土壤中產(chǎn)廣譜抗菌肽菌株的篩選及鑒定

唐峰，李哲，王鐵良，唐雨順，劉永華，寇敘，劉秀萍?

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州121001；2.天津市津南區(qū)畜牧水產(chǎn)發(fā)展服務(wù)中心，天津300350）

土壤中產(chǎn)廣譜抗菌肽菌株的篩選及鑒定

唐峰1，李哲2，王鐵良1，唐雨順1，劉永華1，寇敘1，劉秀萍1?

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州121001；2.天津市津南區(qū)畜牧水產(chǎn)發(fā)展服務(wù)中心，天津300350）

用雙層平板法從土壤中分離到4株具有廣譜抑菌活性的菌株，利用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定其對(duì)鼠傷寒沙門菌、大腸桿菌、福氏志賀菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉菌的抑菌能力，篩選其中抑菌能力最強(qiáng)的菌株命名為JZ4。菌液上清分別經(jīng)過(guò)鹽析、透析或與蛋白酶作用后測(cè)定其抑菌能力，發(fā)現(xiàn)該抑菌物質(zhì)中含有肽類物質(zhì)。經(jīng)16S rDNA序列比對(duì)，初步鑒定其為側(cè)孢短芽孢桿菌。

土壤；抗菌肽；抑菌；側(cè)孢短芽孢桿菌

抗菌肽也稱抗微生物肽，是生物體固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分。抗菌肽不僅具有抗細(xì)菌的活性，而且具有抗真菌、抗寄生蟲、腫瘤的活性[1]。使用抗菌肽作為飼料添加劑代替抗生素已成為飼料學(xué)科的研究熱點(diǎn)。與動(dòng)物抗菌肽和植物抗菌肽相比，細(xì)菌抗菌肽提取容易、生產(chǎn)周期短。但是，目前開發(fā)利用的細(xì)菌抗菌肽為數(shù)較少。本試驗(yàn)通過(guò)篩選所獲得的抗菌肽具有廣譜抗菌能力，對(duì)常見(jiàn)病原菌具有較好的抑菌效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品采自錦州市8個(gè)飼料廠的土壤，共24份。

1.1.2 指示菌鼠傷寒沙門菌、大腸桿菌、福氏志賀菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉（本實(shí)驗(yàn)室保存）。

1.1.3 培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂，購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.4 引物27f：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492-r：TACGGCTACCTTGTTACGACTT。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)抑菌物質(zhì)菌株的分離、純化采用雙層平板法[2]。將土壤做梯度稀釋，取0.5 mL懸濁液加入到已接種金黃色葡萄球菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，再加入45℃營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，混勻。25℃培養(yǎng)。挑取產(chǎn)生抑菌圈的菌落，進(jìn)行純化。

1.2.2 產(chǎn)抑菌物質(zhì)菌株的篩選分別以鼠傷寒沙門菌、大腸桿菌、福氏志賀菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉為指示菌，用生理鹽水稀釋至OD600=0.2，與營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基混勻制成指示平板。將產(chǎn)抑菌物質(zhì)菌株接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，25℃200 r/min培養(yǎng)24 h，8 000 r/min離心10 min，取上清。采用瓊脂打孔擴(kuò)散法測(cè)定上清的抑菌效果。

1.2.3 抑菌物質(zhì)的初步鑒定對(duì)抑菌能力較強(qiáng)菌株產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)成分進(jìn)行鑒定。①有機(jī)酸堿作用的排除：比較培養(yǎng)24 h后的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基與接種前的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的pH，判斷是否產(chǎn)生有機(jī)酸堿。②鹽析后抑菌活性測(cè)定：用65%的硫酸銨對(duì)4 mL菌液上清進(jìn)行鹽析，用磷酸鹽緩沖液溶解沉淀后，進(jìn)行抑菌活性測(cè)定。③透析后抑菌活性測(cè)定：用透析袋（8～14 kD）對(duì)4 mL菌液上清進(jìn)行透析，用PEG 20000濃縮，濃縮液用磷酸鹽緩沖液調(diào)整至4 mL，進(jìn)行抑菌活性測(cè)定。④蛋白酶處理后菌活性測(cè)定：將0.4 mL菌液上清加到終濃度為l mg/mL的蛋白酶K或胃蛋白酶中，調(diào)整蛋白酶K的pH=7.0，胃蛋白酶pH=2～3，37℃水浴4 h，進(jìn)行抑菌活性測(cè)定。

1.2.416 S rDNA序列分析利用通用引物27f、1492r擴(kuò)增純化后的菌液，將PCR產(chǎn)物測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在GenBank中比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選24份土壤中，得到4株具有明顯抑菌能力的菌株，分別命名為JZ1、JZ2、JZ3、JZ4。其中JZ4的抑菌能力最強(qiáng)?？咕V見(jiàn)表1。

