水胺硫磷亞急性暴露對小鼠肝臟氧化應激的影響

邊高鵬，焦海華，史寶忠,2，張曉俊

1. 長治學院生物科學與技術(shù)系，長治 046011 2. 太行山生態(tài)與環(huán)境研究所，長治 046011 3. 長治衛(wèi)生學校附屬醫(yī)院病理科，長治 046000

水胺硫磷亞急性暴露對小鼠肝臟氧化應激的影響

邊高鵬1,2,，焦海華1，史寶忠1,2，張曉俊3

1. 長治學院生物科學與技術(shù)系，長治 046011 2. 太行山生態(tài)與環(huán)境研究所，長治 046011 3. 長治衛(wèi)生學校附屬醫(yī)院病理科，長治 046000

為探討水胺硫磷對小鼠肝臟損傷作用機制，設置0.11、1.08、2.16 mg·kg-13個低、中、高不同劑量組，以灌胃方式對昆明種小鼠進行染毒7 d后，測定小鼠肝臟組織超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)2種抗氧化酶的活性，以及抗氧化物質(zhì)谷胱甘肽(GSH)和膜脂質(zhì)過氧化物丙二醛(MDA)含量，同時觀察肝臟的組織學變化。結(jié)果表明，除低劑量組外，中、高劑量組小鼠肝臟SOD和GSH-Px活性與對照組相比均受到顯著抑制(P<0.05)，GSH的含量與對照組相比顯著下降(P<0.05)，MDA含量與對照組相比卻呈顯著上升趨勢(P<0.01)，同時各指標的變化均呈一定的劑量-效應關(guān)系。組織學觀察顯示中、高劑量組肝細胞出現(xiàn)明顯水腫和壞死，肝竇狹窄甚至閉塞。結(jié)果表明氧化損傷可能是水胺硫磷致小鼠肝臟毒性損傷的作用機制之一。

水胺硫磷；小鼠；肝臟；氧化損傷

水胺硫磷化學名為O-甲基-O-硫代磷酰胺酯，小鼠急性經(jīng)口半數(shù)致死量(LD50)雄性為10.80 mg·kg-1，雌性為13.42 mg·kg-1[1]，參照世界衛(wèi)生組織和我國的農(nóng)藥危害標準屬于中等毒性有機磷農(nóng)藥(OPS)。我國已經(jīng)從2007年1月1日起，在綠色農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)基地限制施用水胺硫磷，但由于其作為一種速效廣譜有機磷殺蟲劑，在水果和蔬菜中水胺硫磷殘留超標的事件時有報道[2-3]。因此，水胺硫磷暴露對人體健康的潛在威脅引起了廣泛關(guān)注。水胺硫磷中毒后會出現(xiàn)一系列神經(jīng)毒性癥狀，譬如頭暈、頭痛、全身乏力、惡心嘔吐，嚴重者還可發(fā)生昏迷、抽搐等[4]。楊帆和鄒容[5]研究表明，水胺硫磷還能抑制鯽魚(Carassius auratus)肝臟組織堿性磷酸酶，從而抑制生物體生長和代謝。還有研究發(fā)現(xiàn)水胺硫磷對動物表現(xiàn)出一定生殖毒性，可導致大鼠(Rattus norregicus)睪丸組織發(fā)生病理改變，精子活動率降低和精子畸形率增加[6]；玫瑰無須鰓鲃(Puntius conchonius)精子超微結(jié)構(gòu)改變和精子活力降低[7]；草魚(Ctenopharyngodon idellus)胚胎出現(xiàn)明顯致死、致畸現(xiàn)象[8]。

OPS可誘導機體氧化應激，而氧化應激所致的器官代謝紊亂和組織結(jié)構(gòu)破壞是許多疾病的主要作用機制[9]，但目前關(guān)于水胺硫磷對生物體的氧化應激機制以及組織結(jié)構(gòu)影響的研究報道還相對較少。肝臟是多種物質(zhì)進行氧化還原代謝的主要場所，相對其他器官更易受到氧化損傷，因此，本研究以哺乳動物昆明種小鼠為受試動物，水胺硫磷按0.11、1.08、2.16 mg·kg-13個不同劑量以灌胃方式對小鼠進行染毒7 d后，分別測定小鼠肝臟組織中2種抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性、抗氧化物質(zhì)谷胱甘肽(GSH)的含量，以及反映膜脂質(zhì)過氧化程度的丙二醛(MDA)含量，同時對肝臟的組織形態(tài)學變化進行觀察，旨在了解不同劑量水胺硫磷亞急性染毒對小鼠對肝臟的損傷和氧化應激的關(guān)系，為進一步研究水胺硫磷的毒性機制提供科學依據(jù)。

1　材料與方法(Materials and methods)

1.1試劑與儀器

水胺硫磷乳油(湖北仙隆化工股份有限公司生產(chǎn)，有效成分含量20.0%)、考馬斯亮藍(Coomassie)G-250、牛血清白蛋白、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鄰苯三酚、疊氮化鈉、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、5,5'-二硫?qū)ο趸姿?DTNB)、三氯醋酸(TCA)、硫代巴比妥酸(TBA)、檸檬酸三鈉、磺基水楊酸等均為國產(chǎn)分析純。

SpectraMax M2多功能酶標儀(美國Molecular Devices公司)、KD-TS3A自動組織脫水機(浙江省金華市科迪儀器設備有限公司)、KD-BL型包埋機(浙江省金華市科迪儀器設備有限公司)、KD-1580型切片機(浙江省金華市科迪儀器設備有限公司)、DP73光學顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

1.2實驗設計

水胺硫磷乳油主要成分為水胺硫磷原藥、溶劑(二甲苯)和乳化劑。二甲苯和乳化劑均為低毒物質(zhì)，急性口服和慢性實驗僅見動物肝臟腫大，組織學檢查并無明顯病理改變[10-11]，因此可以排除水胺硫磷乳油中其他組分對水胺硫磷毒性研究的影響。昆明種小鼠購自山西康寶生物制品有限公司動物室，體重(28.0±0.25) g，每天定時給予商業(yè)用鼠糧，自由飲水和活動，全部動物飼養(yǎng)1周后開始正式試驗。由于雄性小鼠LD50相比雌性較低，因此選擇雄性為實驗對象[1]，將20只小鼠隨機分成4組，包括3個染毒組和1個陰性對照組，按體重連續(xù)灌胃7 d，染毒期間小鼠可以自由飲水和進食。選取1/100 LD50、1/10 LD50、1/5 LD503個劑量作為染毒組，即0.11、1.08、2.16 mg·kg-1body weight，分別稱為低、中、高劑量組。染毒組以花生油稀釋為不同劑量水胺硫磷稀釋液，同時陰性對照組用花生油灌胃。

1.3肝細胞勻漿和肝臟組織切片的制備

染毒結(jié)束后將小鼠頸椎脫臼處死，立即剖腹，取出肝臟，在冰冷的pH 7.5磷酸緩沖液(PBS)中漂洗3次后，濾紙拭干表面水分，然后分成2份。一份稱取0.1 g并加入1 mL預冷的PBS，用眼科剪剪碎后全部移入玻璃勻漿器中，冰浴下充分研碎，低溫高速離心機10 000 r·min-1離心15 min，靜置片刻后取上清液，制成10%肝組織勻漿液，用于測定相關(guān)酶的活性；另一份用體積百分比為10%的甲醛溶液固定24 h，經(jīng)過脫水、透明、包埋、切片、鋪片、脫蠟等常規(guī)石蠟切片步驟，H&E染色15 min后，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察肝臟組織的病理變化[12]。

1.4肝組織勻漿液SOD、GSH-Px、GSH、MDA測定

蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮蘭比色法[13]；SOD活性測定采用鄰苯三酚自氧化法[14]；GSH-Px和GSH活性測定根據(jù)DTNB比色法[15]；MDA測定參照TBA法[16]。以上指標的測定，均采用全波長酶標儀進行。

SOD活力測定：向EP管中加入一定量10%肝組織勻漿液，以控制鄰苯三酚自氧化率0.035 A·min-1(A為吸光度)。依次加入Tris-HCl(pH=8.2)4.5 mL、雙蒸水4.2 mL，水浴(25 ℃)20 min后加入25 ℃預熱的鄰苯三酚0.3 mL，搖勻后加入酶標板325 nm波長測定吸光值。設定每mg組織蛋白在1 mL反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量為一個酶活力單位(U)。

GSH-Px活力測定：樣品管和非酶管分別加10%肝組織勻漿液和1 mmol·L-1GSH 40 μL，將非酶管中的勻漿液加熱使其中的酶失活。兩管在37 ℃水浴5 min后加預熱20 μL H2O2，繼續(xù)37 ℃水浴3 min；然后加0.16 mol·L-1三氯醋酸(TCA)160 μL，冰浴10 min，5 000 r·min-1離心3 min；取200 μL上清液，加0.32 mol·L-1磷酸氫二鈉(Na2HPO4)250 μL，4.8 mol·L-1氫氧化鈉10 μL，1 mol·L-1DTNB 50 μL，搖勻顯色10 min后，加入酶標板于422 nm波長下分別測定吸光值。規(guī)定每mg蛋白每min(扣除非酶反應)使GSH濃度降低1 μmol為一個酶活力單位(U)。

GSH的測定：取100 μL勻漿液加質(zhì)量百分比為10%的TCA 25 μL混勻后冰浴10 min，5 000 r·min-1離心3 min，在50 μL上清液中加入等體積的磷酸緩沖液并調(diào)節(jié)pH為7.5。取50 μL混合液加入3倍體積的0.15 mmol·L-1DTNB，搖勻后避光5 min至顯色，加入酶標板中在420 nm波長測定吸光值(以雙蒸水調(diào)零)，依據(jù)預先制作的標準曲線測的濃度，含量以nmol·L-1表示。

MDA的測定：取10 μL肝組織勻漿上清液于EP管，分別加入質(zhì)量百分比分別為0.67%的TBA 80 μL和質(zhì)量百分比為10%的TCA 200 μL，混勻，沸水浴40 min流水待冷卻后，5 000 r·min離心15 min，吸取200 μL上清液于酶標板中在532 nm測吸光值，含量以nmol·mg-1prot表示。

1.5數(shù)據(jù)處理

實驗所得數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標準差(Mean±SD)表示，使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析處理，用ANOVA方差分析2種抗氧化酶、抗氧化物質(zhì)以及MDA含量檢驗組間平均值與對照組的差異性(*P<0.05，**P<0.01)。

2　結(jié)果(Results)

2.1小鼠肝組織抗氧化酶活性的變化

從圖1A和B可以看出，經(jīng)過水胺硫磷7 d染毒后，0.11 mg·kg-1低劑量處理組小鼠肝臟組織的SOD與GSH-Px與陰性對照相比都分別降低，但差異并不顯著(P>0.05)；而1.08、2.16 mg·kg-1中、高劑量組2種抗氧化酶活性與陰性對照相比也分別降低，且差異顯著(P<0.05或P<0.01)，其中高劑量組SOD活力與GSH-Px活力分別降至108.56 U·mg-1prot和92.28 U·mg-1prot，抑制率達到24.49%和27.1%。各染毒處理組小鼠肝臟組織SOD與GSH-Px活性變化趨勢相似，均隨水胺硫磷暴露劑量的增加而降低(r分別為-0.965和-0.970，P<0.05，n=5)。

2.2小鼠肝組織抗氧化物質(zhì)GSH含量的變化

從圖1C可見，7 d水胺硫磷處理后，小鼠肝臟GSH含量隨水胺硫磷暴露劑量的增加而降低(r=-0.989，P<0.05，n=5)，高劑量組GSH含量降至最低值4.634 nmol·L-1，抑制率達到23.5%。低劑量組與陰性對照相比差異并不顯著(P>0.05)，但中、高2個劑量處理組GSH含量與陰性對照相比差異顯著(P<0.05或P<0.01)。

2.3小鼠肝組織MDA含量的變化

從圖1D可以看出，3個水胺硫磷劑量處理組除低劑量組(0.11 mg·kg-1)外MDA含量在脅迫7 d后，與陰性對照組相比均顯著升高(P<0.01)，高劑量組MDA含量相比陰性性對照提高了110.8%。且隨水胺硫磷暴露劑量的增加而升高，呈現(xiàn)明顯的劑量-效應關(guān)系(r=0.980，P<0.05)，表明3個劑量組肝臟組織MDA含量在脅迫7 d后受到較顯著的誘導作用。

圖1　不同劑量水胺硫磷作用下小鼠肝臟各指標的變化Fig. 1　Changes of biological indicators in the liver of mice after exposure to different doses of isocarbophos

