產(chǎn)海藻糖合酶菌株的篩選及發(fā)酵條件的優(yōu)化

段瑩瑩，趙　偉，曹大鵬，張?jiān)惠x，崔巍巍

（山東福洋生物科技有限公司，山東德州253100）

產(chǎn)海藻糖合酶菌株的篩選及發(fā)酵條件的優(yōu)化

段瑩瑩，趙偉，曹大鵬，張?jiān)惠x，崔巍巍

（山東福洋生物科技有限公司，山東德州253100）

從土壤中分離篩選得到一株能合成海藻糖的菌株，經(jīng)生物轉(zhuǎn)化途徑驗(yàn)證，該菌株含有特異性地將麥芽糖轉(zhuǎn)化為海藻糖的海藻糖合酶，以海藻糖轉(zhuǎn)化率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)其進(jìn)行搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化。結(jié)果表明，其發(fā)酵最適條件為：碳源為2%麥芽糖，氮源為0.5%酵母粉和1%蛋白胨，發(fā)酵初始pH值為7.0，接種量4%，發(fā)酵溫度35℃，發(fā)酵時(shí)間48 h，在此優(yōu)化條件下，海藻糖的轉(zhuǎn)化率為50%。

海藻糖，篩選，麥芽糖，發(fā)酵條件

海藻糖是功能性低聚糖，具有非還原性、保濕性、熱酸穩(wěn)定性、抗凍結(jié)、干燥性等特性［1］，而且它對(duì)生物大分子和生物體組織有著非特異性的保護(hù)作用［2-3］。海藻糖作為一種添加劑、穩(wěn)定劑和甜味劑已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品、化妝品和醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域［4］。但是，長(zhǎng)久已來，海藻糖昂貴的價(jià)格一直制約著海藻糖在以上各個(gè)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。生產(chǎn)海藻糖的方法較多，有微生物抽提法、從發(fā)酵液中提取、酶轉(zhuǎn)化法和基因重組法［5-6］。酶法轉(zhuǎn)化海藻糖一直是工業(yè)生產(chǎn)海藻糖的主要途徑［7］，海藻糖合酶可通過轉(zhuǎn)糖基作用直接將麥芽糖轉(zhuǎn)化為海藻糖，在工業(yè)酶法生產(chǎn)海藻糖中最具優(yōu)勢(shì)，而探究產(chǎn)海藻糖合酶菌株的發(fā)酵條件是降低海藻糖生產(chǎn)成本的一條有效途徑［8-12］。本研究從土壤中分離篩選得到一株能合成海藻糖的菌株，經(jīng)生物轉(zhuǎn)化途徑驗(yàn)證，該菌株含有特異性地將麥芽糖轉(zhuǎn)化為海藻糖的海藻糖合酶，以海藻糖轉(zhuǎn)化率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)其進(jìn)行搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化［13］。為海藻糖工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種

土壤：取自山東福洋生物科技有限公司；菌株：從土壤中分離篩選。

1.1.2培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：葡萄糖2%，酵母粉0.5%，蛋白胨1%，KH2PO40.5%，Mg2SO40.2%，鏈霉素0.003%，pH 6.5。

固體培養(yǎng)基：葡萄糖2%，酵母粉0.2%，Na2SO40.7%，CaCl20.7%，瓊脂2%，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：麥芽糖2%，酵母粉0.5%，蛋白胨1%，KH2PO40.3%，K2HPO41%，MgSO4·7H2O 0.12%，pH 7.0。

1.1.3試劑

海藻糖標(biāo)準(zhǔn)品、麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)品、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)Sigma公司；乙腈（色譜純）：西隴化工股份有限公司；蔗糖、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、酵母粉、蛋白胨：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硝酸銨、氯化銨、硫酸銨：天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠。

1.2儀器與設(shè)備

Waters515泵、Waters2414型示差折光檢測(cè)器、N2000雙通道色譜工作站的高效液相色譜儀：美國(guó)Waters公司；TP-114型電子天平：丹佛儀器有限公司；FE-20型pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器有限公司；3K15型冷凍離心機(jī)：美國(guó)Sigma公司；AH-BASIC型勻漿機(jī)：ATS工業(yè)系統(tǒng)有限公司；DHZ-DA型冷凍恒溫振蕩器：太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；SW-CJ-2D型凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3方法

1.3.1產(chǎn)海藻糖菌株的初篩

取2g土樣，加入到100mL的富集培養(yǎng)基中，在35℃、220 r/min條件下進(jìn)行富集培養(yǎng)，將富集后的菌液稀釋成10-1、10-2、……10-7，涂布于固體培養(yǎng)基平板，35℃培養(yǎng)48 h，挑取大小、形狀、顏色不一的具有典型特征的細(xì)菌單菌落，在固體培養(yǎng)基中進(jìn)一步分離純化，反復(fù)3次后，挑取典型細(xì)菌單菌落于斜面上劃線，35℃培養(yǎng)48 h后于冰箱4℃保存，作為初篩斜面。

