棗酒釀造用酵母的篩選及發(fā)酵性能研究

王慶科，孫中貫*，陳　青（1.海南大學(xué)食品學(xué)院，海南?？?708；.棗莊學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，山東棗莊77160；3.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

棗酒釀造用酵母的篩選及發(fā)酵性能研究

王慶科1，2，孫中貫2，3*，陳青2
（1.海南大學(xué)食品學(xué)院，海南?？?70228；2.棗莊學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，山東棗莊277160；3.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

以棗莊長紅棗發(fā)酵液和棗園土壤為酵母菌株的分離源，經(jīng)過富集培養(yǎng)和多次劃線分離純化，來獲得優(yōu)良的棗酒釀造酵母菌株。經(jīng)過酵母菌株的產(chǎn)氣性能和產(chǎn)酒精性能比較，以及耐酒精、耐酸、耐糖、耐SO2等耐性試驗，得到了發(fā)酵性能較強的酵母菌株Z03、Z13、Z34。經(jīng)過染色，鏡檢觀察其細(xì)胞形態(tài)和芽殖方式，確定為酵母菌，經(jīng)WL培養(yǎng)基培養(yǎng)后觀察，初步鑒定其屬于酵母屬的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。將這三株酵母與活性干酵母按照棗酒發(fā)酵工藝程序進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵出來的棗酒經(jīng)感官評定和理化檢測，最終篩選出適合棗酒發(fā)酵酵母菌株Z13和Z34，其酒精度為9.5%vol和10.8%vol。

長紅棗；釀酒酵母；篩選；鑒定；棗酒

紅棗（Zizyphus jujube）是鼠李科棗屬植物棗樹（Zizyphus jujubeMill）的果實，棗中含有豐富的糖類、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)和維生素等營養(yǎng)物質(zhì)［1］。研究分析表明，棗中含有16種氨基酸，其中包括8種人體必需氨基酸和幼兒體內(nèi)無法合成的組氨酸和精氨酸［1-2］。棗不僅具有較高的營養(yǎng)價值，而且具有良好的醫(yī)療功效，常被用作天然的興奮劑、緩和藥性和鎮(zhèn)咳劑，應(yīng)用于食品、食品添加劑和增香劑中［3］，也有研究表明，紅棗也是一種天然的抗氧化劑［4］。近年來，隨著人們消費水平的不斷提高，具有一定營養(yǎng)保健價值的各類低度果酒的需求量會逐漸增加，果酒同時也成為國家酒類發(fā)展的重點［5］。紅棗酒是酵母菌株利用紅棗中的糖進(jìn)行酒精發(fā)酵而得的一類保健型果酒，由于其風(fēng)味獨特，營養(yǎng)價值較高，深受消費者喜愛，市場前景巨大。

酵母是果酒發(fā)酵的原動力，酵母菌種的發(fā)酵性能直接影響所釀果酒的口感和風(fēng)味［6］。目前釀造紅棗酒的酵母多為延用葡萄酒酵母或果酒干酵母，缺乏專用的酵母菌株，導(dǎo)致棗酒產(chǎn)品同質(zhì)化嚴(yán)重，使得棗酒風(fēng)味不突出。張陳云等［7］以冬棗皮和冬棗汁篩選出了適合冬棗酒釀造的酵母菌株。牛希躍等［8］通過比較3種葡萄酒酵母的發(fā)酵性能發(fā)現(xiàn)了釀造駿棗果酒的最適酵母為SY葡萄酒酵母。同時關(guān)于研究篩選適合紅棗酒的專用酵母的報道較少，本研究從山東棗莊當(dāng)?shù)貤棃@土壤和紅棗發(fā)酵液中篩選出了多株野生酵母菌株，通過測試野生酵母菌株對紅棗汁的發(fā)酵能力和產(chǎn)酒精能力，并通過耐性試驗從中選育出符合當(dāng)?shù)丶t棗酒釀造的天然野生酵母菌株，以期望來改善當(dāng)?shù)丶t棗酒的品質(zhì)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1原料

