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    不同質(zhì)地土壤煙株根際微生物菌群變化分析

    2015-10-09 05:25:28王淑玉李小龍李紅麗
    湖南農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年3期
    關(guān)鍵詞:青枯病煙株壤土

    王淑玉,李小龍,李紅麗,曾 強(qiáng),王 巖,林 卿,田 甜,孫 妍

    (1. 鄭州大學(xué)化工與能源學(xué)院,河南 鄭州450000;2. 福建省煙草公司南平市公司邵武分公司,福建 邵武354000)

    良好的土壤生態(tài)環(huán)境是農(nóng)業(yè)健康、可持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)[1]。土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要參與者,具有以下功能:促進(jìn)植物營(yíng)養(yǎng)元素的轉(zhuǎn)化和土壤肥力形成[2];分解土壤有機(jī)質(zhì),形成腐殖質(zhì)[3-4];與植物共生,促進(jìn)植物的生長(zhǎng),防治作物土傳病害的發(fā)生[5-6];降解農(nóng)藥殘留等有機(jī)污染物[7]。因此,許多研究把土壤中的真菌、細(xì)菌和放線菌3 大類(lèi)微生物的數(shù)量作為評(píng)價(jià)土壤肥力高低的重要生物學(xué)指標(biāo)[8]。

    由于土壤類(lèi)型和氣候條件不同,各種植區(qū)土壤微生物的區(qū)系和豐度各異。研究表明,作物病害的發(fā)生,尤其是土傳病害的發(fā)生,與根際微生物的數(shù)量和區(qū)系組成以及群落結(jié)構(gòu)等均關(guān)系密切[9-12]。因此,以福建省邵武市不同植煙區(qū)的土壤為研究對(duì)象,在分析土壤基本性質(zhì)和土壤微生物數(shù)量變化的基礎(chǔ)上,通過(guò)16 S rDNA 建立克隆文庫(kù)進(jìn)行土壤細(xì)菌多樣性分析,旨在探討土壤性質(zhì)與煙葉青枯病發(fā)生之間的關(guān)系,為制定有效防控?zé)熑~青枯病措施提供理論與技術(shù)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)地概況及供試品種

    試驗(yàn)于2014年在邵武市沿山鎮(zhèn)徐溪村、城郊鎮(zhèn)高南村和水北鎮(zhèn)故縣村3個(gè)地方進(jìn)行,選擇往年青枯病發(fā)病嚴(yán)重的地塊作為試驗(yàn)田,供試烤煙品種為K326。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 每個(gè)試驗(yàn)地點(diǎn)為1個(gè)處理,分別為:T1,沿山鎮(zhèn)徐溪村;T2,城郊鎮(zhèn)高南村;T3,水北鎮(zhèn)故縣村。每個(gè)處理選擇3個(gè)性質(zhì)相似的田塊作重復(fù),共占地667 m2。植煙密度為1 100 株/667m2,株行距為50 cm×120 cm,純氮用量為9.09 kg/667m2,N︰P︰K 比例為1.0︰0.8︰2.7。

    1.2.2 測(cè)定項(xiàng)目及方法 (1)土樣采集。分別于煙苗移栽前、旺長(zhǎng)期、采摘期(健康煙株和發(fā)病煙株)和采摘后期采集土壤樣品,具體方法為:各小區(qū)隨機(jī)選取3株烤煙,將整棵煙株連根拔出,取粘接在細(xì)根上的土壤混勻,即為根際土壤,將3 株烤煙的根際土壤混合成1個(gè)樣品,采用四分法保留1 kg,于4℃冰箱內(nèi)存放待測(cè)。(2)土壤機(jī)械組成測(cè)定。土壤機(jī)械組成依照《農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 1121-2006)中的測(cè)定方法進(jìn)行。(3)土壤基本性質(zhì)測(cè)定。取部分根際土壤風(fēng)干,用木槌研磨后過(guò)60 目篩,用電位法測(cè)定土壤pH 值;土壤有機(jī)質(zhì)、速效鉀、速效磷、堿解氮分別采用重鉻酸鉀容量法、火焰分光光度計(jì)法、碳酸氫鈉法、堿解擴(kuò)散法測(cè)定[13]。(4)土壤微生物數(shù)量測(cè)定。采用稀釋平板計(jì)數(shù)法測(cè)定土壤微生物數(shù)量[14],細(xì)菌培養(yǎng)采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基,放線菌培養(yǎng)采用高氏合成1 號(hào)瓊脂培養(yǎng)基,真菌培養(yǎng)采用馬丁孟加拉紅鏈霉素瓊脂培養(yǎng)基。(5)宏基因組16S rDNA 測(cè)序。按OMEGA 試劑盒的步驟提取土壤DNA,對(duì)提取到的基因組DNA 進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè),查看基因組DNA 的完整性與濃度。利用Qubit2.0 DNA 檢測(cè)試劑盒對(duì)基因組DNA 精確定量,以確定PCR 反應(yīng)應(yīng)加入的DNA 量,按照配置好的PCR 體系進(jìn)行擴(kuò)增,采用瓊脂糖回收試劑盒(cat:SK8131)對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行回收?;厥债a(chǎn)物用Qubit2.0定量,根據(jù)測(cè)得的DNA 濃度,將所有樣品按照1︰1的比例進(jìn)行混合;混合后充分震蕩均勻。該混合樣品用于后續(xù)的樣品建庫(kù)(加測(cè)序標(biāo)簽)與測(cè)序。去除序列中非擴(kuò)增區(qū)域序列,然后用mothur 中的pre.cluster 軟件進(jìn)行測(cè)序錯(cuò)誤校正,最后采用uchime 去除序列中的嵌合體。采用RDP classifier 軟件對(duì)處理后序列進(jìn)行物種分類(lèi),采用Na觙ve Bayesian assignment 算法對(duì)每條序列在genus 水平上計(jì)算其分配到的概率值。(6)煙株發(fā)病率調(diào)查。在煙株發(fā)病期,對(duì)每個(gè)小區(qū)中發(fā)病植株進(jìn)行計(jì)數(shù),發(fā)病率用發(fā)病個(gè)體占群體總數(shù)的百分?jǐn)?shù)來(lái)表示。發(fā)病率(%)=(發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù))×100。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 土壤機(jī)械組成與基本性質(zhì)