1.3.2產(chǎn)海藻糖合酶菌株驗(yàn)證試驗(yàn)

將初篩的菌株接種到發(fā)酵培養(yǎng)基上，35℃、220 r/min，搖床培養(yǎng)48 h，離心收集菌體，用pH 7.0的50 mmol/L磷酸鈉緩沖液洗滌菌體2次后，加入與發(fā)酵液等體積的磷酸鈉緩沖液混勻，勻漿機(jī)低溫破碎菌體，獲得粗酶液。加入麥芽糖溶液，混合后使麥芽糖終含量為30%，50℃、120 r/min轉(zhuǎn)化反應(yīng)12 h，煮沸10 min滅酶，離心收集上清液。

1.3.3產(chǎn)海藻糖菌株的鑒定

（1）菌落的形態(tài)特征

固體培養(yǎng)基35℃培養(yǎng)48 h后，菌落為圓形，乳白色，直徑約1.5 mm，周邊齊整，微凸，表面光滑，不透明，黏稠易挑起。

（2）菌株的生理生化特征

能利用葡萄糖、麥芽糖、海藻糖、蔗糖、糊精產(chǎn)酸，但不產(chǎn)氣，不能利用乳糖和淀粉；能在低于10%NaCl的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。

1.3.4分析檢測(cè)

采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法［14-15］測(cè)定海藻糖、麥芽糖和葡萄糖的含量。色譜條件為：流動(dòng)相：乙腈∶水=3∶1（V/V）；氨基色譜柱（250 mm×4.6 mm）；檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器；柱溫：40℃；等度洗脫流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。

海藻糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：用超純水分別配制質(zhì)量濃度分別為0.6 g/L、1.2 g/L、1.5 g/L、1.8 g/L、2.0 g/L、2.4 g/L、3.0 g/L海藻糖的標(biāo)準(zhǔn)溶液，HPLC分析后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)（R2）。

海藻糖轉(zhuǎn)化率的計(jì)算公式：

式中：C1為海藻糖的量，g；C2為麥芽糖的量，g。

1.3.5生物轉(zhuǎn)化途徑驗(yàn)證

將產(chǎn)酶菌株所得粗酶液分為3份，每份20 mL，分別加入20 mL 60%的麥芽糖溶液、20 mL 60%的葡萄糖溶液、20mL去離子水，均于50℃、120r/min反應(yīng)12h后煮沸10 min滅酶，將3份反應(yīng)液離心后取上清液，采用高效液相色譜法測(cè)定反應(yīng)液中海藻糖、麥芽糖、葡萄糖的含量。

1.3.6發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

碳源的確定：制備種子液按4%接種量接種于裝液量為100 mL/500 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別以2%麥芽糖、2%葡萄糖、2%蔗糖作為碳源，其他成分同1.1.2發(fā)酵培養(yǎng)基，35℃、220 r/min、搖瓶培養(yǎng)48 h后，收集菌體破碎，制備粗酶液進(jìn)行酶解反應(yīng)轉(zhuǎn)化，測(cè)定海藻糖轉(zhuǎn)化率。

氮源的確定：制備種子液按4%接種量接種于裝液量為100 mL/500 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別以0.5%酵母粉+1%蛋白胨、1.5%硝酸銨、1.5%氯化銨、1.5%硫酸銨作為氮源，其他成分同1.1.2發(fā)酵培養(yǎng)基，35℃、220 r/min搖床培養(yǎng)48 h后，菌體破碎，制備粗酶液進(jìn)行酶解反應(yīng)轉(zhuǎn)化，測(cè)定海藻糖轉(zhuǎn)化率。

1.3.7發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化

發(fā)酵溫度的確定：將產(chǎn)酶菌株按4%接種量接種于裝液量為100 mL/500 mL優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別于30℃、35℃、40℃、45℃，220 r/min、搖床培養(yǎng)48 h后，菌體破碎，制備粗酶液進(jìn)行酶解反應(yīng)轉(zhuǎn)化，測(cè)定海藻糖轉(zhuǎn)化率。

發(fā)酵pH的確定：將產(chǎn)酶菌株4%接種量接種于裝液量為100 mL/500 mL優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別調(diào)節(jié)其初始pH 5.0℃、6.0℃、7.0℃、8.0℃，35℃、220 r/min搖床培養(yǎng)48 h后，收集菌體破碎，制備粗酶液進(jìn)行酶解反應(yīng)轉(zhuǎn)化，測(cè)定海藻糖轉(zhuǎn)化率。

