大腸桿菌產(chǎn)海藻糖合成酶發(fā)酵條件優(yōu)化

楊梅玉，趙　偉，陳文娜，張?jiān)惠x，曹大鵬

（山東福洋生物科技有限公司，山東德州253100）

大腸桿菌產(chǎn)海藻糖合成酶發(fā)酵條件優(yōu)化

楊梅玉，趙偉，陳文娜，張?jiān)惠x，曹大鵬

（山東福洋生物科技有限公司，山東德州253100）

采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，研究海藻糖合成酶發(fā)酵過程中加誘導(dǎo)劑時(shí)菌濃OD600nm、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間、海藻糖合成酶轉(zhuǎn)化海藻糖時(shí)間4個(gè)因素對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響，確定大腸桿菌產(chǎn)海藻糖合成酶轉(zhuǎn)化海藻糖的最優(yōu)條件組合。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化時(shí)間和誘導(dǎo)溫度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響較大，在大腸桿菌生長到菌濃OD600nm值為0.8時(shí)加誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)溫度26℃保持8 h，在轉(zhuǎn)化過程中反應(yīng)14 h為最佳搭配。在此最佳條件下，海藻糖的轉(zhuǎn)化率可達(dá)69.29%。

海藻糖；海藻糖合成酶；大腸桿菌；發(fā)酵條件

海藻糖（trehalose）又稱α-D-吡喃葡糖苷基-α-D-吡喃葡糖苷，是一種非還原性二糖，無毒無害，在自然界中許多可食用的動(dòng)植物及微生物體內(nèi)廣泛存在，被稱為“生命之糖”［1-2］。海藻糖具有良好的穩(wěn)定性和獨(dú)特的生物學(xué)特性，如對(duì)生物體和生物大分子具有優(yōu)良的抗逆保護(hù)作用。大量研究表明，生物體對(duì)外界環(huán)境脅迫（如干燥、高溫、高滲透壓、輻射等）表現(xiàn)出的抗逆耐受力與其體內(nèi)存在的海藻糖有直接關(guān)系［3-6］。海藻糖的生產(chǎn)方法主要有天然生物提取法、微生物發(fā)酵法、化學(xué)合成法、基因工程法和酶轉(zhuǎn)化法［1］。其中酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)海藻糖一直是工業(yè)生產(chǎn)海藻糖的主要途徑。海藻糖合成酶（trehalose synthase）是生產(chǎn)海藻糖的工業(yè)酶，其通過轉(zhuǎn)糖基作用直接將麥芽糖的α-1，4糖苷鍵轉(zhuǎn)化為α-1，1糖苷鍵生成海藻糖，反應(yīng)流程短，非常容易調(diào)節(jié)和控制，既不需要消耗高能物質(zhì)，也不需要與磷酸鹽共存，海藻糖的轉(zhuǎn)化率高且不受麥芽糖濃度的影響，麥芽糖價(jià)格低廉易得，因此在工業(yè)化生產(chǎn)海藻糖中具有良好的應(yīng)用前景［7-10］。

海藻糖合成酶主要存在于微生物細(xì)胞中［11］，大部分已發(fā)現(xiàn)的野生菌株存在細(xì)胞海藻糖合成酶酶活較低，海藻糖產(chǎn)率低等問題，目前工業(yè)應(yīng)用的菌種一般均為基因工程菌。黃英等［12］在大腸桿菌（Escherichia coli）中采用克隆技術(shù)表達(dá)了玫瑰鏈霉菌（Streptosporangium roseum）海藻糖合成酶基因，所產(chǎn)的海藻糖合成酶可轉(zhuǎn)化82%以上的麥芽糖形成海藻糖。高超等［13］將哈氏噬纖維菌（Cytophaga hutchinsonii）中克隆獲得的海藻糖雙功能合成酶基因（tpsp）表達(dá)到E.coli中，通過發(fā)酵罐轉(zhuǎn)化，海藻糖的產(chǎn)量達(dá)到13.3 g/L。宿玲恰等［14］通過聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增獲得來源于嗜熱棲熱菌（Thermus thermophilus）ATCC33923的海藻糖合酶基因Tre S，構(gòu)建了基因工程菌E.coli，通過搖瓶工藝優(yōu)化，轉(zhuǎn)化率最高49.0%。

本研究通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，檢測(cè)海藻糖合成酶發(fā)酵過程中加誘導(dǎo)劑時(shí)的菌濃OD600nm、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間、海藻糖合成酶轉(zhuǎn)化海藻糖過程中轉(zhuǎn)化時(shí)間4個(gè)因素，尋找大腸桿菌產(chǎn)海藻糖合酶轉(zhuǎn)化海藻糖的最優(yōu)條件組合，為海藻糖工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1材料

