引入中性氨基酸對木聚糖酶XynZF-2熱穩(wěn)定性的影響

陳亞文，周晨妍*，謝晶晶，索婧琪，魏陽陽，李同彪

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003）

引入中性氨基酸對木聚糖酶XynZF-2熱穩(wěn)定性的影響

陳亞文，周晨妍*，謝晶晶，索婧琪，魏陽陽，李同彪

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003）

通過對黑曲霉（Aspergillus niger）XZ-3S木聚糖酶XynZF-2進行生物信息學(xué)分析，在N-端區(qū)域引入半胱氨酸，定點突變E27C，構(gòu)建突變基因xyn-E27C，并在大腸桿菌BL21（DE3）中表達。酶學(xué)性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，突變酶Xyn-E27C的最適溫度為45℃，與原酶XynZF-2相比提高了5℃。在40℃條件下，突變酶Xyn-E27C的半衰期t1/240℃為100 min，相比原酶XynZF-2（t1/245℃=55 min）提高了45 min。在45℃條件下，突變酶Xyn-E27C的半衰期t1/245℃為24 min，相比原酶XynZF-2（t1/245℃=7 min）提高了17 min；突變酶Xyn-E27C的最適pH值由5.0提高至5.5，而pH穩(wěn)定范圍均為5.0～9.0。因此，定點突變E27C對木聚糖酶XynZF-2的熱穩(wěn)定性以及最適pH值均有重要影響。

木聚糖酶；熱穩(wěn)定性；定點突變；中性氨基酸

木聚糖酶（EC 3.2.1.8）是催化水解木聚糖β-1，4糖苷鍵的一類多功能酶總稱［1］，產(chǎn)物主要是低聚木糖，有時還有少許的阿拉伯糖、木糖等成分［2］。木聚糖酶是木聚糖降解酶中最關(guān)鍵的酶［3］，其廣泛分布于各種生物體中，如海洋藻類、細菌、真菌、酵母、甲殼動物、陸地植物以及各種無脊椎動物［4］等，目前研究的木聚糖酶主要來源于微生物［5］。

在工業(yè)應(yīng)用方面，木聚糖酶具有很大的潛力和價值，它是一種重要的酶制劑，廣泛應(yīng)用于食品加工、紙漿漂白、制藥、飼料添加劑、醫(yī)藥、紡織、生物轉(zhuǎn)化等行業(yè)［6］。一般來說，在工業(yè)應(yīng)用上的酶都需要高催化活性、耐高溫等性質(zhì)。如在紙漿漂白工藝中添加木聚糖酶，可以增加紙張白度，改善紙張性能，降低漂白用化學(xué)物質(zhì)用量，減少造紙業(yè)對環(huán)境的污染等［7］。而工業(yè)上紙漿漂白需要60℃左右處理過程，自然界中的木聚糖酶大多屬于中溫木聚糖酶，難以達到其工業(yè)需求［8］。因此，對于木聚糖酶的熱穩(wěn)定性改造已成為廣泛關(guān)注的熱點［9］。研究表明，很多因素可以影響木聚糖酶的熱穩(wěn)定性（如二硫鍵、氫鍵、疏水作用、離子鍵等［10］）。GH11家族木聚糖酶具有分子質(zhì)量小、底物特異性高、空間結(jié)構(gòu)為右手半握形狀、結(jié)構(gòu)比較簡單等特點［11］。N端區(qū)域是影響GH11家族的熱穩(wěn)定性的重要因素，如DUMAN C等［12］對GH11家族木聚糖酶（EvXyn11TS）N端的7個氨基酸進行定點突變（T13F、S9P、N14H、Y18F、Q34L、S35E和S71T），突變酶比野生酶的Tm值提高了約25℃。LEEY E等［13］將木聚糖酶XynA的N-端刪除，發(fā)現(xiàn)突變酶熱穩(wěn)定性喪失但活性不變，可確定木聚糖酶的N-端是其熱穩(wěn)定性區(qū)。

來源于黑曲霉（Aspergillus niger）XZ-3S的木聚糖酶XynZF-2屬于GH11家族中溫木聚糖酶，木聚糖酶基因xynZF-2已由本實驗室分離，并構(gòu)建在pET-28a-xynZF-2保存［14］。該研究在對xynZF-2基因進行生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，選擇N-端的第27位點氨基酸進行定點突變（E27C），在大腸桿菌BL21（DE3）中誘導(dǎo)表達，期望提高木聚糖酶XynZF-2的熱穩(wěn)定性，為該酶的后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

菌種：黑曲霉（Aspergillus niger）XZ-3S：本實驗室保存。大腸桿菌JM109、BL21（DE3）及表達質(zhì)粒pET-28a：Novagen公司。

質(zhì)粒：重組質(zhì)粒pET-28a-xynZF-2：本實驗室構(gòu)建并保存。

工具酶和生化試劑：T4脫氧核糖核酸鏈接酶（T4 deoxyribonucleic acidligase，T4DNALigase）、限制性內(nèi)切酶、DL1000 DNA Marker、異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）以及5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside，x-gal）：TaKaRa公司；DNA質(zhì)粒提取試劑盒：生工生物工程（上海）有限公司；蛋白分子量標準：碧云天生物技術(shù)有限公司；DNA片段回收試劑盒：北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司；其他化學(xué)試劑為國產(chǎn)或進口分析純。

1.2儀器與設(shè)備

C1000梯度PCR擴增儀：美國Bio-Rad公司；DYY-2穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀：北京市六一儀器廠；DC-0506低溫恒溫槽：上海比朗儀器有限公司；HZQ-F160A恒溫振蕩器：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Neofuge 23R高速冷凍離心機：上海力申科學(xué)儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1同源序列比對以及同源建模

通過ProtParam程序（http：//web.expasy.org/protparam/）分析木聚糖酶的理化性質(zhì)，利用Phyre2對木聚糖酶同源建模，并通過DS ViewerPro6.0分析木聚糖酶三維結(jié)構(gòu)。

1.3.2定點突變和重組表達載體pET-28a-xyn-E27C構(gòu)建

以pET-28a-xynZF-2為模板，采用重疊延伸聚合酶鏈式反應(yīng)（gene splicing by overlap extension polymerase chain reaction，SOE PCR）法［15］，引物見表1，擴增得到突變基因E27C，割膠回收。EcoRⅠ、HindⅢ限制性內(nèi)切酶對突變基因E27C和空質(zhì)粒pET-28a進行雙酶切，37℃、3 h，電泳酶切產(chǎn)物，切膠回收。用T4 DNA Ligase連接以上兩種雙酶切產(chǎn)物，16℃過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），涂布于含卡那霉素（kalamycin，Kan）抗性的LB固體培養(yǎng)基，構(gòu)建重組大腸桿菌BL21-pET-28a-xyn-E27C。篩選陽性單克隆菌落，提取重組質(zhì)粒進行驗證，送金唯智公司測序。

表1　突變基因引物Table 1 The primers of mutated gene

1.3.3重組木聚糖酶XynZF-2和Xyn-E27C的表達與純化

IPTG誘導(dǎo)表達重組菌株BL21/pET-28a-xyn-E27C，采用超聲波細胞破碎等方法提取粗酶液，具體方法見參考文獻［16］。采用鎳金屬螯合親和層析柱純化重組木聚糖酶XynZF-2和Xyn-E27C，收集洗脫樣品液，即為重組原酶XynZF-2和突變酶Xyn-E27C，對XynZF-2、Xyn-E27C進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測（5%濃縮膠，15%分離膠）［17］。

1.3.4重組木聚糖酶活性測定

木聚糖酶活性測定：3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）法［18］。添加1 mL適當(dāng)稀釋的酶液于1.5 mL的0.5%樺木木聚糖溶液中，40℃水浴反應(yīng)15 min，加DNS終止反應(yīng)，測定OD值。將此反應(yīng)條件下每分鐘產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量定義為1個單位，U。

1.3.5重組木聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)比較及分析

對純化后的重組原酶（XynZF-2）和突變酶（Xyn-E27C）進行酶學(xué)性質(zhì)分析，測定溫度和pH值對重組木聚糖酶酶活性的影響［17］。

2　結(jié)果與分析

2.1重組木聚糖酶同源序列比對建模及突變位點確定

圖1　XynZF-2（A）與Xyn-E27C（B）同源建模Fig.1 Homology modeling of XynZF-2（A）and Xyn-E27C（B）

