微酸環(huán)境響應(yīng)的聚天冬氨酸修飾脂質(zhì)體的制備與表征

王麗琳，沈驤一，蘇海佳，曹輝

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微酸環(huán)境響應(yīng)的聚天冬氨酸修飾脂質(zhì)體的制備與表征

王麗琳，沈驤一，蘇海佳，曹輝

（北京化工大學(xué)北京市生物加工過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029）

利用帶負(fù)電的聚天冬氨酸分子與部分帶正電的磷脂雙分子層之間的靜電吸附作用，通過“一步法”成功制備了聚天冬氨酸（PASP）修飾脂質(zhì)體（PLPs），實(shí)現(xiàn)了修飾脂質(zhì)體微酸環(huán)境響應(yīng)性。將脂質(zhì)體制備與PASP修飾同時(shí)完成的“一步法”大大簡化了制備工藝，提高了脂質(zhì)體（PLPs）的制備效率。通過單因素篩選確定了pH敏感性顯著的修飾脂質(zhì)體制備條件，即外水相溶液PASP濃度2.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），pH8.5。透射電子顯微鏡照片顯示PLPs由于修飾劑的存在具有更大的粒徑，且表面電負(fù)性高，證明了“一步法”成功制備了pH敏感性修飾脂質(zhì)體。

pH敏感；聚天冬氨酸；脂質(zhì)體；制備；納米粒子

引 言

腫瘤是一種極大危害人類健康的疾病。多年來人們一直致力于開發(fā)高效抗腫瘤藥物，發(fā)現(xiàn)并推廣使用了諸如羥基喜樹堿[1]、紫杉醇[2]、萊菔硫烷[3]等新一代抗腫瘤藥物。然而在研究中發(fā)現(xiàn)，多數(shù)藥物分子為非選擇性分子，進(jìn)入人體后會廣泛分布于各器官組織，在抑制腫瘤細(xì)胞的同時(shí)會抑制正常細(xì)胞的生長，引起病人的極大痛苦[4]。因此，針對傳統(tǒng)給藥方式存在的局限性，越來越多研究者著重于藥物遞送系統(tǒng)(drug delivery system)[5]的研究，包括口服藥物釋放系統(tǒng)、透皮藥物釋放系統(tǒng)、黏膜藥物釋放系統(tǒng)、靶向藥物釋放系統(tǒng)、細(xì)胞微囊化藥物釋放系統(tǒng)[6]等，其中，靶向藥物釋放系統(tǒng)能夠有效地將藥物運(yùn)送至病變區(qū)[7]，降低給藥劑量、避免抗腫瘤藥物對正常組織的危害。脂質(zhì)體是一種人工制備的生物膜類似物，由脂類雙分子層組成，主要成分是磷脂和膽固醇，易與細(xì)胞膜融合并完成細(xì)胞內(nèi)吞作用[8]，具有生物降解性和緩釋性，可降低藥物的毒性、提高藥物的穩(wěn)定性[9]，因此成為新型的藥物載體廣泛應(yīng)用于抗腫瘤藥物的靶向釋放[10]。脂質(zhì)體制備方法繁多，早期對于脂質(zhì)體制備的摸索停留在改變有機(jī)相與水相接觸方式以及蒸出方式上，形成了物理分散法、兩相分散法等傳統(tǒng)方法[11-12]。傳統(tǒng)方法的優(yōu)點(diǎn)是對設(shè)備要求低、制作方便；缺點(diǎn)是粒徑和結(jié)構(gòu)難以控制且難以規(guī)?；苽?。隨著研究的不斷深入和人們對脂質(zhì)體產(chǎn)品的需求增加，可制備出粒徑可控、結(jié)構(gòu)可控的脂質(zhì)體的微流體法[13]、超臨界流體法[14]等應(yīng)運(yùn)而生。目前脂質(zhì)體作為抗腫瘤藥物載體的主要研究目標(biāo)是提高其靶向性和穩(wěn)定性。為起到靶向治療的目的，長循環(huán)脂質(zhì)體[15]、溫度敏感脂質(zhì)體[16]、pH敏感脂質(zhì)體[17]、磁性脂質(zhì)體[18]、免疫脂質(zhì)體[19]等新型脂質(zhì)體被陸續(xù)研制出來。其中，pH敏感脂質(zhì)體可通過在脂質(zhì)體表面修飾具有pH響應(yīng)性的分子得到[20]。腫瘤細(xì)胞生長于微酸性間質(zhì)液中（pH約為5.0），用于制備腫瘤靶向藥物載體的修飾分子必須可響應(yīng)pH7.4～pH5.0的微弱酸性變化，這樣才能達(dá)到藥物在腫瘤組織中快速大量釋放、在正常組織的生理環(huán)境中少量釋放的目的。目前已有研究顯示表面活性劑類物質(zhì)[21]、聚丙烯酸及其衍生物[22]制備的修飾脂質(zhì)體可以起到響應(yīng)微酸環(huán)境的作用，但上述修飾分子自身生物相容性不高，容易對正常機(jī)體造成傷害。