大腸桿菌（Escherichia coli）：山東福洋生物科技有限公司。

1.1.2培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：NaCl 10 g/L、酵母粉5 g/L、蛋白胨10 g/L、氨芐西林鈉0.1 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖4.0 g/L、NaCl 0.5 g/L、KH2PO43.0 g/L、Na2HPO4·12H2O 15.1 g/L、MgSO4·7H2O 1.0 g/L、NH4Cl 1.0 g/L、無水CaCl20.01 g/L、玉米漿1 mL/L、氨芐西林鈉0.1 g/L，25%氨水和5%的磷酸，控制pH 7.0。

1.1.3試劑

酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、氯化鈉、磷酸二氫鉀、十二水磷酸氫二鈉、七水硫酸鎂、氯化銨、無水氯化鈣（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；海藻糖：美國Sigma公司；乙腈（色譜純）：西隴化工股份有限公司；氨水：萊陽市康德化工股份有限公司；注射用氨芐西林鈉：山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

15 L發(fā)酵罐和過程參數(shù)檢測(cè)與控制系統(tǒng)FUS-15L（A）：國家生化工程技術(shù)研究中心（上海）；尾氣過程質(zhì)譜儀MAX300-LG：美國Extrel公司；InPro3250 pH電極和Inpro 6800溶氧電極：美國METTIER TOLEDO公司；LC-20AT型高效液相色譜儀（配Waters 515泵、Waters 2414型示差折光檢測(cè)器、N2000雙通道色譜工作站）：美國Waters公司；722型分光光度計(jì)：上海奧譜勒儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1海藻糖合成酶的誘導(dǎo)

將低溫保存的大腸桿菌菌株QB1接種到種子培養(yǎng)基中活化，在搖床上轉(zhuǎn)速220 r/min，溫度37℃條件下培養(yǎng)6～8 h。無菌條件下轉(zhuǎn)接到15 L發(fā)酵罐中，接種量1%，在溫度37℃、轉(zhuǎn)速600 r/min、通氣量7.5 L/min、pH 7.0的條件下發(fā)酵大腸桿菌。當(dāng)菌種達(dá)到適當(dāng)菌濃時(shí)降低溫度，流加終含量為0.2%的乳糖誘導(dǎo)。

1.3.2海藻糖合成酶粗酶液的制取

誘導(dǎo)后的大腸桿菌發(fā)酵液在10 000 r/min條件下離心10 min收集菌體，用50 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.0）洗滌菌體，并定容至原發(fā)酵液體積，配成菌懸液，勻漿機(jī)破碎3次，即得到海藻糖合成酶粗酶液。

1.3.3海藻糖合成酶轉(zhuǎn)化海藻糖

以終含量為30%的麥芽糖水溶液作為底物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，具體為150 mL三角瓶中加入20 mL 75%的麥芽糖和30 mL粗酶液，混勻，于55℃、120 r/min搖床中反應(yīng)。結(jié)束后取出，沸水浴10min滅酶，冷卻過濾后用超純水稀釋100倍，0.22μm微孔濾膜過濾后進(jìn)行海藻糖含量的測(cè)定。

1.3.4海藻糖轉(zhuǎn)化率的測(cè)定

采用高效液相色譜法分析轉(zhuǎn)化液中海藻糖的含量［15］。色譜條件：流動(dòng)相為乙腈/水=4∶1，混勻后加0.1%的氨水作為保護(hù)劑。色譜柱為XBridgeTMNH2（3.5 μm×4.6 μm× 250 mm），柱溫35℃，檢測(cè)器為示差折光顯示器，檢測(cè)器溫度40℃，流速1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。

海藻糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：用超純水分別配制海藻糖質(zhì)量濃度分別為0、0.6 g/L、1.2 g/L、1.8 g/L、2.4 g/L和3 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，高效液相分析后以海藻糖質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程，y=247 967x+11 266，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2。根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品中海藻糖的含量。

1.3.5發(fā)酵條件優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

檢測(cè)4個(gè)因素對(duì)海藻糖轉(zhuǎn)化率的影響：海藻糖合成酶發(fā)酵過程中加誘導(dǎo)劑時(shí)的菌濃OD600nm、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間、海藻糖合成酶轉(zhuǎn)化海藻糖過程中轉(zhuǎn)化時(shí)間。

（2）發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行正交試驗(yàn)分析，以海藻糖轉(zhuǎn)化率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定正交試驗(yàn)4因素的水平范圍。正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1　發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for fermentation conditions optimization

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)