2.4小鼠肝組織病理學檢測

從圖2可見，水胺硫磷染毒7 d后，低劑量組(圖2B)可以觀察到肝索開始變寬，肝竇變窄，肝細胞開始出現(xiàn)水腫，部分區(qū)域出現(xiàn)點狀壞死和核固縮；中劑量組(圖2C)肝索繼續(xù)增寬，肝竇變窄，大部分肝細胞出現(xiàn)明顯水腫，同時觀察到散在肝細胞核固縮和點狀壞死；高劑量組(圖2D)肝索排列紊亂，部分區(qū)域肝竇甚至完全閉塞，肝細胞水腫嚴重，發(fā)生明顯的氣球樣變，胞漿疏松，細胞界限不清楚，且出現(xiàn)較大面積核固縮和片狀壞死。同時還觀察到隨著水胺硫磷劑量升高小鼠肝細胞周圍炎性細胞浸潤區(qū)域逐漸增多(圖2E)。

3　討論(Discussion)

GSH代表機體細胞非酶促系統(tǒng)清除自由基的能力，主要在肝臟細胞內(nèi)進行合成和消耗?？梢蕴峁┗钚詭€基和H+經(jīng)GSH-Px催化H2O2還原；還可以在酶催化下與自由基結(jié)合，將其及時清除[29]。在機體氧化應激中一般也表現(xiàn)為低脅迫時誘導[30]而高脅迫時抑制[31]。本研究中3個不同劑量水胺硫磷對昆明種小鼠連續(xù)染毒7 d后，除低劑量外，其余2個劑量小鼠肝臟GSH含量均顯著下降，且隨水胺硫磷染毒劑量的升高呈下降趨勢。推測GSH作為GSH-Px酶催化反應的底物或者自身在參與反應時，由于清除自由基被大量消耗，同時大量自由基堆積破壞了GSH恢復的形成條件，從而導致GSH含量下降。

圖2　不同劑量水胺硫磷小鼠肝臟病理組織學變化注：A，對照組；B，0.11 mg·kg-1；C，1.08 mg·kg-1；D，2.16 mg·kg-1；E，炎性細胞浸潤。藍色箭頭代表肝索，黑色箭頭代表肝竇；藍色圓圈代表發(fā)生核固縮細胞，黑色色圓圈代表發(fā)生壞死細胞。Fig. 2　Changes of hepatic pathologic histology in mice after exposure to different doses of isocarbophosNote:A, control group; B, 0.11 mg·kg-1; C, 1.08 mg·kg-1; D, 2.16 mg·kg-1; E, inflammatory cellular infiltration. Blue arrows show hepatic cell cords, black arrows show hepatic sinusoid; blue circles show nuclear pyknotic cells, black arrows show necrotic cell.

MDA是自由基攻擊生物膜，導致磷脂中多價不飽和脂肪酸分解產(chǎn)生的，其含量可以間接反映機體細胞的膜系統(tǒng)的氧化損傷程度[32]。張波等[22]和潘奇正等[23]以較高劑量OPS農(nóng)藥氧樂果對小鼠和大鼠急性或亞急性經(jīng)口染毒，心臟和血清的抗氧化酶活力與對照組相比降低，但MDA含量卻顯著升高。李慧敏等[24]以8.94和89.4 mg·kg-1辛硫磷連續(xù)灌服大鼠15、30 d后，大鼠血漿和肝臟SOD、GSH Px活性隨染毒時間延長呈下降趨勢，但MDA含量呈上升趨勢。本研究也發(fā)現(xiàn)除低劑量組外，中、高劑量組水胺硫磷對小鼠肝臟細胞MDA含量與對照組相比有顯著的誘導作用，并隨水胺硫磷劑量的增加而增加，表明在低劑量水胺硫磷脅迫下，盡管抗氧化酶系統(tǒng)未被顯著抑制，但仍然有部分未得到及時清除的自由基破壞膜系統(tǒng)導致MDA含量增加；在中、高劑量水胺硫磷脅迫下，隨著抗氧化系統(tǒng)受到顯著抑制，自由基攻擊膜蛋白分子使其交聯(lián)并裂解為碎片繼而形成膜孔，導致膜系統(tǒng)的通透性增加，自由基大量侵入并破壞細胞內(nèi)的膜系統(tǒng)，導致膜脂質(zhì)發(fā)生過氧化，從而導致MDA含量極顯著的增加。

