產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的篩選及抗氧化特性研究

張玉龍，胡　萍*，王金龍，廖乾偉

（貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽550025）

產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的篩選及抗氧化特性研究

張玉龍，胡萍*，王金龍，廖乾偉

（貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽550025）

以分離自貴州侗族、苗族傳統(tǒng)發(fā)酵食品的36株乳酸菌為受試菌，篩選出8株高產(chǎn)胞外多糖（膜截留分子質(zhì)量為8 000～14 000 u）的乳酸菌，分別為SR2-1（Pediococcussp.F3S1）、SR2-2（Pediococcus pentosaceusNGRI 0304）、SR3-2（Pediococcus pentosaceusLB-WC）、SR8（Lactobacillus kimchi）、SR10-2（Pediococcussp.22-4）、SR12-1（Lactobacillus graminis）、H1（Staphylococcussp.3034O2）和XS2（Pediococcus pentosaceusGS17），并對其胞外多糖進(jìn)行體外抗氧化特性研究。結(jié)果顯示，8株乳酸菌的胞外多糖均具有抗氧化活性，其中胞外多糖質(zhì)量濃度為30 μg/mL時，乳酸菌SR2-2、SR8和SR12-1的胞外多糖對Fe2+的清除率分別為15.55%、12.41%、53.21%；胞外多糖質(zhì)量濃度為40 μg/mL時，乳酸菌SR2-2、SR8和SR12-1的胞外多糖對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·）和NO2-的清除率分別達(dá)9.69%、11.93%、8.93%及5.73%、7.82%、3.82%。這三株乳酸菌顯示出一定的抗氧化活性。

乳酸菌；胞外多糖；抗氧化

乳酸菌是普遍公認(rèn)的食品安全（generally regarded as safe，GRAS）微生物，在自然界廣泛分布，其具有調(diào)節(jié)人體腸道微生態(tài)［1-2］、調(diào)節(jié)免疫力［3-4］、抗氧化［5-6］、降膽固醇［7-8］、抗腫瘤［9-10］、抗過敏［11-12］、降血壓［13］、降血脂［14］等功能。乳酸菌胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）是乳酸菌在生長代謝過程中分泌到細(xì)胞外的糖類化合物，其中粘合在細(xì)胞壁形成莢膜的多糖稱為莢膜多糖（capsular polysaccharides，CPS），而進(jìn)入培養(yǎng)基媒介形成粘液的多糖稱為粘液多糖（slime polysaccharides，SPS），是乳酸菌的次級代謝產(chǎn)物。這兩類多糖都是微生物適應(yīng)環(huán)境的產(chǎn)物。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌胞外多糖也具有細(xì)胞保護(hù)［15-17］、免疫調(diào)節(jié)［18-19］、腸道黏附［20］、抗氧化［21］、抗腫瘤［22-23］等功能。此外，乳酸菌胞外多糖特殊的生物高分子特性，能夠改善產(chǎn)品的流變學(xué)特性，增加產(chǎn)品的持水能力和產(chǎn)品穩(wěn)定性，賦予產(chǎn)品良好的感官品質(zhì)。

由于乳酸菌胞外多糖重要的生理活性和食品工業(yè)應(yīng)用價值，近年來產(chǎn)胞外多糖乳酸菌受到極大的關(guān)注，功能性產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的開發(fā)及其在發(fā)酵食品中的應(yīng)用成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

36株乳酸菌：分離自貴州侗族、苗族族傳統(tǒng)自制酸肉、酸魚、酸菜、酸湯的。脫脂乳：恒天然集團(tuán)；MRS肉湯培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)股份有限責(zé)任公司；1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH·）（含10%～20%苯）：東京化成工業(yè)株式會社；磷酸一氫鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯化鐵、抗壞血酸、亞硝酸鈉：成都金山化學(xué)試劑有限公司；硫酸亞鐵、氫氧化鈉：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；三氯乙酸：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；1，10-菲咯啉、無水對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、溴甲酚紫：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；鄰苯三酚：遵義林源醫(yī)藥化工有限責(zé)任公司；無水乙醇：天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；HZQ-X100恒溫振蕩培養(yǎng)箱：太倉市實(shí)驗設(shè)備廠；HPX-9082MBE數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DK-98-II電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；Thermo Fisher Scientific Sorvall LEGEND MICRO 17R離心機(jī)：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3方法