2.1.1菌體濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

將活化后的大腸桿菌按接種量1%接種到15 L發(fā)酵罐中，在溫度37℃、轉(zhuǎn)速600 r/min、通氣量7.5 L/min、pH 7.0的條件下發(fā)酵大腸桿菌。當(dāng)不同罐中大腸桿菌菌濃OD600nm分別達(dá)到0.4、0.6、0.8、1.0、1.2時(shí)，溫度均降為26℃，添加終含量為0.2%的乳糖誘導(dǎo)8h。下罐發(fā)酵液在10000r/min條件下離心10min收集菌體，用50mmol/L磷酸緩沖溶液（pH7.0）洗滌菌體，并定容至原發(fā)酵液體積，配成菌懸液，勻漿機(jī)破碎3次，得到海藻糖合成酶粗酶液。取30 mL粗酶液和20 mL 75%的麥芽糖加入150 mL錐形瓶中55℃、120 r/min搖床中反應(yīng)12 h，沸水浴10 min滅酶后測(cè)定海藻糖的轉(zhuǎn)化率，結(jié)果見圖1。

圖1　菌體濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.1 Effect of bacteria concentration on conversion rate

由圖1可知，海藻糖的轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間的延長而先增加再降低，在大腸桿菌生長至OD600nm為0.8時(shí)海藻糖的轉(zhuǎn)化率最大，為66.47%。因此，發(fā)酵罐中大腸桿菌菌濃OD600nm為0.8時(shí)加乳糖誘導(dǎo)最佳。在菌體對(duì)數(shù)生長中期添加乳糖誘導(dǎo)效果最佳，不但可以獲得較高的菌體濃度，還能得到較高的海藻糖合成酶，有利于提高海藻糖的轉(zhuǎn)化率。

2.1.2誘導(dǎo)溫度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

將活化后的大腸桿菌按接種量1%接種到15 L發(fā)酵罐中，在溫度37℃、轉(zhuǎn)速600 r/min、通氣量7.5 L/min、pH 7.0的條件下發(fā)酵大腸桿菌。當(dāng)罐中大腸桿菌菌濃OD600nm達(dá)0.8時(shí)，不同罐的溫度分別設(shè)置為22℃、24℃、26℃、28℃、30℃時(shí)，流加終含量為0.2%的乳糖誘導(dǎo)8 h。下罐發(fā)酵液在10 000 r/min條件下離心10 min收集菌體，用50 mmol/L磷酸緩沖溶液（pH 7.0）洗滌菌體，并定容至原發(fā)酵液體積，配成菌懸液，勻漿機(jī)破碎3次，得到海藻糖合成酶粗酶液。取30 mL粗酶液和20 mL 75%的麥芽糖加入150 mL錐形瓶中55℃、120 r/min搖床中反應(yīng)12 h，沸水浴10 min滅酶后測(cè)定海藻糖的轉(zhuǎn)化率，結(jié)果見圖2。

圖2　誘導(dǎo)溫度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.2 Effect of induction temperature on conversion rate

由圖2可知，海藻糖的轉(zhuǎn)化率隨溫度的升高呈先增加再降低趨勢(shì)，誘導(dǎo)溫度控制在26℃時(shí)海藻糖的轉(zhuǎn)化率最大，為68.25%。因此，發(fā)酵罐中誘導(dǎo)大腸桿菌產(chǎn)海藻糖合成酶的溫度控制在26℃最佳。

2.1.3誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

將活化后的大腸桿菌按接種量1%接種到15 L發(fā)酵罐中，在溫度37℃、轉(zhuǎn)速600 r/min、通氣量7.5 L/min、pH 7.0的條件下發(fā)酵大腸桿菌。當(dāng)罐中大腸桿菌菌濃OD600nm達(dá)到0.8時(shí)，溫度均降為26℃，流加終含量為0.2%的乳糖，分別誘導(dǎo)4 h、6 h、8 h、10 h、12 h。下罐發(fā)酵液在10 000 r/min條件下離心10 min收集菌體，用50 mmol/L磷酸緩沖溶液（pH 7.0）洗滌菌體，并定容至原發(fā)酵液體積，配成菌懸液，勻漿機(jī)破碎3次，得到海藻糖合成酶粗酶液。取30mL粗酶液和20mL75%的麥芽糖加入150mL錐形瓶中55℃、120r/min搖床中反應(yīng)12 h，沸水浴10 min滅酶后測(cè)定海藻糖的轉(zhuǎn)化率，結(jié)果見圖3。

圖3　誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 Effect of induction time on conversion rate

由圖3可知，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，海藻糖的轉(zhuǎn)化率先呈增加趨勢(shì)，在誘導(dǎo)8 h時(shí)海藻糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)最大，為67.68%，隨后有所降低。因此，即誘導(dǎo)時(shí)間8 h最佳。

2.1.4轉(zhuǎn)化時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

圖4　轉(zhuǎn)化時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4 Effect of transforming time on conversion rate