將原酶XynZF-2和突變酶Xyn-E27C的氨基酸序列提交到Phyre2，分別自動同源序列比對建模，結(jié)果如圖1所示，原酶XynZF-2和突變酶Xyn-E27C基本相似，都是由1個α-螺旋和2個β-折疊片層組成，屬于GH11家族木聚糖酶。利用DNAMAN6.0以及DS ViewerPro6.0對氨基酸序列、木聚糖酶XynZF-2結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)在N-端的β-折疊區(qū)域的B1鏈從第22個氨基酸開始到第29氨基酸結(jié)束，依次為：PSSTGENN，由此發(fā)現(xiàn)，除第27位點的谷氨酸帶負電荷外，其他氨基酸均不帶電的中性氨基酸，為穩(wěn)定B1鏈與酶分子內(nèi)外部的相互作用，將第27位點帶負電荷的谷氨酸隨機突變?yōu)橄鄬Ψ肿淤|(zhì)量相近且不帶電荷的中性氨基酸（半胱氨酸）。

2.2定點突變和重組表達載體構(gòu)建

采用重疊延伸PCR對突變基因E27C進行擴增，瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物（見圖2、圖3）。通過DNAMAN6.0對突變基因E27C限制性酶切位點進行分析，發(fā)現(xiàn)突變基因E27C不含EcoRⅠ、HindⅢ酶切位點，利用引物對突變基因E27C引入EcoRⅠ、HindⅢ酶切位點，通過EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切將突變基因E27C克隆在載體pET-28a上，構(gòu)建重組表達載體。

圖2　突變基因xyn-E27C上下游片段PCR擴增Fig.2 PCR amplification of the upstream and downstream fragments of mutated genexyn-E27C

圖3　突變基因xyn-E27C的PCR擴增Fig.3 PCR amplification of mutated genexyn-E27C

2.3重組木聚糖酶在大腸桿菌中表達和純化

將重組質(zhì)粒pET-28a-xyn-E27C轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），構(gòu)建大腸桿菌工程菌。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達，通過細胞破碎提取粗酶液，對含有His6標簽的原酶和突變酶，經(jīng)鎳金屬螯合親及層析柱法得到純化的重組木聚糖酶，用SDS-PAGE蛋白電泳檢測純化的木聚糖酶XynZF-2和Xyn-E27C。由圖4可見，原酶XynZF-2和突變酶Xyn-E27C均在32 ku處有明顯條帶，突變酶Xyn-E27C在相對分子質(zhì)量上與原酶XynZF-2一致。

圖4　木聚糖酶XynZF-2和Xyn-E27C的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of XynZF-2 and Xyn-E27C

2.4酶學(xué)性質(zhì)比較與分析

2.4.1重組木聚糖酶與原酶最適溫度及熱穩(wěn)定性比較

按1.3.5方法測定原酶與突變酶最適溫度（Topt）結(jié)果如圖5所示，突變酶Xyn-E27C的Topt為45℃，較原酶XynZF-2（Topt=40℃）提高了5℃，最適溫度有一定提高。由圖6可見，40℃保溫1 h，突變酶Xyn-E27C相對酶活性下降至保溫處理前的61.8%，較原酶XynZF-2（42.0%）有大幅度的提高，且突變酶Xyn-E27C的半衰期t1/240℃為100 min，相比原酶XynZF-2（t1/245℃=55 min）提高了45 min。在45℃條件下突變酶Xyn-E27C的半衰期t1/245℃為24 min，相比原酶XynZF-2（t1/245℃=7 min）提高了14 min。可見，突變酶Xyn-E27C相比原酶XynZF-2熱穩(wěn)定性明顯改善。

圖5　重組木聚糖酶最適溫度的比較Fig.5 Comparison of the optimum temperature of recombinant xylanase

圖6　重組木聚糖酶熱穩(wěn)定性比較Fig.6 Comparison of thermal stability of recombinant xylanase

2.4.2重組木聚糖酶與原酶最適pH及pH穩(wěn)定性比較

分析pH對XynZF-2和Xyn-E27C酶活性的影響發(fā)現(xiàn)，突變酶Xyn-E27C的最適pH值為5.5（原酶XynZF-2，pH 5.0）（圖7），最適pH有明顯改變，而在pH 5.0～9.0，兩種酶的殘余酶活性都在80%以上，pH穩(wěn)定性基本不變（圖8）。

圖7　重組木聚糖酶最適pH的比較Fig.7 Comparison of the optimal pH for recombinant xylanase

圖8　重組木聚糖酶pH的穩(wěn)定性比較Fig.8 Comparison of the stability of recombinant xylanase pH