1.3.1產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的初篩

選取不同稀釋度的稀釋液，以MRS-溴甲酚紫（MRS-bromocresolpurple）固體培養(yǎng)基為分離培養(yǎng)基，采用稀釋平板法進(jìn)行菌種分離，篩選出使MRS-Bromocresol purple固體培養(yǎng)基變黃且黏稠的菌落待用。

1.3.2高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的復(fù)篩

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取9支10 mL試管，分別吸取100 μg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0、0.1 mL、0.3 mL、0.5 mL、0.7 mL、0.9 mL于每支試管中，然后每支試管再用蒸餾水補(bǔ)足至1 mL。各試管分別加6%苯酚溶液1 mL，搖勻，然后迅速加入濃硫酸5.0 mL，立即搖勻，室溫條件下靜置30 min，于波長490 nm處測定各溶液的吸光度值，以葡萄糖稀釋液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）胞外多糖的提取及測定

取10 mL于37℃培養(yǎng)24 h的乳酸菌發(fā)酵液，8 000 r/min離心20 min，去菌體，在上清液中加入5 mL 10%三氯乙酸，4℃靜置過夜，10 000 r/min離心20 min，脫除蛋白質(zhì)。離心后的上清液移至透析袋中用蒸餾水4℃透析24 h，加入3倍體積的95%vol乙醇，4℃冷藏過夜，多糖呈絮狀沉淀析出，于4℃、10 000 r/min離心20 min，除去上清液，即得沉淀后的胞外多糖，將其溶于5 mL蒸餾水中，得到EPS的水溶液。采用苯酚-硫酸法測得EPS水溶液的吸光度值，并在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找對應(yīng)的糖含量，即得乳酸菌的胞外多糖產(chǎn)量。將乳酸菌胞外多糖含量調(diào)至60.19 μg/mL備用。

1.3.3總還原力測定

取0.5 mL乳酸菌胞外多糖溶液，加入0.5 mL 0.2 mol/L pH值為6.6的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）及0.5 mL 1%鐵氰化鉀，于50℃水浴20 min，急速冷卻，再加入0.5 mL 10%三氯乙酸，4℃、3 000 r/min離心5 min，取上清液0.5 mL，加入1 mL蒸餾水及1 mL 0.1%三氯化鐵，混合均勻，10 min后，于波長700 nm處測定其吸光度值，以蒸餾水為空白，吸光度值越大表示還原能力越強(qiáng)。

1.3.4DPPH·清除能力測定

參考王曦等［24］的方法略有改動。取0.2 mL乳酸菌胞外多糖溶液，用無水乙醇補(bǔ)至1 mL，再加入1 mL 0.2 mmol/L DPPH·，立即混勻，暗反應(yīng)30 min后，以未加樣品為對照，無水乙醇作為空白，于波長517 nm處測定其吸光度值。DPPH·清除率計算公式如下：

式中：Ai為1 mL的DPPH+1 mL樣品的吸光度值；Aj為1 mL溶劑+1 mL樣品的吸光度值；A0為1 mL DPPH+1 mL溶劑的吸光度值。

1.3.5螯合Fe2+能力測定

0.1mL 1%抗壞血酸、0.1 mL 0.4%FeSO4和0.1 mL 0.2 mol/L NaOH混合液中加入0.1 mL乳酸菌胞外多糖溶液，混合液于37℃水浴20min，0.5mL10%三氯乙酸（trichloracetic acid，TAC）沉淀蛋白，4 500 r/min、4℃離心10 min，取0.2 mL上清液，加入2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的1，10-菲咯啉反應(yīng)10 min后，于波長510 nm處測吸光度值。實(shí)驗中以pH 7.4 PBS作為對照。

1.3.6NO2-清除能力測定

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別取5 μg/mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL，加入2 mL 0.4%對氨基苯磺酸溶液，混勻后靜置3min，加1mL0.2%鹽酸萘乙二胺溶液，蒸餾水補(bǔ)至10mL，混勻后，避光靜置20min。以零管為空白調(diào)零，于538 nm波長處測定吸光度值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）NO2-的清除能力

分別取4支試管，均加入2 mL 5 μg/mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，3支試管加0.5 mL乳酸菌胞外多糖溶液，另一支試管加0.5mL蒸餾水，混勻后加入2mL0.4%對氨基苯磺酸溶液，靜置3 min，再加入1 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺溶液，加蒸餾水補(bǔ)至10 mL，搖勻后，避光靜置20 min。以零管為空白調(diào)零，于538 nm波長處測定吸光度值。

2　結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的初篩

以MRS-Bromocresol purple培養(yǎng)基為初篩培養(yǎng)基，篩選結(jié)果如表1所示。除SR13-2外，其余35株乳酸菌均能夠使得MRS-Bromocresolpurple培養(yǎng)基變黃且黏稠，即均為變黃陽性、黏稠陽性。

表1　產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的初篩結(jié)果Table 1 Preliminary screening result of exopolysaccharidesproducing lactic acid bacteria

2.2高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的復(fù)篩

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以葡萄糖稀釋液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（如圖1）。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.749 5x-0.006 2，R2=0.994 4。這表明葡萄糖質(zhì)量濃度在0.1～1.0（×10-2mg/L）范圍內(nèi)，葡萄糖質(zhì)量濃度與吸光度值之間的線性關(guān)系良好。

圖1　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

2.2.2高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌

本研究采用透析-醇沉法提取高分子質(zhì)量（膜截留分子質(zhì)量為8 000～14 000 u）的乳酸菌胞外多糖，并用苯酚-硫酸法測定其產(chǎn)量，結(jié)果如表2所示。從上述35株乳酸菌中篩選出的胞外多糖（膜截留分子質(zhì)量為8 000～14 000 u）產(chǎn)量＞30 mg/L的乳酸菌有8株，其中XS2的胞外多糖產(chǎn)量達(dá)（44.86±0.71）mg/L。

表28　株乳酸菌胞外多糖產(chǎn)量結(jié)果Table 2 Results of 8 lactic acid bacteria producing EPS

2.3胞外多糖的總還原力

總還原力作為測定抗氧化能力的一個重要指標(biāo)，與抗氧化能力有直接聯(lián)系。研究顯示，具有還原力的化學(xué)物質(zhì)通過提供氫原子來阻斷過氧化物的形成，破壞自由基反應(yīng)鏈，進(jìn)而發(fā)揮抗氧化作用。如圖2所示，8株乳酸菌所產(chǎn)胞外多糖在質(zhì)量濃度30 μg/mL時，除SR2-1外，其余乳酸菌胞外多糖的總還原力均＞0.090，其中SR8、SR10-2、SR12-1和XS2的吸光度值接近0.100，而H1的總還原力為最高，其吸光度值為0.179±0.002，高于陽性對照的抗壞血酸［VC（1.5 μg/mL）］的總還原力（0.171±0.004）。

圖2　乳酸菌源胞外多糖的總還原力Fig.2 Total reducing abilities of exopolysaccharides produced by different lactic acid bacteria

2.4DPPH·清除能力

DPPH·是一類較為穩(wěn)定的合成自由基，其穩(wěn)定性主要源于共振穩(wěn)定作用及苯環(huán)的空間障礙作用。若能將DPPH·清除，則表明受試化學(xué)物質(zhì)具有較強(qiáng)的自由基清除能力，能清除其他自由基如烷自由基、過氧陰離子自由基和過脂質(zhì)自由基，終斷其連鎖反應(yīng)。因而對DPPH·清除能力的大小常作為評價某物質(zhì)抗氧化性的有效方法。WEI L等［25］研究顯示，胞外多糖對DPPH·清除能力隨著其質(zhì)量濃度的增加而增加，3種純化的胞外多糖質(zhì)量濃度為0.125 mg/mL時，DPPH·清除率為18.42%～22.95%；胞外多糖質(zhì)量濃度達(dá)4mg/mL時，其對DPPH·清除能力為33.53%～41.92%。ABDHUL K等［26］研究表明，來自糞腸球菌BDU7的胞外多糖質(zhì)量濃度為8 mg/mL時對DPPH·清除率為63.5%。

圖3　不同乳酸菌胞外多糖對DPPH·的清除作用Fig.3 The exopolysaccharides produced by different lactic acid bacteria on DPPH·clearance ability

由圖3可知，8株乳酸菌所產(chǎn)胞外多糖質(zhì)量濃度為40 μg/mL時對DPPH·清除能力強(qiáng)的為SR8、SR2-2、SR3-2和SR12-1所對應(yīng)的胞外多糖。H1所產(chǎn)多糖對DPPH·清除能力最低，僅為（3.84±0.16）%。與陽性對照（10 μg/mL維生素C（vitamin C，VC））相比，除H1外，其余胞外多糖均比VC的DPPH·清除能力強(qiáng)，其中SR8對胞外多糖的清除能力高于VC的2倍，達(dá)（11.93±0.01）%。

2.5螯合Fe2+能力

圖4　不同乳酸菌源胞外多糖對Fe2+的螯合能力Fig.4 The exopolysaccharides of produced by differnet lactic acid bacteria on Fe2+chelating ability

銅、鐵等金屬離子參與機(jī)體內(nèi)許多氧化反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體氧化損傷。當(dāng)金屬離子被螯合后，它就不能啟動多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化，從而減緩了脂類化合物氧化的速度，阻止其對機(jī)體生物膜和核酸的傷害。因此，研究對Fe2+的螯合能力大小對抑制氧化具有重要意義。LI W等［27］研究顯示，胞外多糖質(zhì)量濃度在4 mg/mL時其對Fe2+的螯合率達(dá)59.11%。

由圖4可知，8株乳酸菌的胞外多糖在質(zhì)量濃度30 μg/mL時均對Fe2+具有螯合作用，且不同菌源胞外多糖的螯合能力有所差異。其中，SR12-1的胞外多糖表現(xiàn)出最高的螯合能力（為53.21±2.69）%，其次為SR10-2、SR2-2、SR3-2和SR8，螯合能力最弱的為XS2的胞外多糖。

2.6NO2-清除能力

2.6.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以亞硝酸鈉稀釋液的濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線（如圖5）。由圖5可知，亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.376 6x-0.000 8，R2=0.999 7。這表明亞硝酸鈉質(zhì)量濃度在0.1～0.6（×5 μg/mL）范圍內(nèi)，亞硝酸鈉質(zhì)量濃度與吸光度值之間的線性關(guān)系良好。

圖5　亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of sodium nitrite

2.6.2NO2-清除能力

圖6　乳酸菌胞外多糖清除NO2-的能力Fig.6 The exopolysaccharides produced by defferent lactic acid bacteria on NO2-clearance ability

亞硝酸鹽是一種劇毒物質(zhì)，也是一種致癌物，其在胃部酸性條件下可轉(zhuǎn)變成的亞硝酸。亞硝酸具有較強(qiáng)的氧化性，可將人體血液中的二價鐵離子氧化成三價鐵離子，進(jìn)而使血紅蛋白轉(zhuǎn)變成高鐵血紅蛋白，失去帶氧功能，從而導(dǎo)致人體組織缺氧，引起急性中毒現(xiàn)象。此外，亞硝酸可與胺類物質(zhì)反應(yīng)，生成具有強(qiáng)致癌作用的亞硝基胺類化合物，誘發(fā)人消化道癌等疾病。

由圖6可知，8株乳酸菌產(chǎn)胞外多糖對亞硝酸鹽均具有清除能力。SR2-1、SR8和SR2-2的胞外多糖顯示出良好的清除活性，在質(zhì)量濃度為40 μg/mL時，依次為（9.35±0.63）%、（7.82±0.63）%和（5.73±1.27）%，其次為SR12-1和XS2。SR3-2、SR10-2和H1的胞外多糖對亞硝酸鹽的清除能力低。與40 μg/mL VC相比，僅SR2-1和SR8的清除活性比其強(qiáng)，其余6株乳酸菌的胞外多糖活性相對較低。

3　結(jié)論

乳酸菌具有很多生理功能如調(diào)解腸微生態(tài)平衡、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤、降膽固醇、抗過敏等功能，目前的研究主要集中在乳酸菌菌體本身的體內(nèi)和體外抗氧化實(shí)驗，部分研究主要探討無細(xì)胞提取物的抗氧化，而對某一類亦或某一種單一組分的抗氧化的報道較少。