將活化后的大腸桿菌按接種量1%接種到15 L發(fā)酵罐中，在溫度37℃、轉(zhuǎn)速600 r/min、通氣量7.5 L/min、pH 7.0的條件下發(fā)酵大腸桿菌。當(dāng)罐中大腸桿菌菌濃OD600nm達(dá)到0.8時(shí)，溫度均降為26℃，流加終含量為0.2%的乳糖誘導(dǎo)8 h。下罐發(fā)酵液在10 000 r/min條件下離心10 min收集菌體，用50 mmol/L磷酸緩沖溶液（pH 7.0）洗滌菌體，并定容至原發(fā)酵液體積，配成菌懸液，勻漿機(jī)破碎3次，得到海藻糖合成酶粗酶液。取30 mL粗酶液和20 mL 75%的麥芽糖加入150 mL錐形瓶中55℃、120 r/min搖床中分別反應(yīng)8 h、10 h、12 h、14 h、16 h，沸水浴10 min滅酶后測(cè)定海藻糖的轉(zhuǎn)化率，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，海藻糖的轉(zhuǎn)化率隨轉(zhuǎn)化時(shí)間的延長先增加后趨于平穩(wěn)，在轉(zhuǎn)化12 h以后轉(zhuǎn)化率增加不顯著，根據(jù)經(jīng)濟(jì)效益考慮，轉(zhuǎn)化時(shí)間12 h最佳。

2.2發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

將上述4個(gè)條件的單因素試驗(yàn)進(jìn)行正交分析，以海藻糖轉(zhuǎn)化率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定正交試驗(yàn)4因素的水平范圍。正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表2［16］，方差分析見表3。

表2　發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for fermentation conditions optimization

表3　正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal tests results

由表2極差R的大小順序可知，對(duì)海藻糖轉(zhuǎn)化率影響的主次順序?yàn)镈＞B＞A＞C，即轉(zhuǎn)化時(shí)間＞誘導(dǎo)溫度＞菌濃OD600nm＞誘導(dǎo)時(shí)間，各因素的最優(yōu)組合為A2B2C2D3，即最優(yōu)搭配組合為菌濃OD600nm0.8時(shí)加誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)溫度26℃、誘導(dǎo)時(shí)間8 h、轉(zhuǎn)化時(shí)間14 h。在此最佳條件下，海藻糖轉(zhuǎn)化率平均值為69.29%。

由表3可知，4個(gè)因素對(duì)結(jié)果均無顯著影響。

3　結(jié)論

本試驗(yàn)通過乳糖誘導(dǎo)大腸桿菌產(chǎn)海藻糖合成酶將麥芽糖轉(zhuǎn)化為海藻糖，經(jīng)過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，得知轉(zhuǎn)化時(shí)間和誘導(dǎo)溫度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響較大，在大腸桿菌生長到菌濃OD600nm為0.8時(shí)加誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)溫度26℃保持8 h，在轉(zhuǎn)化過程中反應(yīng)14h為最佳搭配。在最佳條件下，海藻糖的轉(zhuǎn)化率可達(dá)69.29%。

大腸桿菌產(chǎn)海藻糖合成酶轉(zhuǎn)化海藻糖工藝條件的優(yōu)化可以提高海藻糖的轉(zhuǎn)化率，而海藻糖合成酶在工業(yè)化生產(chǎn)海藻糖中具有良好的應(yīng)用前景，因此大腸桿菌產(chǎn)海藻糖合酶轉(zhuǎn)化海藻糖的條件優(yōu)化，為海藻糖工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

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Optimization of fermentation conditions of trehalose synthase byEscherichia coli

YANG Meiyu，ZHAO Wei，CHEN Wenna，ZHANG Yuehui，CAO Dapeng
（Shandong Fuyang Biotechnology Co.，Ltd.，Dezhou 253100，China）

For confirming the optimal condition of the transformation efficiency of trehalose synthase fromEscherichia coli，the effect of bacterial concentration OD600nm，induction time and temperature，and transformation time on trehalose conversion rate was researched by single factor and orthogonal tests.The results showed that the transformation time and induction temperature had great influence on trehalose conversion rate.The optimal condition was as follows:inducer was added when OD600nmequals 0.8，induction temperature was maintained at 26℃for 8 h，and reaction time 14 h in the transformation process.The conversion rate of trehalose was as high as 69.29%under the optimal condition.

trehalose；trehalose synthase；Escherichia coli；fermentation conditions

TQ929

A

0254-5071（2015）10-0078-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.10.017

2015-09-04

山東福洋生物科技有限公司項(xiàng)目

楊梅玉（1987-），女，工程師，碩士，主要從事微生物發(fā)酵及酶技術(shù)工作。