不同微生物菌株發(fā)酵豬血的研究

崔瑋琪 王紅麗 賀凱強 王莘

摘要：目的：針對13種不同微生物發(fā)酵豬血，研究選出最優(yōu)菌不同配比的水解效果。方法：凱氏定氮及甲醛滴定法。結(jié)果：最優(yōu)三種菌株的不同配比為1%乳S，1%啤酒酵母，0.5%枯草配比組合發(fā)酵豬血水解效果最佳。

關(guān)鍵詞：豬血蛋白；水解度；配比

基金項目：長春市科技局項目（2012223）

中圖分類號：TS201.3文獻標識碼：ADOI編號：10.14025/j.cnki.jlny.2015.10.030

豬血是一種高蛋白、低脂肪、低糖且微量元素含量豐富的肉類工業(yè)副產(chǎn)品[1]，其蛋白含量與豬瘦肉相當[2]，故有液態(tài)肉之稱[3]。我國是世界上養(yǎng)豬最多的國家，每年存欄數(shù)至少在3億頭以上，因此，每年可利用的豬血量達到90萬噸，數(shù)量相當可觀[4]，然而，我國許多屠宰場屠宰牲畜后留下來的血液除了少部分用作菜肴食用外，絕大多數(shù)就直接排放到環(huán)境中，既浪費了寶貴的蛋白質(zhì)資源，又嚴重污染了環(huán)境。目前，利用蛋白酶水解豬血制備多肽研究居多，多數(shù)采用單一酶或者混合酶進行酶解。少數(shù)采用微生物降解豬血。枯草芽孢桿菌能夠產(chǎn)生蛋白酶，具有豐富的產(chǎn)酶系統(tǒng)，具備生產(chǎn)多種酶的應用[5～8]。近年來，枯草芽孢桿菌及微生物群體之間相互作用，由于不同的代謝途徑，產(chǎn)生代謝產(chǎn)物不同，微生物協(xié)同作用能優(yōu)勢互補，相輔相成起到單一菌株起不到的作用[9]。微生物產(chǎn)酶促進蛋白質(zhì)分解、轉(zhuǎn)化，并積累大量的代謝產(chǎn)物[10]。通過微生物發(fā)酵法為豬血蛋白質(zhì)資源在飼料行業(yè)高效利用創(chuàng)造良好條件，又能解決豬血廢棄物帶來的環(huán)保問題。

本試驗利用6種乳酸菌；2種芽孢枯草桿菌；5種酵母菌進行豬血發(fā)酵實驗。選出最優(yōu)菌的不同配比水解效果，為后續(xù)的豬血發(fā)酵蛋白水解實驗提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1原料、試劑材料及儀器

1.1.1原料

豬血：由華正集團提供。

乳酸菌：乳完、乳S、北1、乳M、長1、乳G；酵母菌：啤X-33、啤酒酵母、酵母Q、酵母b、酵母假P；枯草芽孢桿菌：枯草、枯草1，由吉林農(nóng)業(yè)大學生物工程實驗室提供。

1.1.2試劑硫酸銅、氫氧化鈉、吐溫80、牛肉膏、蛋白胨、乙酸鈉、磷酸氫二鉀、甲醛等。

1.1.3儀器HYG-A全溫搖瓶柜，大倉市實驗設備廠；立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；超凈工作臺，蘇州真田潔凈設備有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1指標測定蛋白質(zhì)水解度的測定：采用半微量凱氏定氮法[11]；可溶性蛋白含量的測定：采用考馬斯亮藍法；氨基酸態(tài)氮含量測定：采用電位甲醛滴定法[12]；水解率用甲醛滴定法測氨基酸含量。

1.2.2實驗菌株的搖瓶培養(yǎng)

1.2.2.1三種菌株培養(yǎng)基的配置

配制600毫升MRS培養(yǎng)基、300毫升YEPD培養(yǎng)基及肉湯培養(yǎng)基，將制備好的培養(yǎng)基放入滅菌鍋內(nèi)，120℃滅菌20公鐘備用。

