擬南芥轉(zhuǎn)錄終止因子PDE191的生物信息學(xué)分析

熊偉等

摘要：為了預(yù)測和分析擬南芥（Arabidopsis thaliana）轉(zhuǎn)錄終止因子PDE191蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能，采用生物信息學(xué)的方法對PDE191蛋白質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)研究，包括PDE191蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、跨膜區(qū)和信號肽、亞細(xì)胞定位、二級結(jié)構(gòu)、功能域、蛋白質(zhì)的功能分類預(yù)測、多重序列比對與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建、三級結(jié)構(gòu)建模。結(jié)果表明，擬南芥PDE191蛋白質(zhì)屬于植物mTERF蛋白質(zhì)家族的成員，其蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為37.89 ku，等電點為9.12，不具有信號肽和跨膜區(qū)。該蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞葉綠體，N端1-30位氨基酸為前導(dǎo)肽序列。其二級結(jié)構(gòu)主要為α螺旋和無規(guī)則卷曲，包含7個mTERF基序，三級結(jié)構(gòu)顯示結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相符。蛋白質(zhì)多重序列比對和聚類分析顯示，在玉米、蓖麻、楊樹、大豆、葡萄、水稻和高粱等高等植物中存在與擬南芥PDE191蛋白質(zhì)高度同源性的蛋白質(zhì)，尤其是與玉米PDE191蛋白質(zhì)相似性高達(dá)99%。

關(guān)鍵詞：擬南芥（Arabidopsis thaliana）；轉(zhuǎn)錄終止因子；色素缺失突變191；生物信息學(xué)

中圖分類號：Q811.4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）17-4332-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.17.059

擬南芥（Arabidopsis thaliana）屬于十字花科植物，是一種模式植物，其基因組測序已于2000年全部完成，因為具有同類植物無法比擬的條件，在植物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等研究領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。首先，擬南芥?zhèn)€體小，其各種特征比較簡單；其次，擬南芥基因組比較小，并且為單倍體植物，只有5對染色體，其核基因組只有約125 Mbp；再次，擬南芥生長周期短，一個生活史只需要8周左右；最后，擬南芥每代平均能夠收獲多達(dá)數(shù)千粒種子。擬南芥具有高等植物的一般特點，所以擬南芥的研究成果很容易借鑒到其他農(nóng)作物、經(jīng)濟(jì)作物等的應(yīng)用中去，可以產(chǎn)生客觀的經(jīng)濟(jì)和社會價值。

線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子（Mitochondrial transcription termination factor， mTERF） 蛋白質(zhì)家族是一類具有多功能的蛋白質(zhì)家族，包含4個亞家族，分別命名為mTERF1、mTERF2、mTERF3和mTERF4。通過PSI-BLAST發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)家族成員廣泛存在于后生動物和植物中，但目前還沒有在真菌中發(fā)現(xiàn)同源蛋白質(zhì)[1-3]。張曉雷[4]于2011年首次報道了一個由于T-DNA插入導(dǎo)致的擬南芥色素缺失突變體pde191，表型為白化及幼苗致死，電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)顯示葉綠體發(fā)育不正常，但是在加入蔗糖的培養(yǎng)基上培養(yǎng)表現(xiàn)出逐漸變綠的表型，通過等位試驗和遺傳互補(bǔ)試驗，充分證明是由于PDE191（Pigment defective 191） 基因的沉默導(dǎo)致了植物出現(xiàn)白化表型。后續(xù)的研究表明，擬南芥PDE191蛋白質(zhì)含有mTERF基序重復(fù)序列，且定位于葉綠體中，PDE191基因突變導(dǎo)致一系列的葉綠體基因無法正常轉(zhuǎn)錄終止，特別是rpoA基因及其下游的間隔區(qū)序列在突變體中的表達(dá)比野生型高20多倍[5]。在葉綠體發(fā)育過程中，PEP（質(zhì)體編碼的聚合酶）是一類重要的負(fù)責(zé)質(zhì)體基因轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶，并發(fā)揮重要的質(zhì)體基因表達(dá)調(diào)控作用，轉(zhuǎn)錄的效率主要由PEP的活性所決定[5]。PEP活性下降是pde191突變體出現(xiàn)白化現(xiàn)象的一個主要因素。研究表明擬南芥PDE191基因通過作用葉綠體rpoA基因的正常轉(zhuǎn)錄終止，進(jìn)而影響葉綠體PEP酶活性和基因表達(dá)，并最終影響葉綠體的發(fā)育[5]。

目前已經(jīng)確定擬南芥PDE191基因位于第4號染色體，含有4個外顯子和3個內(nèi)含子，全長cDNA序列為1 402 bp，編碼的蛋白質(zhì)由333個氨基酸組成。在本研究中，利用生物信息學(xué)方法和工具對擬南芥PDE191蛋白質(zhì)序列進(jìn)行系統(tǒng)的預(yù)測和研究，通過美國NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索到的擬南芥PDE191蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)和其他植物同源蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)，分析擬南芥PDE191蛋白質(zhì)的氨基酸組成、理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)、功能結(jié)構(gòu)域和三級結(jié)構(gòu)等信息，同時對不同植物的PDE191同源蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多重序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以期為今后進(jìn)一步研究該蛋白質(zhì)的功能提供生物信息學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

用于生物信息學(xué)分析的數(shù)據(jù)資料來源于國際互聯(lián)網(wǎng)上NCBI核酸和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)注冊的不同植物與擬南芥PDE191基因同源的mRNA及其蛋白質(zhì)序列（表1）。

1.2 方法

擬南芥PDE191蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)采用Protparam tool軟件預(yù)測；親水性/疏水性采用ProtScale tool軟件進(jìn)行預(yù)測；氨基酸分值參數(shù)選用HpHob./Kyte and Doolittle；跨膜區(qū)域使用TMHMM Server 2.0軟件進(jìn)行預(yù)測；信號肽采用SignalP 4.1 Server軟件預(yù)測；蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位分別采用PSORT WWW Server中的iPSORT prediction工具、WoLFPSORT軟件和TargetP軟件進(jìn)行分析；蛋白質(zhì)功能分類采用ProtFun 2.2 Server軟件進(jìn)行預(yù)測；二級結(jié)構(gòu)采用PSIPRED Server 3.3軟件進(jìn)行分析；結(jié)構(gòu)功能域采用SMART軟件預(yù)測；三級結(jié)構(gòu)預(yù)測采用SWISS-MODELR軟件進(jìn)行同源建模；多重序列比對采用Clustal W軟件進(jìn)行；系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建采用MEGA6.05軟件進(jìn)行。各在線分析軟件的網(wǎng)址見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥PDE191蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

在GenBank注冊的擬南芥PDE191基因全長cDNA包括1 002 bp的開放閱讀框（Open reading frame，ORF），編碼1個由333個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。采用Protparam tool軟件預(yù)測PDE191蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，推測該蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量為37.89 ku，分子式為C1707H2736N448O482S20，等電點為9.12，不穩(wěn)點參數(shù)33.85，根據(jù)不穩(wěn)定參數(shù)的數(shù)值在40以下是穩(wěn)定蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)，可推定PDE191為穩(wěn)定蛋白質(zhì)[6]。軟件預(yù)測該蛋白質(zhì)在體外環(huán)境下的半衰期為30 h。通過分析該基因編碼的氨基酸發(fā)現(xiàn)，PDE191蛋白質(zhì)由20種不同氨基酸組成，Leu、Lys和Ser的含量較多，其中Leu的含量高達(dá)11.40%，Trp的相對含量較少，只占0.60%；帶正電荷的氨基酸殘基（Arg+Lys）總數(shù)為47個，帶負(fù)電荷的氨基酸殘基（Asp+Glu）為37個（圖1）。疏水性平均系數(shù)（Grand average of hydropathicity，GRAVY）為-0.114，預(yù)測該蛋白質(zhì)為親水性蛋白質(zhì)。endprint

2.2 擬南芥PDE191蛋白質(zhì)親水性/疏水性預(yù)測和分析

親水性/疏水性預(yù)測和分析對于進(jìn)一步預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)功能域具有重要的生物學(xué)意義，采用ProtScale tool軟件進(jìn)行親水性/疏水性預(yù)測，結(jié)果表明，PDE191蛋白質(zhì)第154位氨基酸分值最大，為2.622；蛋白質(zhì)第188位氨基酸分值最小，為-2.122（圖2）。整體來看，親水性氨基酸數(shù)量多于疏水性氨基酸，且均勻分布在整個肽鏈中[7]，可推測PDE191是親水性蛋白質(zhì)， 與Protparam tool軟件預(yù)測結(jié)果一致。

2.3 擬南芥PDE191蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)域與信號肽分析

蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)域主要是膜內(nèi)在蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜的膜脂相結(jié)合的部位。利用TMHMM Server v2.0在線軟件對PDE191蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)域進(jìn)行分析，結(jié)果（圖3）顯示，該蛋白質(zhì)的跨膜螺旋數(shù)量（Number of predicted TMHs）為0，說明PDE191不是跨膜蛋白質(zhì)。

SignalP是一個信號肽及其剪切位點的預(yù)測工具，它采用一個神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)來區(qū)分信號肽和非信號肽，另一個神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)來識別剪切位點。C值是信號肽酶切位點分值，S值是信號肽分值，Y值是由C值和S值綜合得出的剪切位點分值，用于更精確地確定信號肽酶切位點[7]。使用SignalP 4.1 Server在線軟件預(yù)測平均S值（mean S score）為0.109，依據(jù)mean S score>0.5才能判斷為分泌蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)，推測PDE191蛋白質(zhì)不具有信號肽，說明它是一種在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮生理作用的蛋白質(zhì)（圖4）。

2.4 擬南芥PDE191蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要指蛋白質(zhì)分子中主鏈骨架原子依賴氫鍵排列在一維方向上具有周期性的構(gòu)象，對其進(jìn)行預(yù)測與分析將有助于認(rèn)識蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)。使用PSIPRED v3.3軟件預(yù)測擬南芥PDE191蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，擬南芥PDE191蛋白質(zhì)由53.76%的？琢-螺旋（Alpha helix）、1.20%的延伸鏈（Extended strand）、45.04%的無規(guī)則卷曲（Random coil）構(gòu)成（圖5）?？梢姡孔?螺旋和無規(guī)則卷曲是該蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)成元件，延伸鏈只出現(xiàn)在2個局部肽鏈，且沒有 ？茁-轉(zhuǎn)角（Beta-turn）出現(xiàn)。

2.5 擬南芥PDE191蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能域的預(yù)測

結(jié)構(gòu)功能域是指生物大分子中具有特異結(jié)構(gòu)與獨立功能的區(qū)域。用SMART在線軟件預(yù)測PDE191蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能域，結(jié)果表明，該蛋白質(zhì)4-125、148-272位氨基酸區(qū)域為2個內(nèi)部重復(fù)序列（Internal repeat），8-123、112-322位氨基酸區(qū)域為2個mTERF蛋白結(jié)構(gòu)域（Pfam），60-91、96-127、132-163、169-201、206-237、275-306、342-374位氨基酸區(qū)域為7個mTERF基序重復(fù)序列，每個基序由32或33個保守的氨基酸殘基組成（圖6A）。對這7個基序的序列分析發(fā)現(xiàn)，每個基序的第8個氨基酸均為脯氨酸（P），第10、11、15、19、26位氨基酸是亮氨酸（L）或其他疏水性氨基酸，如異亮氨酸（I）、纈氨酸（V）、苯丙氨酸（F），這些結(jié)構(gòu)特征使得PDE191蛋白質(zhì)可能具有與mTERF同樣的結(jié)合DNA的性質(zhì)。

2.6 擬南芥PDE191蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位和功能分類

分別使用PSORT WWW Server中的WoLFPSORT工具和iPSORT Prediction工具對擬南芥PDE191蛋白質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞定位， 兩個不同軟件的分析結(jié)果均表明PDE191蛋白質(zhì)定位于擬南芥的葉綠體和線粒體中，蛋白質(zhì)N端的1-30位氨基酸可能是其前導(dǎo)肽序列。此外，TargetP蛋白質(zhì)定位分析軟件預(yù)測擬南芥PDE191蛋白質(zhì)可能定位于細(xì)胞核、線粒體、葉綠體和過氧化物酶體中，但因為該基因突變體為白化突變體，所以推測定位部位在葉綠體中。

采用ProtFun軟件對擬南芥PDE191蛋白質(zhì)進(jìn)行功能分類，由表3可知，蛋白質(zhì)功能分類（Functional category）顯示該蛋白質(zhì)可能是轉(zhuǎn)運和結(jié)合蛋白質(zhì)（Transport and binding）， 基因本體分類（Gene Ontology category）進(jìn)一步提示該蛋白質(zhì)是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（Transcription factor）。此外，預(yù)測結(jié)果還顯示擬南芥PDE191蛋白質(zhì)不具有酶活性。

2.7 多重序列比對與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

根據(jù)PDE191蛋白質(zhì)的氨基酸序列在NCBI上進(jìn)行BLASTP，結(jié)果顯示在許多物種中存在與擬南芥PDE191同源的蛋白質(zhì)，進(jìn)化系統(tǒng)分析顯示PDE191蛋白質(zhì)在雙子葉植物中處于一個獨立的分支上，表明其在進(jìn)化中比較保守（圖7）。蛋白質(zhì)多重序列比對結(jié)果顯示，擬南芥PDE191蛋白質(zhì)與玉米（Zea mays）的PDE191蛋白質(zhì)（EU952184.1）相似性為99%，與楊樹（Populus trichocarpa）中的一個預(yù)測蛋白質(zhì)（XM_002328250.1）相似性為71%，與蓖麻（Ricinus communis）中的蛋白質(zhì)（EQ973785.1）相似性為71%，與大豆（glycine max）中的蛋白質(zhì)（BT095136.1）相似性為65%，與葡萄（Vitis vinifera）中的蛋白質(zhì)（XM_002280046.1）相似性為66%，與水稻（Oryza sativa）中的蛋白質(zhì)（NM_001068770.1）相似性為56%，與高粱（Sorghum bicolor）中的蛋白質(zhì)（XM_002444711.1）相似性為56%（圖8）。由此可見，該基因編碼的蛋白質(zhì)序列具有很高的保守性，在各種植物之間都有很高的相似性，尤其和玉米的相似度更是達(dá)到了99%。

2.8 擬南芥PDE191蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析endprint

采用SWISS-MODEL同源建模的方式得到擬南芥PDE191蛋白質(zhì)的三維預(yù)測模型（圖9），經(jīng)RasMol軟件分析顯示該蛋白質(zhì)外形呈橢球狀，主要由？琢-螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果基本一致。

3 討論

隨著計算機(jī)技術(shù)和生物技術(shù)的飛速發(fā)展，通過計算機(jī)模擬的方式對蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)、序列結(jié)構(gòu)和功能等方面進(jìn)行預(yù)測的確信度越來越高[8]。在植物中，除了有線粒體之外，還有葉綠體。因為等位突變體的缺乏而引起的轉(zhuǎn)錄終止，關(guān)于其編碼的蛋白質(zhì)是否是mTERF的研究并不多，且其在葉綠體中是否也存在轉(zhuǎn)錄終止功能仍有待研究。擬南芥PDE191基因編碼1個線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子mTERF蛋白質(zhì)，該家族蛋白質(zhì)一般有2個獨立的DNA結(jié)合區(qū)和3個亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，以單體的形式作用于DNA上。

通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)擬南芥PDE191蛋白質(zhì)是一個相對分子質(zhì)量為37.89 ku的親水性蛋白質(zhì)，且不具有分泌信號肽的功能。亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)擬南芥PDE191蛋白質(zhì)定位于葉綠體中，其N端的1～30個氨基酸為前導(dǎo)肽序列，所以它很有可能是作為一個細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間相互作用的一個重要蛋白質(zhì)。通過預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)PDE191蛋白質(zhì)中56.90%的結(jié)構(gòu)是由？琢螺旋和？茁-折疊構(gòu)成；通過SMART軟件預(yù)測該蛋白質(zhì)含有7個mTERF基序，每個基序由大約32或33個保守的氨基酸殘基構(gòu)成。對其蛋白質(zhì)功能的預(yù)測結(jié)果顯示，PDE191蛋白質(zhì)不具有酶活性，但在調(diào)控葉綠體基因轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮一定的生物學(xué)功能。

通過對擬南芥PDE191蛋白質(zhì)與玉米、楊樹、蓖麻、大豆、葡萄、水稻、高粱等其他7個不同物種的系統(tǒng)發(fā)育樹聚類構(gòu)建分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)屬于直系同源蛋白質(zhì)（Orthologous protein），說明在不同物種之間PDE191蛋白質(zhì)是來源于共同祖先的蛋白質(zhì)，能夠很好地保留其主要序列以及結(jié)構(gòu)，并且具有共同或者相似的生物學(xué)功能[9]。雖然該蛋白質(zhì)在不同物種中具有很好的氨基酸序列保守性，但其在不同物種中的進(jìn)化關(guān)系與物種本身之間的進(jìn)化關(guān)系并不是很一致，推測該蛋白質(zhì)可能并不是隨著生物的進(jìn)化而進(jìn)化的，而是在生物中具有某種固有的作用，只是在植物的進(jìn)化過程中由于意外的原因?qū)е略摶虬l(fā)生突變，從而打亂了其物種之間的進(jìn)化關(guān)系[10]。本研究為今后更進(jìn)一步研究植物PDE191蛋白質(zhì)家族的生物學(xué)功能及其他物種的直系同源PDE191蛋白質(zhì)之間的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

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