分離自貴州少數(shù)民族傳統(tǒng)自制的酸肉、酸魚、酸湯、酸菜的36株受試乳酸菌為本土原生態(tài)的微生物資源，對其功能特性的研究與開發(fā)具有重要的意義。本研究以乳酸菌胞外多糖為指標(biāo)，采用MRS-Bromocresolpurple培養(yǎng)基為初篩培養(yǎng)基，篩選出35株能夠使得培養(yǎng)基變黃且黏稠的乳酸菌；以苯酚-硫酸法進(jìn)行復(fù)篩，從初篩出的35株乳酸菌中篩選出8株高產(chǎn)胞外多糖（膜截留分子質(zhì)量為8000～14000u）的乳酸菌，分別為SR2-1、SR2-2、SR3-2、SR8、SR10-2、SR12-1、H1和XS2，依次為片球菌屬F3S1（Pediococcussp.F3S1）、戊糖片球菌NGRI0304（PediococcuspentosaceusNGRI0304）、戊糖片球菌LB-WC（PediococcuspentosaceusLB-WC）、泡菜乳桿菌（Lactobacillus kimchi）、片球菌屬22-4（Pediococcus sp.22-4）、草乳桿菌（Lactobacillus graminis）、葡萄球菌屬3034O2（Staphylococcussp.3034O2）、戊糖片球菌菌株GS17（Pediococcus pentosaceusGS17），并對其胞外多糖進(jìn)行體外抗氧化特性研究。

結(jié)果顯示，8株乳酸菌的胞外多糖均具有抗氧化活性，其中胞外多糖質(zhì)量濃度為30 μg/mL時，乳酸菌SR2-2、SR8和SR12-1的胞外多糖對Fe2+的清除率達(dá)15.55%、12.41%、53.21%；胞外多糖質(zhì)量濃度在40 μg/mL時，乳酸菌SR2-2、SR8和SR12-1的胞外多糖對DPPH·和NO2-的清除率分別達(dá)（9.69%、11.93%、8.93%）和（5.73%、7.82%、3.82%）。這3株乳酸菌顯示一定的抗氧化活性。此研究為進(jìn)一步開發(fā)抗氧化乳酸菌資源、研究乳酸菌抗氧化機(jī)理提供支撐。

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Isolation of exopolysaccharides-producing lactic acid bacteria and its antioxidant properties

ZHANG Yulong，HU Ping*，WANG Jinlong，LIAO Qianwei
（School of Liquor and Food Engineering，Guizhou University，Guiyang 550025，China）

Using 36 strains of lactic acid bacteria（LAB）isolated from fermented food of Dong and Miao nationality in Guizhou as tested bacteria，eight LAB strains with high yield exopolysaccharides（EPSs）（membrane molecular weight（MW）cut off:8 000-14 000 u）were preliminarily screened，including R2-1（Pediococcussp.F3S1），SR2-2（Pediococcus pentosaceusNGRI 0304），SR3-2（Pediococcus pentosaceusLB-WC），SR8（Lactobacillus kimchi），SR10-2（Pediococcussp.22-4），SR12-1（Lactobacillus graminis），H1（Staphylococcussp.3034O2）and XS2（Pediococcus pentosaceus strain GS17）.in vitroantioxidant properties of exopolysaccharides were investigated.The results indicated that the exopolysaccharides of eight LAB strains all had antioxidant activity.At the EPS content of 30 μg/ml，the clearance rates of Fe2+of SR2-2，SR8 and SR12-1 were 15.55%，12.41%，53.21%，respectively.At the EPS content of 40 μg/ml，the clearance rates of DPPH·and NO2-of SR2-2，SR8 and SR12-1 were 9.69%，11.93%，8.93% and5.73%，7.82%，3.82%，respectively.Thethreestrainsoflacticacidbacteriashowedcertainantioxidantactivity.

lactic acid bacteria；exopolysaccharides；antioxidant

TS201.3

A

0254-5071（2015）10-0037-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.10.009

2015-09-05

國家自然科學(xué)基金項目（31260379）；貴州大學(xué)研究生創(chuàng)新基金（基金編號2015040）

張玉龍（1990-），男，碩士研究生，研究方向為食品微生物與生物技術(shù)。

胡萍（1970-），女，教授，博士，研究方向為食品微生物與生物技術(shù)。