聚天冬氨酸（PASP）是一種含有豐富—COO-基團(tuán)的陰離子型生物大分子，pa=4.88，處于弱酸性環(huán)境中即可發(fā)生構(gòu)象變化[23]。由于其具有良好的生物相容性、水溶性以及pH敏感性，在藥物遞送領(lǐng)域有著巨大的前景[24]。本文制備脂質(zhì)體的主要成分大豆卵磷脂中含有相當(dāng)一部分的磷脂酰膽堿，其頭部的—N+基團(tuán)帶正電，理論上PASP可通過靜電吸附作用自發(fā)組裝到脂質(zhì)體表面。若將PASP修飾于脂質(zhì)體表面，當(dāng)PASP修飾脂質(zhì)體（PLPs）處于pH5.0左右的腫瘤組織病灶環(huán)境中，PASP會發(fā)生鏈?zhǔn)湛s效應(yīng)，扯斷與之相連接的脂質(zhì)體，造成藥物釋放，而當(dāng)PLPs處于正常組織生理環(huán)境中時(shí)，PASP鏈維持舒展的構(gòu)象，則PLPs結(jié)構(gòu)保持完整，僅發(fā)生少量藥物釋放。長久以來，修飾脂質(zhì)體的制備遵循“脂質(zhì)體形成-脂質(zhì)體修飾”兩步進(jìn)行，修飾過程需要經(jīng)過1～2 h的水合過程[25]才能完成，制備效率不高。

本文將針對兩步制備修飾脂質(zhì)體工藝煩瑣的問題，提出脂質(zhì)體形成-修飾同時(shí)完成的一步制備法。該“一步法”用修飾劑PASP溶液代替復(fù)乳法中的外水相緩沖液，制備出響應(yīng)弱酸性環(huán)境發(fā)生藥物快速釋放的脂質(zhì)體。此外，考慮到PLPs的pH敏感性來源于PASP，因此外水相PASP溶液的濃度及pH必然會影響PLPs的pH敏感性，本文將研究影響pH敏感性的條件，以測試不同pH環(huán)境中的藥物釋放性能為手段，從而確定PASP修飾脂質(zhì)體外水相PASP的最佳濃度及pH。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

大豆卵磷脂（純度≥98%），北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；膽固醇（純度≥99%），北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；乙醚（分析純）、NaCl（分析純）、Na2HPO4(分析純)、NaH2PO4（分析純），北京化工廠；阿糖胞苷（分析純），車頭制藥廠；硫酸魚精蛋白（分析純），Sigma；Triton X-100（10%），Sigma；本文實(shí)驗(yàn)中所述PASP皆為實(shí)驗(yàn)室自制。

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，DHG-9076A型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；水浴恒溫磁力攪拌器，SHA-A，金壇市華峰儀器有限公司；全波長酶標(biāo)儀，Thermo absystems，Multiskan Spectrum公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠；高速離心機(jī)，TGL-16G，上海安亭科技儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 pH敏感脂質(zhì)體的制備 “一步法”制備pH敏感脂質(zhì)體，具體方法見文獻(xiàn)[26]。

“分步法”制備pH敏感脂質(zhì)體：精密稱取卵磷脂48 mg，膽固醇12 mg，加入2.5 ml乙醚充分溶解。置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀0.02 MPa、25℃旋蒸30 min，注入阿糖胞苷水溶液1 ml，超聲至形成乳液。加入2.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）的PASP水溶液充分搖勻，30℃水合40 min，置于截留分子量3500的透析袋中透析除去未包封的小分子藥物，即得[26]。

1.2.2 pH敏感脂質(zhì)體的工藝優(yōu)化 外水相PASP溶液濃度對修飾脂質(zhì)體pH敏感性的影響。以“一步法”制備修飾脂質(zhì)體，PASP溶液濃度為1.5%、2%、2.5%、3%。采用文獻(xiàn)[26]所述反透析法測定pH敏感性以確定制備修飾脂質(zhì)體的最佳PASP濃度。

外水相PASP溶液pH對修飾脂質(zhì)體pH敏感性的影響。以“一步法”制備阿糖胞苷脂質(zhì)體。PASP溶液pH分別為8.0、8.5、9.0、9.5。采用文獻(xiàn)[26]所述反透析法測定pH敏感性以確定制備修飾脂質(zhì)體的最佳外水相pH。