表1 不同菌株的抑菌環(huán)直徑Table1 Differences in the bacteriostatic ring diametermm

2.2 抑菌物質(zhì)的初步鑒定JZ4培養(yǎng)24 h后的菌液上清pH=7.5，與培養(yǎng)基自身的pH未見(jiàn)明顯區(qū)別。所以，JZ4的抑菌能力不是由有機(jī)酸或堿產(chǎn)生的。菌液經(jīng)鹽析、透析以及蛋白酶處理后抑菌環(huán)直徑如表2所示。其中，經(jīng)鹽析后的蛋白粗提液抑菌圈大于鹽析前菌液的抑菌圈。菌液經(jīng)透析后，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈未見(jiàn)明顯變化。菌液對(duì)胃蛋白酶有一定敏感性，抑菌能力有所下降。綜合以上結(jié)果，可以初步判斷該菌液的抑菌物質(zhì)含有肽類物質(zhì)或蛋白質(zhì)。

表2 JZ4菌株經(jīng)不同處理后對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌環(huán)直徑Table2 Bacteriostatic ring diameter after different treatment of JZ4

2.3 測(cè)序結(jié)果菌株JZ4的16S rDNA序列與Brevibacillus laterosporus strain BL-1同源性為99%。利用DNAMan軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖1所示。菌株JZ4在親緣關(guān)系上與側(cè)孢短芽孢桿菌屬非常相近，初步鑒定為側(cè)孢短芽孢桿菌。

3 討論

圖1 菌株JZ4系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phyletic evolution tree of JZ4

抗菌肽的來(lái)源可以分為4大類，即昆蟲、動(dòng)物、微生物及人工合成。已有報(bào)道的抗菌肽總量多達(dá)1 500種[3]，其中，從土壤微生物中分離得到的抗菌肽報(bào)道較少。土壤中微生物種類復(fù)雜，來(lái)源豐富，因此土壤是篩選分泌抗菌肽菌株的理想來(lái)源。研究表明，飼糧中添加抗菌肽能抑制病菌繁殖，通過(guò)改善動(dòng)物腸道菌群結(jié)構(gòu)[4]，促進(jìn)動(dòng)物健康[5]并提高生產(chǎn)性能[6]。與目前飼料中廣泛使用的獸藥相比，抗菌肽不會(huì)在動(dòng)物性食品中殘留，不易產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性[7]。因此，抗菌肽有望替代獸藥，成為新型飼料添加劑，并已展現(xiàn)出誘人的前景[8-9]。由于抗菌肽生產(chǎn)成本較高，因此限制了抗菌肽在生產(chǎn)中的應(yīng)用。利用基因工程菌異源表達(dá)抗菌肽是一種新模式。利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)[10]、畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)[11]表達(dá)抗菌肽的報(bào)道陸續(xù)出現(xiàn)。本研究組計(jì)劃在獲得分泌抗菌肽菌株的基礎(chǔ)上，純化抗菌肽并進(jìn)一步研究其抗菌活性和理化性質(zhì)，并利用基因工程菌異源表達(dá)該抗菌肽。

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（編輯：張婷婷）

Identification and Screening of Broad-spectrum Antibiotics-producing Strains from Soil

Tang Feng1,Li Zhe2,Wang Tieliang1,Tang Yushun1, Liu Yonghua1,Kou Xu1,Liu Xiuping1*

(1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Liaoning Medical University,LiaoningJinzhou 121001; 2.Jinnan Develop and Service Center of Animal Husbandry and Aquaculture,Tianjin300350)

In this study,4 strains with broad-spectrum antibacterial activitywere isolated from soil with double-plate method,and the inhibition activity against Salmonella typhimurium,E. coli,Shigella,Staphylococcus aureus,and Aspergillus niger were determined by agar diffusion method.1 strain named JZ4 with greater inhibition zone was identified.Salting-out,dialysis and protease experiment were carried out and then preliminary determined that the antibiotics were antibacterial peptide.According to the sequence of 16S rDNA,strain JZ4 were identified as Brevibacillus laterosporus.

Soil;Antibacterial peptide;Inhibition activityl;Brevibacillus laterosporus

S852.6文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B文章編號(hào)：1672-9692(2015)02-0011-04

2014-11-14

唐峰（1980-），男，博士，副教授，主要從事動(dòng)物防疫檢疫方向的研究。

劉秀萍（1963-），女，本科，副教授，主要從事動(dòng)物性食品檢疫檢驗(yàn)方向的研究。

遼寧醫(yī)學(xué)院橫向課題（LYHX2012076）、遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項(xiàng)目（L2012306）、遼寧省科技廳自然科學(xué)基金（聯(lián)合基金）項(xiàng)目（2013022041）