗血病的家蠶體液中分離純化的菌株（編號為Cqy201201）菌落呈圓形、黃色、光滑、不透明、邊緣整齊、有光澤、濕潤有黏性等特征，色素不擴散到培養(yǎng)基中（圖1），革蘭氏染色呈陽性（圖2），無芽孢，無莢膜，不運動，對照《伯杰氏細菌鑒定手冊》第八版描述的菌落形態(tài)特征，該菌形態(tài)學(xué)符合葡萄球菌屬的特征。

2.2 細菌回復(fù)感染和致病性測定

用Cqy201201菌液通過穿刺感染健康5齡家蠶6 h后，試驗組家蠶開始停食，軀體挺直，行動呆滯，頭尾翹起，腹部向腹面拱出，腹足后傾，隨著時間的推移，胸部開始膨大，蠶體的病癥逐漸加重，10 h后，腹部各環(huán)節(jié)收縮，痙攣側(cè)倒而死，11 h后蠶體胸部出現(xiàn)黑色斑，13 h后蠶體全身變黑（圖3），該癥狀與蠶農(nóng)家采集到的黑胸敗血病蠶體癥狀相同，對照組則無異常。從腹腔接種0.1 mL菌液的小白鼠16 h內(nèi)全部發(fā)病，表現(xiàn)昏睡、眼流淚等癥狀，24 h后全部死亡，對照組小白鼠48 h無發(fā)病，從發(fā)病的家蠶體液和死亡小鼠的心血和肝臟均能分離到與接種菌株形態(tài)一致的細菌，說明該菌為引起家蠶黑胸敗血病的病原菌。

2.3 PCR擴增16S rDNA序列分析結(jié)果

以菌株基因組DNA為模板，用16S rDNA基因通用引物16SF/16SR擴增得到Cqy201201菌株16S rDNA片段， PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳，呈現(xiàn)約1.5 kb的條帶（圖4），與預(yù)期結(jié)果相符，測序結(jié)果為1 463 bp（GenBank ID：1811543），將菌株Cqy201201的16S rDNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行Blast相似性搜索，其序列同源性最為接近的菌株均為葡萄球菌屬，與松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri）16S rDNA基因序列有高達99.9%的同源性，表明Cqy201201為松鼠葡萄球菌屬。

3 討論

本研究從出現(xiàn)黑胸敗血病較為嚴(yán)重的農(nóng)戶家的病蠶體分離到1株松鼠葡萄球菌，人工感染試驗證實其對健康5齡家蠶和小白鼠均有較強的致病性，并表現(xiàn)出與自然感染相似的臨床癥狀與病理變化，而且從人工感染的病死蠶和小鼠體內(nèi)再次分離到與原致病菌株形態(tài)特征一致的單一菌株，由此證實菌株Cqy201201是該病的致病菌株。對Cqy201201進行了16S rDNA的克隆與序列分析，結(jié)果顯示Cqy201201與S.sciuri代表株CTSP9 16S rDNA序列的同源性最高，為99.9%，因此可從分子水平上將菌株Cqy201201鑒定為松鼠葡萄球菌。

松鼠葡萄球菌屬是葡萄球菌科的成員之一，Kloos等[6]1976年首次報道，為條件性致病細菌，該菌能夠引起黃鱔魚[7]、黃喉擬水龜[8]等多種動物的急性傳染病，發(fā)生大批量的死亡，造成養(yǎng)殖戶巨大的經(jīng)濟損失，也有引起山羊和奶牛乳房炎，豬滲出性皮炎等動物疾病的報道[9，10]。松鼠葡萄球菌也是外傷感染的主要病原，能引起人的心內(nèi)膜炎、腹膜炎、敗血癥、尿道感染、盆腔炎癥和傷口感染等多種疾病[11-14]，研究發(fā)現(xiàn)ExhC是松鼠葡萄球菌致病機理中的關(guān)鍵因素之一。松鼠葡萄球菌引起家蠶黑胸敗血病尚未見報道，一直認為引起家蠶黑胸敗血病主要病原是芽孢桿菌[15，16]，從發(fā)病到死亡約12～20 h，死后3～4 h出現(xiàn)黑斑。本試驗分離到的松鼠葡萄球菌引起黑胸敗血病的家蠶從發(fā)病到死亡約為11 h，死后2 h出現(xiàn)黑斑，生產(chǎn)上更容易造成家蠶大批量死亡，說明該菌具有較強的致病能力。

松鼠葡萄球菌病是一種環(huán)境性致病菌，控制和防范措施主要是防止及減少家蠶外傷的發(fā)生，注意做好養(yǎng)蠶前的消毒工作。在明確廣西宜州市蠶區(qū)家蠶黑胸敗血病的病原菌特征后，進一步的工作是研究蠶藥及中草藥對該菌的防治效果，科學(xué)合理地防治該病的發(fā)生，控制家蠶細菌病病害流行和蔓延。

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