    如表1 所示,沿山鎮(zhèn)徐溪村(T1)和城郊鎮(zhèn)高南村(T2)的試驗(yàn)田土壤均屬棕色輕壤土,而水北鎮(zhèn)故縣村(T3)的試驗(yàn)田土壤屬灰色砂壤土;其中,城郊鎮(zhèn)高南村和水北鎮(zhèn)故縣村的土壤pH 值相近,均在5.1 左右,而沿山鎮(zhèn)徐溪村的土壤偏酸性,pH 值為4.60;沿山鎮(zhèn)徐溪村的土壤有機(jī)質(zhì)含量最高,其次為水北鎮(zhèn)故縣村,城郊鎮(zhèn)高南村的土壤有機(jī)質(zhì)含量最少,且前者與后兩者之間的差異顯著;不同試驗(yàn)地的氮磷鉀養(yǎng)分差異也較大。

    表1 各試驗(yàn)點(diǎn)土壤的機(jī)械組成和理化性質(zhì)

    2.2 煙草根際土壤微生物數(shù)量的變化

    通常情況下,農(nóng)業(yè)土壤中微生物的種類(lèi)、數(shù)量與當(dāng)?shù)刈匀簧鷳B(tài)如土壤種類(lèi)、氣候條件等密切相關(guān)。當(dāng)這些生態(tài)條件發(fā)生改變時(shí),土壤微生物的種類(lèi)和數(shù)量也會(huì)隨之發(fā)生較大變化[15]。也正是由于微生物種類(lèi)和數(shù)量的這些變化,反映出生態(tài)條件的改變以及對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)生的效應(yīng)。例如土壤有機(jī)質(zhì)的礦化與合成、肥料養(yǎng)分的礦化與生物固持、土壤中病原菌數(shù)量比例的消減或增長(zhǎng)等[16]。

    由于3個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的土壤類(lèi)型及理化性狀有較大差異,所以土壤微生物的種類(lèi)和數(shù)量也明顯不同。從表2 中可以看出,T1~T3 試驗(yàn)點(diǎn)煙株根際土微生物總量分別為84.98×105、49.89×105、36.20×105cfu/g,處理間差異顯著;其中,除T3 試驗(yàn)點(diǎn)外,其他兩個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)各類(lèi)微生物數(shù)量由多到少排列依次為細(xì)菌>真菌>放線菌。就不同性質(zhì)土壤來(lái)看,輕壤土中煙草根際微生物的總量以及細(xì)菌、真菌和放線菌各類(lèi)型微生物的數(shù)量均多于砂壤土中的。

    從表2 中還可看出,在移栽前土壤中微生物數(shù)量較低,移栽煙苗后土壤中微生物含量均增高,這是因?yàn)樽魑锓N植施加肥料后,微生物有了充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),含量迅速增加。在煙株生育期間,根際土微生物總量和細(xì)菌數(shù)量變化趨勢(shì)較為一致,表現(xiàn)出先增后減的趨勢(shì),其峰值出現(xiàn)在煙草生長(zhǎng)發(fā)育較快的旺長(zhǎng)期或采摘初期。進(jìn)入采摘期之后,根系分泌物逐漸減少,根際微生物數(shù)量又有一定幅度地減少。

    2.3 不同生育期煙株根際土壤中細(xì)菌類(lèi)群的變化

    表2 各試驗(yàn)點(diǎn)在烤煙不同生育期土壤微生物的數(shù)量 (cfu/g)

    從表3 中可以看出,不同試驗(yàn)田土壤中的優(yōu)勢(shì)菌群不同,同一試驗(yàn)田在不同時(shí)期土壤中優(yōu)勢(shì)菌群也有差別。其中,移栽前各處理根際土壤中的優(yōu)勢(shì)菌群為Massilia、Gp1 和Gp3(T1),Clostridium、Massilia 和Gp1(T2),Gp1、Sphingomonas 和Massilia(T3);旺長(zhǎng)期各處理根際土壤中的微生物數(shù)量明顯增多,優(yōu)勢(shì)菌群也隨之發(fā)生改變,T1 土壤中優(yōu)勢(shì)菌群為Sphingomonas、Gp1 和Ferruginibacter,T2 土 壤 中 的 優(yōu) 勢(shì) 菌 群 為Sphingomonas、TM 7 和Massilia,T3 土壤中的優(yōu)勢(shì)菌群為Gp1、Sphingomonas 和Gp3;采摘期健康煙株各處理根際土壤中的優(yōu)勢(shì)菌群為Sphingomonas、Gp1 和Gp3(T1),Sphingomonas、Gp1 和Gp3(T2),Gp1、Gp3 和Subdivision3(T3);采摘期發(fā)病煙株各處理根際土壤中優(yōu)勢(shì)菌群為Gp1、Gp3 和Sphingomonas(T1),Gp1、Gp3 和Subdivision3(T2),Gp1、Gp3 和Spartobacteria(T3)。

    從表4 中可以看出,在烤煙生育期內(nèi)各試驗(yàn)點(diǎn)土壤中細(xì)菌文庫(kù)的覆蓋率達(dá)到70%以上,說(shuō)明所建文庫(kù)能真實(shí)反應(yīng)出該環(huán)境細(xì)菌多樣性特征;香農(nóng)指數(shù)是衡量群落的異質(zhì)性,而細(xì)菌文庫(kù)的香濃指數(shù)均達(dá)到7.00以上,表明根際的細(xì)菌群落多樣性已達(dá)較高水平。

    ACE 指數(shù)和Chao1 指數(shù)是預(yù)測(cè)環(huán)境中細(xì)菌總數(shù)的指標(biāo),值越高則物種越多。由表4 可知,采摘期,3個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的根際土壤中ACE 指數(shù)與Chao1 指數(shù)均表現(xiàn)為T(mén)2>T1>T3,即輕壤土中細(xì)菌總量較砂壤土多。從表4 中還可以看出,在煙葉采摘期,健康植株的根際土壤中的這兩個(gè)指標(biāo)均顯著高于發(fā)病植株的根際土壤的。這說(shuō)明在健康狀態(tài)下,煙株根際土壤細(xì)菌多樣性程度較高,并且健康植株根際土壤中的細(xì)菌多樣性和豐度遠(yuǎn)高于發(fā)病植株根際土壤中的。有研究表明,病原物在侵入寄主的過(guò)程中以及侵入后,會(huì)在一定程度上干擾植物的正常代謝,引起根系分泌物的改變。由此推測(cè),發(fā)病植株根際中烤煙青枯病菌可能誘導(dǎo)根際環(huán)境發(fā)生了相應(yīng)變化。

    在T1 和T2 土壤中,健康植株根際的Sphingomonas數(shù)量高于發(fā)病植株根際的數(shù)量。Sphingomonas,即鞘氨醇單胞菌,屬變形細(xì)菌的4 亞類(lèi),該類(lèi)菌株均為革蘭氏陰性菌,無(wú)孢子,以單側(cè)生極性鞭毛運(yùn)動(dòng),多呈黃色,專(zhuān)性需氧且能產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶;除此之外,鞘氨醇單胞菌還可將戊糖、己糖及二糖轉(zhuǎn)變成酸。由于鞘氨醇單胞菌對(duì)芳香化合物有極為廣泛的代謝能力,并且該菌屬某些菌種能夠合成有價(jià)值的胞外生物高聚物,從而形成疏水表面,有利于這些細(xì)菌在生態(tài)環(huán)境中存活并方便其攝取芳香化物,具有一定的生防作用。