1.2.2.2菌株平板培養(yǎng)在超凈工作臺里倒平板，做好標記，冷卻后將對應菌株涂布接種到培養(yǎng)基上，在各自最適溫度下培養(yǎng)2～3天。

1.2.2.3各菌株的搖瓶培養(yǎng)從固體平板培養(yǎng)基上挑取菌落接種到新配好的液體培養(yǎng)瓶中，將接種好的菌液放入32℃每分鐘120rpm的恒溫搖床中震蕩培養(yǎng)2天。

1.2.3菌株接種發(fā)酵及發(fā)酵液水解度測定

單菌種發(fā)。將培養(yǎng)好的各菌液按接種量5%接種到50毫升的豬血中，做好標記，放入32℃每分鐘120rpm的恒溫搖床中培養(yǎng)60小時。

1.2.4三種混合菌株混合發(fā)酵

1.2.4.1三種菌株不同濃度配比正交實驗

按表1-1中三因素兩水平的正交試驗方案設計4個處理，接種到豬血中，在32℃每分鐘120rmp的恒溫搖床中震蕩培養(yǎng)。48小時后測水解度。

1.2.4.2不同時間對三種混合菌發(fā)酵水解度的影響

在32℃每分鐘120rmp的恒溫搖床中震蕩培養(yǎng)，設定三個時間36小時、48小時、60小時、測混合菌株發(fā)酵液的水解度。

2結(jié)果與分析

2.1單菌種發(fā)酵水解度的比較

將所用的每種菌種接種到50毫升的豬血中。在相同的條件下32℃每分鐘120rpm的恒溫搖床上培養(yǎng)。用甲醛法測其發(fā)酵液中氨基氮的含量從而計算出水解度（見表2-1）。

從表2-1數(shù)據(jù)可以看出每種屬中水解度依次為乳S>北1>乳完>長1≥乳M>乳G，枯草>枯草1，啤酒酵母≥啤X-33>酵母b>酵母Q≥酵母假P。最高的菌株是乳S、枯草、啤酒酵母、啤X-33。因為考慮到啤酒酵母具有去除豬血異味的作用，因此在后面的實驗中選取啤酒酵母。

2.2三種混合菌株發(fā)酵水解度的比較

三種菌啤酒酵母，乳S，枯草根據(jù)表1-1中的配比進行混合發(fā)酵，在48小時測其水解度，數(shù)據(jù)見下表2-2所示。

由表2-2數(shù)據(jù)分析可知，在3個菌株中，根據(jù)極差R啤酒酵母>R乳S≥R枯草，說明啤酒酵母接種量對豬血蛋白水解度的影響最為顯著。根據(jù)K1，K2得知。最佳菌株混合濃度配比為：A2B2C1，即1%啤酒酵母，1%乳S，0.5%枯草。

2.3三種混合菌株發(fā)酵時間對豬血水解度的比較（見表2-3）

由表2-3數(shù)據(jù)分析可知，隨時間的增加，水解度快速增加，48小時達到最大，60小時后菌株的發(fā)酵水解度不會有多大變化，還有下降的趨勢。

3結(jié)語

乳酸菌屬、酵母菌屬及芽孢桿菌屬均能對豬血蛋白進行水解。對豬血蛋白水解度最高的菌株是乳S、枯草、啤酒酵母、啤X-33。三種混合菌株最佳菌株混合濃度配比為：A2B2C1，即1%啤酒酵母，1%乳S，0.5%枯草。

參考文獻

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[12]張華山.豬血蛋白的酶水解及氨基酸含量氨基酸和生物資源1999，21（3）：35-37.

作者簡介：崔瑋琪，吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，碩士研究生在讀，研究方向：酶技術(shù)及發(fā)酵產(chǎn)品的開發(fā)與利用。

通訊作者：王莘，吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，教授，研究方向：微生物資源發(fā)酵與功能產(chǎn)品開發(fā)。