1.2.3 修飾脂質(zhì)體的理化性質(zhì)表征 修飾脂質(zhì)體的透射電子顯微鏡觀察。“一步法”制備LPs和PLPs：精密吸取制好的脂質(zhì)體樣品各10ml，以微量可調(diào)移液器小心滴加在銅網(wǎng)上，置于透射電鏡下200 kV電壓下觀察。

修飾脂質(zhì)體的表面電荷和粒度分析?！耙徊椒ā敝苽銵Ps、PLPs，并分別稀釋成質(zhì)量摩爾濃度為0.005 mol·kg-1的溶液，于激光粒度分布儀中測定zeta電位及粒度分布。

2 結(jié)果與討論

2.1 pH敏感修飾脂質(zhì)體的“一步法”制備方法

圖1為利用“分步法”與“一步法”分別制備的PLPs在不同酸堿性環(huán)境中的藥物釋放曲線。由圖所示，“分步法”制得的修飾脂質(zhì)體在微酸環(huán)境中（pH=5.0）釋放緩慢，在生理pH環(huán)境中（pH=7.4）釋放快速，與微酸性響應(yīng)的藥物載體的要求相反，無法得到微酸性環(huán)境響應(yīng)的PASP修飾脂質(zhì)體。這可能是由于長鏈PASP難以與已經(jīng)閉合為囊泡的磷脂頭部發(fā)生靜電吸附作用，pH敏感性的PASP分子無法與脂質(zhì)體結(jié)合造成的。而“一步法”制備的PLPs在微酸性環(huán)境中（pH=5.0）6 h內(nèi)釋放完全，而相同時(shí)間內(nèi)在正常生理環(huán)境下（pH=7.4）釋放79.4%，實(shí)現(xiàn)了在微酸環(huán)境中快速釋放的目的。這是因?yàn)椤耙徊椒ā辈捎贸浞秩ベ|(zhì)子化的PASP水溶液直接作為外水相，能夠提供PASP中的電負(fù)性—COO-基團(tuán)與正電性膽堿基團(tuán)充分接觸的機(jī)會?！耙徊椒ā北ＷC了脂質(zhì)體的形成和修飾過程一次性完成。PLPs的特點(diǎn)顯示其具有成為腫瘤靶向藥物載體的潛力。

2.2 修飾脂質(zhì)體的pH敏感性優(yōu)化

2.2.1 外水相溶液（PASP）濃度對修飾脂質(zhì)體pH敏感性的影響 外水相PASP的濃度直接影響脂質(zhì)體的修飾程度，從而改變pH敏感性和釋放時(shí)間。由圖2所示，外水相（PASP）濃度對PASP修飾脂質(zhì)體的pH敏感性影響較大。在相同時(shí)間內(nèi)（4 h），當(dāng)外水相濃度為2.5%時(shí)，PLPs在pH5.0環(huán)境中藥物釋放超過85%，顯著高于在pH7.4環(huán)境中52.4%的釋放，這種釋放量的差異性顯著高于其他濃度PASP溶液制備的PLPs。PLPs對微酸環(huán)境的響應(yīng)性取決于pH敏感性分子PASP在脂質(zhì)體表面的實(shí)際修飾程度。當(dāng)PASP溶液濃度低于2%時(shí)，PLPs中pH敏感性分子不足，無法表現(xiàn)出pH敏感性。當(dāng)PASP濃度升高至3%時(shí)PLPs的pH敏感性回落，這是因?yàn)镻ASP濃度過高，聚合物PASP長鏈可能在溶液中形成折疊或螺旋構(gòu)象，分子間也會產(chǎn)生位阻，不利于與脂質(zhì)體靜電吸附。因此，PLPs的pH敏感性與PASP的濃度并非線性關(guān)系，當(dāng)PASP濃度為2.5%時(shí)，PLPs體現(xiàn)出最強(qiáng)的pH敏感性，如圖3所示，此時(shí)PLPs在整個(gè)釋放周期內(nèi)pH敏感性顯著，6 h內(nèi)藥物在微酸環(huán)境總釋放完全而在正常生理環(huán)境中釋放不超過60%，適于用作腫瘤靶向的藥物載體。

2.2.2 外水相溶液（PASP）pH對修飾脂質(zhì)體pH敏感性的影響 PASP能與脂質(zhì)體靜電吸附結(jié)合的先決條件是外水相溶液中的PASP能夠電離出足夠的電負(fù)性—COO-基團(tuán)。為使弱電解質(zhì)PASP充分解離出—COO-以便與磷脂分子的親水頭部靜電吸附結(jié)合，實(shí)驗(yàn)中均調(diào)節(jié)外水相PASP的pH為堿性。由圖4所示，當(dāng)外水相pH為8.0～8.5時(shí)，PLPs表現(xiàn)出對于微酸性環(huán)境的pH敏感性，藥物釋放快速。說明當(dāng)pH達(dá)到8.0及以上時(shí)，弱電解質(zhì)PASP 已發(fā)生充分的電離。當(dāng)外水相pH提高至9.0時(shí)PLPs在酸性環(huán)境和正常生理環(huán)境中的藥物釋放十分接近而不能滿足pH敏感性藥物載體的要求；將外水相溶液的堿性繼續(xù)提高至pH9.5時(shí)，其pH敏感性甚至發(fā)生反轉(zhuǎn)，可能是因?yàn)橥馑嘀羞^量的堿加入會破壞脂質(zhì)體囊泡的滲透壓平衡，加速脂質(zhì)體的作用而使pH敏感性失效。綜上所述，僅當(dāng)pH8.5時(shí)，PLPs有較好的pH敏感性，圖5顯示此時(shí)的PLPs在釋放結(jié)束時(shí)pH5.0環(huán)境中藥物累計(jì)釋放率在90%以上，效果理想。

2.3 修飾脂質(zhì)體的理化性質(zhì)表征

2.3.1 修飾脂質(zhì)體的形態(tài)觀察 如圖6所示，電鏡下觀察到LPs、PLPs皆分散良好，電鏡下大致呈圓形。其中，普通脂質(zhì)體直徑約100 nm，而PLPs由于表面連接了高分子物質(zhì)而使粒徑增大至200 nm。透射電子顯微照片從直觀上論證了PASP分子可通過“一步法”有效修飾于脂質(zhì)體表面。

2.3.2 修飾脂質(zhì)體的表面電性與粒度分析 zeta電位能夠反映膠體分散系的帶電程度，還可以表示微粒的分散程度。LPs和PLPs的zeta電位和粒度分析測定值見表1。一般認(rèn)為，zeta電位的絕對值在30 mV以上可以認(rèn)為體系中微粒之間的作用以排斥力為主，不易聚沉。從表1中可以看出，LPs和PLPs 都是穩(wěn)定的膠體體系。PASP鏈負(fù)電性基團(tuán)豐富，因而PLPs的zeta電位值均高于LPs。表1顯示的粒度分析變化趨勢與zeta電位變化趨勢相吻合，表明脂質(zhì)體的理化性質(zhì)與其表面是否具有修飾分子相關(guān)，再次證明了“一步法”制備pH敏感性修飾脂質(zhì)體應(yīng)用成功。

表1 兩種脂質(zhì)體的平均粒度與zeta電位Table 1 Mean size and zeta potential of two kinds of liposomes

3 結(jié) 論

本文成功運(yùn)用“一步法”制備了pH敏感性顯著的聚天冬氨酸修飾脂質(zhì)體（PLPs）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PLPs的pH敏感性強(qiáng)弱與PASP溶液濃度和pH有關(guān)，隨PASP濃度和pH增大呈現(xiàn)先增加后減小趨勢，當(dāng)溶液濃度2.5%、pH為8.5時(shí)pH敏感性最佳。透射電鏡下觀察與粒度分布顯示PLPs粒徑高于LPs，同時(shí)zeta電位測試顯示PLPs表面電負(fù)性強(qiáng)于LPs，兩項(xiàng)理化性質(zhì)測試表明“一步法”可以將電負(fù)性大分子PASP修飾于脂質(zhì)體表面，成功制備了pH敏感性修飾脂質(zhì)體。

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Preparation and characterization of subacid environment responsive polyaspartic acid modified liposomes

WANG Lilin，SHEN Xiangyi，SU Haijia，CAO Hui

Beijing Key Laboratory of BioprocessBeijing University of Chemical TechnologyBeijingChina

PASP modified liposomes (PLPs) were prepared by using negatively charged PASP chains linked to the head of positively charged phospholipidelectrostatic adsorption. A “one-step” method was developed to form and modify the liposomes. Single factor experiments were conducted to prepare high pH sensitive PLPs. The optimal formula in preparing PLPs was 2.5%(mass) PASP solution with pH8.5. TEM results showed that PASP modified liposomes had a larger particle size and their surface with higher electro-negativity. PASP modified liposomes are a kind of relatively stable emulsion system.

pH sensitivity；polyaspartic acid；liposomes；preparation；nanoparticles

2014-09-15.

Prof. SU Haijia, suhj@mail.buct.edu.cn

10.11949/j.issn.0438-1157.20141374

R 944.1

A

0438—1157（2015）03—1234—06

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2014CB745100）；國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2012AA021402)；教育部留學(xué)回國人員科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(LXJJ2012-001)。

2014-09-15收到初稿，2014-11-28收到修改稿。

聯(lián)系人：蘇海佳。第一作者：王麗琳（1989—），女，碩士研究生。

supported by the National Basic Research Program of China (2014CB745100), the National High Technology Research and Development Program of China (2012AA021402) and the Project-sponsored by SRF for ROCS, SEM (LXJJ2012-001).