2.5討論

通過生物信息學(xué)等方法，在Phyre2上對XynZF-2同源建模，并用DS ViewerPro6.0觀察分析建模結(jié)果，發(fā)現(xiàn)XynZF-2屬于GH11家族木聚糖酶，在原酶XynZF-2的B1鏈上引入中性氨基酸，增加中性氨基酸含量，降低了B1鏈上的氨基酸在溶液中的溶解度，從而減少了B1鏈與溶液中水分子的相互作用，有利于維持蛋白分子完整的空間構(gòu)象，穩(wěn)定分子內(nèi)部構(gòu)象。為了進一步減少B1鏈與水分子的相互作用，增強分子內(nèi)部穩(wěn)定性，以穩(wěn)定B1鏈的構(gòu)象，從而穩(wěn)定酶分子整體的構(gòu)象，這可能是突變酶Xyn-E27C熱穩(wěn)定性得到提高的重要因素。

在如今的工業(yè)應(yīng)用中，對耐高溫木聚糖酶應(yīng)用和需求越來越廣泛。木聚糖酶作為一種重要的酶制劑在許多工業(yè)應(yīng)用環(huán)節(jié)之中具有潛力和價值，對木聚糖酶的熱穩(wěn)定性改造已成為廣泛關(guān)注的熱點［9］。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，按照人類需求把木聚糖酶改造成符合工業(yè)要求的酶已經(jīng)成為可能影響木聚糖酶熱穩(wěn)定性的因素有很多。研究表明，GH11家族木聚糖酶的N-端區(qū)域?qū)ζ錈岱€(wěn)定有重要的作用，很多研究已通過對木聚糖酶N-端氨基酸定點突變，改善了其熱穩(wěn)定性［19］，如XIONG H R等［20］對里氏木霉來源的木聚糖酶N端和中部β-折疊處引入二硫鍵，在65℃條件下，突變酶DBl的半衰期比野生酶提高約112倍。運用生物信息學(xué)的方法分析比對木聚糖酶的分子結(jié)構(gòu)，可以有效確定與熱穩(wěn)定相關(guān)區(qū)域，為木聚糖酶分子的改造提供了便利。

3　結(jié)論

本研究通過對XynZF-2進行生物信息學(xué)分析，將第27個位點的谷氨酸突變?yōu)榘腚装彼?，使突變酶Xyn-E27C的最適溫度相比原酶XynZF-2提高了5℃。突變酶Xyn-E27C的半衰期t1/245℃，相比原酶增加了17 min，酶的熱穩(wěn)定性得到了很大提高。這為木聚糖酶Xyn-E27C后續(xù)的研究提供了理論依據(jù)。

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Effect of introducing neutral amino acids residues on the thermostability of xylanases XynZF-2

CHEN Yawen，ZHOU Chenyan*，XIE Jingjing，SUO Jingqi，WEI Yangyang，LI Tongbiao
（School of Life Science and Technology，Xinxiang Medical University，Xinxiang 453003，China）

The xylanase XynZF-2 fromAspergillus nigerXZ-3S was analyzed by bioinformatics.Neutral amino acids residues（Cys）were introduced at the N-terminus.The mutated genexyn-E27Cwas amplified by site-directed mutagenesis ofE27Cand expressed inEscherichia coliBL21（DE3）. According to the enzyme properties analysis and compared to the recombinant XynZF-2，results showed that the optimum temperature of mutant Xyn-E27C was 45℃，which was increased by 5℃.At 40℃，compared to XynZF-2（t1/245℃=55 min），the t1/245℃of the mutated Xyn-E27C was 100 min，which was increased by 45 min.At 45℃，compared to XynZF-2（t1/245℃=7 min），the half-life of the mutated Xyn-E27C was 24 min，which was increased by 17 min.The optimum pH of mutated Xyn-E27C was increased from 5.0 to 5.5，while the pH stability range was from pH 5.0 to 9.0.Therefore，E27C site-directed mutagenesis had important effect on the thermal stability and pH of xylanase XynZF-2.

xylanase；thermostability；site-directed mutagenesis；neutral amino acids residues

Q55

A

0254-5071（2015）10-0027-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.10.007

2015-09-22

國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201410472028）；河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點項目（13A180861）；河南省高等學(xué)校青年骨干教師資助計劃項目（2011GGJS-125）；新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院科研項目培育基金（2013ZD113）

陳亞文（1993-），女，本科生，研究方向為生物工程。

周晨妍（1979-），女，副教授，博士，研究方向為微生物酶工程。