接種量的確定：將產(chǎn)酶菌株按3%、4%、5%、6%接種量接種于裝液量為100 mL/500 mL優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基中，pH 7.0，35℃、220 r/min搖床培養(yǎng)48 h后，菌體破碎，制備粗酶液后進(jìn)行轉(zhuǎn)化，測(cè)定海藻糖轉(zhuǎn)化率。

發(fā)酵時(shí)間的確定：將產(chǎn)酶菌株按4%接種量接種于裝液量為100 mL/500 mL優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基中，35℃、220 r/min搖床培養(yǎng)24 h、36 h、48 h、60 h后，菌體破碎，制備粗酶液后進(jìn)行轉(zhuǎn)化，測(cè)定海藻糖轉(zhuǎn)化率。

2　結(jié)果與分析

2.1海藻糖標(biāo)樣的測(cè)定及海藻糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

2.1.1海藻糖標(biāo)樣的測(cè)定

應(yīng)用高效液相色譜法測(cè)定海藻糖標(biāo)樣，色譜圖見圖1。

圖1　海藻糖標(biāo)樣HPLC色譜圖Fig.1 The HPLC chromatogram of trehalose standard

2.1.2海藻糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別以海藻糖含量（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，利用高效液相色譜法測(cè)定海藻糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。

圖2　海藻糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of trehalose

由圖2可知，海藻糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=243 394x+ 20 883，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2，表明海藻糖含量和峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2海藻糖樣品的測(cè)定

海藻糖粗酶液酶解反應(yīng)轉(zhuǎn)化48 h，煮沸10 min滅酶后，將轉(zhuǎn)化液離心后取上清液，采用高效液相色譜法測(cè)定轉(zhuǎn)化液中海藻糖的轉(zhuǎn)化率，色譜圖見圖3。

圖3　轉(zhuǎn)化液HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of conversion solution

2.3菌株的篩選及產(chǎn)酶試驗(yàn)

從固體培養(yǎng)基中共篩選出16株菌株，標(biāo)記為Q1-Q16。對(duì)篩選出來的16株典型菌株進(jìn)行產(chǎn)酶試驗(yàn)，菌株代謝產(chǎn)海藻糖合酶試驗(yàn)結(jié)果如表1。

2 生物標(biāo)志物的類型 生物標(biāo)志物的范圍非常廣泛，可以是為檢查器官功能或其他身體健康狀況而引入生物體的物質(zhì)，如氯化銣用于同位素標(biāo)記檢測(cè)心肌灌注情況；可以是用來表明特定疾病狀態(tài)的物質(zhì)，如受到疾病感染時(shí)抗體的出現(xiàn)；也可以是特異性細(xì)胞、分子或基因、基因產(chǎn)物、酶或激素，復(fù)雜的器官功能，生物特性或生物結(jié)構(gòu)等。

表1　產(chǎn)海藻糖合酶菌株的選育Table 1 Screening of trehalose synthase producing strains

由表1可知，16株菌株中，有10株可定量檢測(cè)到能利用麥芽糖生成海藻糖，其他6株檢測(cè)不到，可能是菌株產(chǎn)的酶活力不好，生成的海藻糖很少，在這10株中，Q12的海藻糖轉(zhuǎn)化率明顯高于其他菌株，故作為本試驗(yàn)的目的菌株。

2.4生物轉(zhuǎn)化海藻糖的途徑

利用海藻糖合酶不作用于葡萄糖、麥芽三糖、麥芽寡糖、蔗糖、異麥芽糖、異麥芽寡糖等這一特點(diǎn)，以葡萄糖、麥芽糖、去離子水為不同的底物，通過對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物的定性定量分析對(duì)海藻糖的合成途徑進(jìn)行初步驗(yàn)證，測(cè)定結(jié)果見表2。

表2　不同底物反應(yīng)體系的高效液相色譜法分析結(jié)果Table 2 HPLC analysis results of different substrate reaction system

由表2可知，底物為30%麥芽糖時(shí)，一部分的麥芽糖被轉(zhuǎn)化生成了海藻糖，底物為30%葡萄糖時(shí)，并未檢測(cè)到海藻糖的存在，通過3個(gè)體系的分析結(jié)果可知，此菌株在以麥芽糖為底物合成海藻糖的途徑是通過海藻糖合酶完成的。

2.5菌株Q12發(fā)酵條件的研究

2.5.1碳源對(duì)海藻糖轉(zhuǎn)化率的影響

圖4　不同碳源對(duì)海藻糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4 Effect of different carbon sources on the conversion rate of trehalose