OPS不僅局限于抑制乙酰膽堿酯酶活性，還可引發(fā)人類和動物機體組織病理變化。慢性職業(yè)性有機磷農(nóng)藥中毒患者，肝細胞發(fā)生局部壞死或增生，甚至纖維化[33]。辛硫磷和樂果對大鼠慢性暴露15和30 d，也發(fā)生肝細胞腫脹或彌漫性脂肪變性，部分細胞壞死[24,28]。本研究中在水胺硫磷低劑量組，由于抗氧化功能還未受到顯著抑制，自由基尚未大量累積，肝細胞水腫并不明顯；而在中、高劑量組，隨著水胺硫磷劑量升高，累積的自由基破壞肝細胞膜系統(tǒng)，通透性增加，繼而引起細胞內(nèi)滲透壓升高，細胞出現(xiàn)水腫。此外，本研究還觀察到隨著水胺硫磷劑量的增加，小鼠肝臟細胞出現(xiàn)核固縮、壞死以及炎性細胞浸潤的區(qū)域擴大，可能由于劑量越高，自由基累積引起肝細胞釋放細胞因子和趨化因子也越多，炎癥反應越嚴重[34]；而炎癥反應又引起過量自由基產(chǎn)生，這樣形成自由基-炎癥反應-自由基的惡性循環(huán)[35]。

綜上所述，水胺硫磷染毒7 d后，在0.11 mg·kg-1低劑量組小鼠肝臟細胞抗氧化系統(tǒng)尚未受到顯著抑制，MDA含量增加并不顯著，膜系統(tǒng)尚未受到明顯損害；而在1.08、2.16 mg·kg-1中、高劑量組小鼠肝臟細胞抗氧化系統(tǒng)受到顯著抑制，MDA含量極顯著的增加，細胞清除自由基能力下降，導致自由基大量累積，導致膜脂質(zhì)發(fā)生劇烈氧化損傷，繼而引起肝臟細胞損傷，由此推測氧化損傷可能是水胺硫磷致小鼠肝臟毒性損傷的作用機制之一。

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Oxidative Stress of Isocarbophos on the Liver of Mice in A Subacute Exposure

Bian Gaopeng1,2,*, Jiao Haihua1, Shi Baozhong1,2, Zhang Xiaojun3

1. Department of Biological Sciences and Technology, Changzhi College, Changzhi 046011, China 2. Ecological and Environmental Research Institute of Taihang Mountain, Changzhi 046011, China 3. Department of Pathology, Affiliated Hospital Changzhi Health School, Changzhi 04600, China

18 August 2015accepted 11 November 2015

To investigate the mechanism of liver damage caused by isocarbophos, kunming mice were intragastric administered with isocarbophos for 7 days at 0.11, 1.08, 2.16 mg·kg-1, respectively. Then, the activity of antioxidative enzymes: superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px) in the liver tissues, as well as levels of antioxidative substance of glutathione (GSH) and the membrane lipid peroxide of malonaldehyde (MDA) were measured, and compared among the treated groups and the control group. Histopathological changes of liver were also observed. The results showed that compared with the control group, the activity of both SOD and GSH-Px were significantly inhibited (P<0.05), and the level of GSH was decreased dramatically (P<0.05), whereas the level of MDA was significantly increased (P<0.01) in all treated groups except for the low-dosage group (0.11 mg·kg-1). All the biological indicators changed in dose-effect manners. At the same time, histological observations in the medium and high-dosage groups showed edema and necrosis in hepatocytes, and stenosis or even occlusion in hepatic sinusoids. In summary, our results indicate that oxidative damage might be involved in hepatic toxicity after exposure to isocarbophos.

isocarbophos; mice; liver; oxidative damage

中國科學院環(huán)境生物技術(shù)重點實驗室開放研究基金(EBT2013A001)；山西省普通高等本科學校大學生創(chuàng)新性實驗項目(200991)

邊高鵬(1970-)，男，碩士，研究方向為環(huán)境毒理學，E-mail: biangaopeng@163.com

10.7524/AJE.1673-5897.20150818004

2015-08-18 錄用日期：2015-11-11

1673-5897(2015)6-305-08

X171.5

A

邊高鵬, 焦海華, 史寶忠, 等. 水胺硫磷亞急性暴露對小鼠肝臟氧化應激的影響[J]. 生態(tài)毒理學報，2015, 10(6): 305-312

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