    2.4 試驗(yàn)點(diǎn)煙株青枯病發(fā)生情況

    從表5 中可以看出,第一次調(diào)查時(shí)(6月24日)煙株青枯病發(fā)病率以T3 最高,T1 的發(fā)病率最低;到后兩次調(diào)查時(shí),T3 的發(fā)病率仍居高不下,發(fā)病率由高到低均表現(xiàn)為T(mén)3>T2>T1。采摘結(jié)束時(shí)T3 發(fā)病率分別比T1、T2 高出20.79、9.02個(gè)百分點(diǎn),病情指數(shù)分別比T1、T2 高19.52、12.29。由此可見(jiàn),不同土壤類(lèi)型對(duì)煙株青枯病的發(fā)生有一定影響。T1 和T2 土壤中微生物總量最高且種類(lèi)豐富,且土壤中優(yōu)勢(shì)菌群較為分散,微生物結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定,病原微生物較難打破原有菌群結(jié)構(gòu),故發(fā)病較輕;而T3 土壤中菌落數(shù)量相對(duì)較少,且微生物種類(lèi)不如T1、T2 豐富,因此其土壤菌群結(jié)構(gòu)易受外界因素影響而發(fā)生改變。另外,T3 試驗(yàn)點(diǎn)土質(zhì)偏砂質(zhì)化,在煙葉青枯病發(fā)病高峰期恰逢邵武市雨季,青枯病病原菌隨雨水?dāng)U散,蔓延迅速,從而造成青枯病大面積爆發(fā)。

    表3 各試驗(yàn)點(diǎn)在烤煙不同生育期土壤微生物組成及占比 (%)

    表4 試驗(yàn)點(diǎn)土壤根際細(xì)菌群落多樣性指數(shù)

    3 結(jié)論與討論

    隨著人們對(duì)微生物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重要作用的認(rèn)識(shí)不斷加深,用土壤微生物學(xué)特性來(lái)評(píng)價(jià)土壤的健康程度和質(zhì)量日漸被認(rèn)可[17]。微生物學(xué)特性包括土壤微生物數(shù)量、活性、種群多樣性等,其中土壤微生物數(shù)量可以作為指示土壤肥力和監(jiān)控土壤生態(tài)環(huán)境的一個(gè)重要指標(biāo)。一般來(lái)說(shuō),土壤微生物尤其是土壤細(xì)菌數(shù)量越多,則土壤肥力越高,對(duì)作物越有利。而真菌型或放線菌型土壤則不利于作物生長(zhǎng),是土壤肥力下降的標(biāo)志[18]。試驗(yàn)的3個(gè)點(diǎn),土壤微生物中細(xì)菌數(shù)量均占絕對(duì)多數(shù),達(dá)90%以上,均為細(xì)菌型土壤。

    群落多樣性、均勻度和優(yōu)勢(shì)種群集中度是從不同角度衡量生物群落結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的重要指標(biāo)。群落多樣性參數(shù)值與均勻度越大,優(yōu)勢(shì)集中度越小,則群落的結(jié)構(gòu)越復(fù)雜,其反饋系統(tǒng)也就越強(qiáng)大,對(duì)于環(huán)境的變化或來(lái)自群落內(nèi)部種群波動(dòng)的緩沖作用越強(qiáng),群落也就越穩(wěn)定[19]。試驗(yàn)結(jié)果表明,輕壤土中的微生物總量大于砂壤土,且輕壤土中的細(xì)菌數(shù)量及其在土壤微生物中的占比也大于砂壤土,其豐度均較砂壤土高,因此輕壤土中煙草青枯病發(fā)病率顯著低于砂壤土。

    表5 2014年各試驗(yàn)點(diǎn)煙株青枯病發(fā)生情況

    植物根系、土壤與微生物共同構(gòu)成根際生態(tài)系統(tǒng)。在健康的根際生態(tài)系統(tǒng)中,微生物豐度較高,物種間物質(zhì)交換和轉(zhuǎn)化途徑呈現(xiàn)出多樣化,協(xié)調(diào)性增強(qiáng),土壤中有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化速度加快,有利于保持土壤生態(tài)平衡。宏基因測(cè)序結(jié)果表明,土壤微生物結(jié)構(gòu)和數(shù)量隨煙株的移栽以及肥料的施加發(fā)生改變。在煙葉采摘期,同一試驗(yàn)點(diǎn)健康煙株根際土壤細(xì)菌多樣性程度較高,且健康根際土壤中細(xì)菌豐度遠(yuǎn)高于發(fā)病根際土壤。而且這一時(shí)期輕壤土中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)較砂壤土穩(wěn)定。如此,烤煙植株可通過(guò)細(xì)菌與細(xì)菌之間、細(xì)菌與真菌之間的相互作用,抑制病原微生物的生長(zhǎng),維持生態(tài)平衡,提高煙株的抗病性。綜上所述,在以后的病害防治過(guò)程中,可大力研發(fā)土壤菌群調(diào)節(jié)劑或微生物制劑,加強(qiáng)微生物菌群的構(gòu)建,充分發(fā)揮拮抗菌的作用,提高土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化的協(xié)調(diào)性。

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