由圖4可知，以2%麥芽糖為碳源時(shí)海藻糖轉(zhuǎn)化率最高，為49.3%，這可能是由于酶的作用底物或底物類似物能誘導(dǎo)發(fā)酵產(chǎn)酶的原因，所以選擇最適宜菌株產(chǎn)酶的碳源為2%麥芽糖。

2.5.2氮源對(duì)海藻糖轉(zhuǎn)化率的影響

由圖5可知，以0.5%酵母粉+1%蛋白胨為氮源時(shí)海藻糖轉(zhuǎn)化率最高，為45.8%，這可能是有機(jī)氮源含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和蛋白質(zhì)、肽類、游離的氨基酸以及少量的生長(zhǎng)因子等可供微生物直接利用，有利于菌體生長(zhǎng)產(chǎn)酶，所以菌株產(chǎn)酶的最適氮源為0.5%酵母粉+1%蛋白胨。

圖5　不同氮源對(duì)海藻糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5 Effect of different nitrogen sources on the conversion rate of trehalose

2.5.3發(fā)酵溫度對(duì)海藻糖轉(zhuǎn)化率的影響

圖6　發(fā)酵溫度對(duì)海藻糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.6 Effect of fermentation temperature on the conversion rate of trehalose

由圖6可知，當(dāng)發(fā)酵溫度為35℃時(shí)海藻糖轉(zhuǎn)化率最高，為47.1%，過高或過低的溫度都不利于菌體生長(zhǎng)和海藻糖的積累，最佳發(fā)酵溫度為35℃。

2.5.4發(fā)酵初始pH對(duì)海藻糖轉(zhuǎn)化率的影響

圖7　發(fā)酵初始pH對(duì)海藻糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.7 Effect of the initial pH on the conversion rate of trehalose

由圖7可知，最佳發(fā)酵的初始pH為7.0，海藻糖轉(zhuǎn)化率最高，為49.8%。較低的pH抑制菌株的生長(zhǎng)，較高的pH有利于菌的生長(zhǎng)而不利于海藻糖的積累。

2.5.5接種量對(duì)海藻糖轉(zhuǎn)化率的影響

圖8　接種量對(duì)海藻糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.8 Effect of inoculum on the conversion rate of trehalose

由圖8可知，最佳接種量為4%，海藻糖轉(zhuǎn)化率最高，為48.2%。接種量＜4%時(shí)，發(fā)酵前期生長(zhǎng)緩慢，延長(zhǎng)發(fā)酵周期，接種量＞4%時(shí)，菌株較快達(dá)到了穩(wěn)定期，自溶也快。

2.5.6發(fā)酵時(shí)間對(duì)海藻糖轉(zhuǎn)化率的影響

圖9　發(fā)酵時(shí)間對(duì)海藻糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.9 Effect of fermentation time on the conversion rate of trehalose

由圖9可知，發(fā)酵48 h時(shí)海藻糖轉(zhuǎn)化率最高，為47.9%，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，海藻糖轉(zhuǎn)化率稍有下降，延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間并不能增加海藻糖的積累。因此，最佳發(fā)酵時(shí)間為48 h。

3　結(jié)論

通過篩選得到一株菌株Q12，其海藻糖轉(zhuǎn)化率最高，并且確定了該菌株是以麥芽糖為底物通過海藻糖合酶途徑合成海藻糖的。菌株Q12的最適發(fā)酵條件為：碳源為2%麥芽糖，氮源為0.5%酵母粉和1%蛋白胨，發(fā)酵初始pH值為7.0，接種量4%，發(fā)酵溫度35℃，發(fā)酵時(shí)間48 h，在此優(yōu)化條件下，海藻糖的含量為15.1%，海藻糖的轉(zhuǎn)化率49.8%。

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Screening of trehalose synthase producing strain and optimization of its fermentation conditions

DUAN Yingying，ZHAO Wei，CAO Dapeng，ZHANG Yuehui，CUI Weiwei
（Shangdong Fuyang Biotechnology Co.，Ltd.，Dezhou 253100，China）

A trehalose synthase producing strain was isolated and screened from soil.Through biological transformation pathway identification，the strain contained trehalose synthase could convert maltose into trehalose.Using the conversion rate of trehalose as evaluation index，flask-shaking fermentation conditions were optimized.The results showed that the optimal fermentation conditions were maltose 2%as carbon source，yeast extract 0.5%and peptone 1%as nitrogen source，initial pH 7.0，inoculum 4%，fermentation temperature 35℃，fermentation time 48 h.Under this condition，the conversion rate of trehalose was 50%.

trehalose；screen；maltose；fermentation conditions

Q939.97

A

0254-5071（2015）10-0053-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.10.012

2015-09-06

段瑩瑩（1985-），女，工程師，碩士，研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵。