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    利用qPCR技術(shù)檢測柑橘潰瘍病菌的靈敏度分析

    2015-10-09 05:25:42李文娟戴素明李大志鄧子牛
    湖南農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年3期
    關(guān)鍵詞:數(shù)量級潰瘍病冰糖

    李文娟,肖 翠,戴素明,李大志,鄧子牛

    (湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院,國家柑橘改良中心長沙分中心,湖南 長沙410128)

    柑橘潰瘍?。–itrus bacterial canker disease,CBCD)是由柑橘潰瘍病菌(Xanthomonas axonopodis pv.citri,Xac)引起的一種世界性檢疫病害,嚴重危害柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1]。對于非疫區(qū)要嚴格禁止攜帶潰瘍病菌的柑橘材料流入,加強對柑橘潰瘍病菌的檢測。目前,常用的柑橘潰瘍病菌檢測方法有典型癥狀目測法、組織病理切片法、病原分離物致病性檢測、噬菌體檢測法、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和斑點免疫結(jié)合法(DIA)等,但這些方法普遍存在檢測周期長、特異性不強、靈敏度不高的局限性,不能很好地滿足檢驗檢疫工作的要求[2]。相比傳統(tǒng)檢測方法,常規(guī)PCR 檢測技術(shù)更快速、更準(zhǔn)確。王中康等[3]根據(jù)柑橘潰瘍病菌全基因組中獨有的保守蛋白質(zhì)基因序列,設(shè)計篩選出一對特異性引物(JYF5/R5),能將柑橘潰瘍病菌與非致病性黃單胞菌、野油菜黃單胞菌等近緣種進行區(qū)分,且d在健康柑橘樣品中不能擴增出條帶。

    實時熒光定量PCR (Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction,qPCR)是對常規(guī)PCR 進行改進的新型核酸定量技術(shù),具有實時、精確、靈敏等特點。研究表明,采用實時熒光定量PCR 建立的柑橘潰瘍病菌檢測體系,特異性強,靈敏度比常規(guī)PCR 技術(shù)高2~3個數(shù)量級[4]。

    湖南省是我國重要的柑橘生產(chǎn)基地,其主栽品種冰糖橙常年遭受柑橘潰瘍病危害,急需建立快速準(zhǔn)確的冰糖橙潰瘍病菌檢測方法。研究以常規(guī)PCR 為對照,分析qPCR 檢測柑橘潰瘍病菌DNA 和柑橘潰瘍病菌菌量的靈敏度;同時,應(yīng)用該方法對接種柑橘潰瘍病菌后的冰糖橙樣品進行動態(tài)監(jiān)測,以期為實現(xiàn)冰糖橙潰瘍病菌早期檢測提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    無病毒冰糖橙植株、柑橘潰瘍病菌種均由國家柑橘改良中心長沙分中心提供。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 菌懸液制備 挑取28℃劃線培養(yǎng)48 h 的柑橘潰瘍病菌單菌落至LB 液體培養(yǎng)基中,于28℃下200 rpm 振蕩培養(yǎng)20 h;室溫下以8 000 rpm 離心5 m in 收集菌體;用無菌水重懸菌體,并調(diào)整OD600≈0.6 后用系列稀釋法確定菌懸液濃度。

    1.2.2 病原菌接種 將不同濃度的潰瘍病菌液接種于冰糖橙葉片上,以無菌水作對照,接種量為5 μL。取樣以接種點為中心用6 mm 打孔器打取圓片,每個處理打取圓片10 片,重復(fù)3 次,用于后續(xù)DNA 提取和潰瘍病菌檢測。

    1.2.3 基因組DNA 的提取 采用細菌基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN)提取柑橘潰瘍病菌DNA,步驟參照說明書。冰糖橙DNA 的提取采用CTAB 法,步驟參考高志明等[5]的方法。

    1.2.4 qPCR 反應(yīng)程序 反應(yīng)混合液體系:SYBR Green SuperM ix(Bio-Rad)10 μL,上游引物1 μL(10 μM),下游引物1 μL(10 μM)(引物參照趙云等[2]Xac F06/R06 引物對),反應(yīng)總體積為20 μL。反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5 m in;95℃變性15 s,62℃退火30 s,72℃延伸20 s,進行40個循環(huán);72℃延伸3 min,16℃保存。

    1.2.5 常規(guī)PCR 反應(yīng)程序 反應(yīng)混合液體系:10×Buffer(含Mg2+)2 μL,Taq DNA 聚合酶(全式金公司)0.2 μL(5 u/μL),dNTPs(全式金公司)1 μL(10 mM),上游引物1 μL(10 μM),下游引物1 μL(10 μM)(引物參照趙云等[2]Xac F06/R06 引物對),反應(yīng)總體積為20 μL。反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5 m in;95℃變性15 s,62℃退火30 s,72℃延伸20 s,進行35個循環(huán);72℃延伸3 min,16℃保存。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 PCR 檢測柑橘潰瘍病菌DNA 的靈敏度分析

    以未感病冰糖橙葉片DNA 為對照,用qPCR 和常規(guī)PCR 對純柑橘潰瘍病菌DNA 和混有植物DNA的柑橘潰瘍病菌DNA 進行檢測。從圖1 中可以看出,常規(guī)PCR 檢測純潰瘍病菌DNA 的質(zhì)量下限為2×10-4ng,其中DNA 質(zhì)量在200~2×10-3ng 范圍內(nèi)常規(guī)PCR擴增條帶亮度明顯,DNA 質(zhì)量為2×10-4ng 時條帶亮度微弱,DNA 質(zhì)量為2×10-5ng 及以下數(shù)量級時,沒有條帶。

    從圖2 中可以看出,當(dāng)柑橘潰瘍病菌DNA 混有植物DNA 時,常規(guī)PCR 檢測下限為2×10-3ng,其中DNA 質(zhì)量在200~2×10-2ng 范圍內(nèi)常規(guī)PCR 擴增條帶亮度明顯,DNA 質(zhì)量為2×10-3ng 時條帶亮度微弱,DNA 質(zhì)量為2×10-4ng 及以下數(shù)量級時,沒有條帶。由此可見,植物DNA 會影響常規(guī)PCR 擴增效果,使其檢測靈敏度下降1個數(shù)量級。

    圖1 Xac DNA 常規(guī)PCR 檢測電泳圖

    圖2 Xac DNA 與植物DNA 混合后常規(guī)PCR 檢測電泳圖

    從表1 中可以看出,對于純柑橘潰瘍病菌DNA,試驗所配置的所有數(shù)量級qPCR 都能檢測到,而常規(guī)PCR 檢測不到2×10-5ng 及以下數(shù)量級;同樣,對于混有植物DNA 的柑橘潰瘍病菌DNA,所有數(shù)量級qPCR 都能檢測到,而常規(guī)PCR 檢測不到2×10-4ng 及以下數(shù)量級。此外,對于混有或不混有植物DNA 的樣品,qPCR 檢測的結(jié)果較為相似,由此可知,植物DNA對qPCR 檢測影響不顯著。

    2.2 PCR 檢測柑橘潰瘍病菌量的靈敏度分析

    用常規(guī)PCR 和qPCR 對不同濃度柑橘潰瘍病菌液進行檢測,結(jié)果見圖3 和表2。由圖3 可知,常規(guī)PCR 檢測柑橘潰瘍病菌菌量下限為40 cfu,其中菌量在4×106~4×102cfu 范圍內(nèi)常規(guī)PCR 擴增條帶亮度明顯,菌量為40 cfu 時條帶亮度微弱,菌量為4 cfu 時沒有條帶。而由表2 可知,qPCR 所有數(shù)量級都能檢測到,常規(guī)PCR 檢測不到的4 cfu 也能檢測到。

    用qPCR 和常規(guī)PCR 對接種不同菌量的冰糖橙樣品DNA 進行檢測,結(jié)果見圖4 和表3。從圖4 中可以看出,常規(guī)PCR 檢測柑橘潰瘍病菌接菌量下限為1.5×104cfu,其中接菌量在1.5×107~1.5×105cfu 范圍內(nèi)常規(guī)PCR 擴增條帶亮度明顯,接菌量為1.5×104cfu時條帶亮度微弱,接菌量在1.5×103cfu 及以下數(shù)量級時沒有條帶。而從表3 中可以看出,qPCR 所有數(shù)量級都能檢測到,常規(guī)PCR 檢測不到的1.5×103cfu 及以下數(shù)量級也能檢測到。

    表1 不同DNA 模板qPCR 檢測結(jié)果

    圖3 不同菌量的常規(guī)PCR 檢測電泳圖

    表2 不同菌量的qPCR 檢測結(jié)果

    2.3 利用PCR 對冰糖橙接種后進行動態(tài)監(jiān)測

    圖4 接菌量不同的冰糖橙樣品的常規(guī)PCR 檢測

    表3 接菌量不同的冰糖橙樣品的qPCR 檢測

    通過觀察,接菌量為5×103cfu 的冰糖橙在第9 天開始出現(xiàn)潰瘍病典型病斑。分別用常規(guī)PCR 和qPCR 對接種后不同天數(shù)材料進行取樣分析,結(jié)果見圖5 和圖6。由圖5 可知,常規(guī)PCR 僅能在接種后第2 天的樣品中檢測出柑橘潰瘍病菌,且條帶非常微弱;隨著接種后的時間延長,常規(guī)PCR 擴增條帶的亮度逐漸增強。而由圖6 可知,qPCR 在接種后立刻就能在植物樣品中檢測出柑橘潰瘍病菌。隨著時間推移Cq 值減小,說明接種后潰瘍病菌在逐漸增殖,其中接種后1~3 d增殖緩慢,第4 天開始增殖迅速。

    圖5 接種潰瘍病菌后冰糖橙樣品的常規(guī)PCR 檢測

    圖6 接種潰瘍病菌后冰糖橙的qPCR 檢測

    3 討論

    柑橘潰瘍病是柑橘類作物的主要病害,建立快速準(zhǔn)確的診斷鑒定體系是柑橘種植地區(qū)病情監(jiān)測以及柑橘苗木、果品出入境檢驗檢疫服務(wù)的迫切需求[6]。試驗通過常規(guī)PCR 對柑橘潰瘍病菌DNA 和柑橘潰瘍病菌進行檢測,結(jié)果顯示其檢測靈敏度比qPCR 低1~3個數(shù)量級,且植物DNA 會影響常規(guī)PCR 對潰瘍病菌DNA 的檢測,使其檢測靈敏度下降1個數(shù)量級,而qPCR 不受植物DNA 的影響。

    相關(guān)研究表明,基于PCR 的檢測方法,柑橘材料制樣會影響PCR 擴增,田間病害防治大量施用的多種銅制劑中Cu2+殘存于柑橘葉面,會抑制PCR 擴增,制樣時柑橘組織外滲的色素、多元酚以及氯原酸[7]等物質(zhì)也會抑制PCR 擴增,這些物質(zhì)的抑制作用可能導(dǎo)致檢測的假陰性,從而影響病害診斷與病原鑒定。

    柑橘潰瘍病菌感染柑橘時有一定的潛伏期,在潛伏期內(nèi)柑橘植株不表現(xiàn)感病癥狀,采用傳統(tǒng)的檢測方法難以檢測出帶菌但不顯癥的柑橘材料,因此難以避免這類材料流入非疫區(qū)。目前,針對柑橘潰瘍病菌的分子檢測多是利用常規(guī)PCR 和實時熒光定量PCR 等方法[8]。2012年,Bruno D 等[9]利用實時熒光定量PCR對Venturia spp. 在蘋果葉片上的動態(tài)生長進行監(jiān)控。這表明也可以利用實時熒光定量PCR 來監(jiān)控柑橘材料上潰瘍病菌的增殖。研究利用qPCR 和常規(guī)PCR 對接種后冰糖橙樣品進行分析,qPCR 即時就能檢測到柑橘潰瘍病菌,并能觀察到潰瘍病菌先慢后快的增殖趨勢,而常規(guī)PCR 要接種后2 d 才能檢測到柑橘潰瘍病菌,且擴增條帶很微弱。由此可見,qPCR 適用于柑橘無癥帶菌材料的早期檢測,這將為qPCR 應(yīng)用于冰糖橙潰瘍病菌檢測提供參考,也將為利用qPCR 實現(xiàn)冰糖橙潰瘍病菌早期檢測提供依據(jù)。

    [1]劉 鵬,易圖永,安 然,等.湖南省柑橘潰瘍病病菌生理生化特性初步研究[J].中國植保導(dǎo)刊,2009,29(6):5-8.

    [2]趙 云.柑橘潰瘍病的定量PCR檢驗檢疫技術(shù)研究[D].重慶:重慶大學(xué),2006.

    [3]王中康,孫憲昀,夏玉先,等.柑橘潰瘍病菌PCR快速檢驗檢疫技術(shù)研究[J].植物病理學(xué)報,2004,31(1):14-20.

    [4]殷幼平,黃冠軍,趙 云,等.柑橘潰瘍病菌實時熒光定量PCR檢測與應(yīng)用[J].植物保護學(xué)報,2007,34(6):607-613.

    [5]高志明,范少輝,彭鎮(zhèn)華,等.基于CTAB法提取毛竹基因組DNA的探討[J].林業(yè)科學(xué)研究,2006,19(6):725-728.

    [6]Tim S S,Shabbir A R,Sun X A,et al.Meeting the challenge of eradicating citrus canker in Florida-Again[J].Plant Disease,2001,85:340-356.

    [7]Singh R P,Singh M,King R R.Use of citric acid for neutralizing polymerase chain reaction inhibition by chlorogenic acid in potato extracts[J].JournalofVirologicalMehtods,1998,(74):231-235.

    [8]陳小帆,莫 瑾,左 靜,等.利用雙重PCR技術(shù)檢測柑橘潰瘍病菌[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2010,31(3):32-35.

    [9]Bruno D,Anke D L,Rozemarijn D,etal.Real-time PCR asa promising tool tomonitorgrowth ofVenturiaspp.in scab-susceptibleand resistant apple leaves[J].European Journal of Plant Pathology,2012,134:821-833.

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