紅棗：市售以及采摘于山東棗莊棗園；土壤：在棗園不同棵棗樹下采集；釀酒高活性干酵母：安琪酵母有限公司。

1.1.2培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast peptone dextrose，YPD）液體培養(yǎng)基：1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，于1×105Pa條件下滅菌15 min。

YPD固體培養(yǎng)基：YPD液體培養(yǎng)基中添加2%瓊脂粉。

麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基：葡萄糖1 g，氯化鉀1.8 g，酵母浸膏2.5 g，醋酸鈉8.2 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然，于1×105Pa條件下滅菌15 min。

WL培養(yǎng)基：酵母浸粉0.5%，胰蛋白胨0.5%，葡萄糖5%，瓊脂2%，磷酸二氫鉀0.055%，氯化鉀0.042 50%，氯化鈣0.012500%，氯化鐵0.000250%，硫酸鎂0.012500%，硫酸錳0.000 250%，溴甲酚綠0.002 200%，pH值為6.5，于1×105Pa條件下滅菌20 min。

耐酒精培養(yǎng)基：向YPD液體培養(yǎng)基中加入不同體積分?jǐn)?shù)（5%、10%、12%、14%、15%）的乙醇。

耐酸培養(yǎng)基、耐糖培養(yǎng)基、耐SO2培養(yǎng)基的配制方法類似于耐酒精培養(yǎng)基。

1.1.3試劑

蛋白胨、葡萄糖、氯化鉀、醋酸鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鐵、硫酸鎂、硫酸錳、溴甲基酚綠等化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純；酵母膏、酵母浸膏等均為市售生化試劑。

1.2儀器與設(shè)備

HCB-1800H水平層流潔凈工作臺：青島海爾特種電器有限公司；HNY-恒溫培養(yǎng)振蕩器：天津市歐諾儀器儀表有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；BCD-257F青島海爾冰箱：山東青島海爾公司；G80F23CN3L微波爐：格蘭仕微波爐電器有限公司；JT201N電子天平：上海精天電子儀器有限公司；SPL-250生化培養(yǎng)箱：天津市萊伯特瑞儀器設(shè)備有限公司；YE3K007064可調(diào)式移液器：上海雷勃分析儀器有限公司；BM2000雙目生物顯微鏡：上海議圓光學(xué)儀器有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1酵母菌株的初篩

以棗園土壤和紅棗發(fā)酵液為分離源，將采集的多棵棗樹的土壤分別稱取10 g，放入100 mL無菌水的三角瓶中，搖勻后在吸取上述培養(yǎng)液10mL，注入90mLYPD液體培養(yǎng)基中于30℃、120 r/min的搖床培養(yǎng)24 h，同時將培養(yǎng)液以梯度稀釋方法涂布于麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基平板上進(jìn)行酵母菌株的分離純化［9］。

將紅棗去核后加水打漿，放入30℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)酵5～7 d。取發(fā)酵好的紅棗發(fā)酵液涂布于YPD固體培養(yǎng)基培養(yǎng)酵母菌落，挑取具有典型酵母菌形態(tài)特征的菌落轉(zhuǎn)接與麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基上和YPD固體培養(yǎng)基中進(jìn)行分離純化，經(jīng)鏡檢合格后轉(zhuǎn)接于斜面保存待用。

1.3.2菌株產(chǎn)氣性能比較

將純化得到的野生酵母菌株活化后每個菌株取1 mL分別接種到裝有杜氏小管的YPD液體培養(yǎng)基中，于30℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)酵48 h，記錄產(chǎn)氣時間和產(chǎn)氣量。

1.3.3菌株產(chǎn)酒精能力比較

將上一級得到的產(chǎn)氣性能較好的酵母菌株活化后，每個菌株取10 mL接入200 mL棗汁發(fā)酵液中，于30℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)酵5～7 d，測定發(fā)酵液的酒精度，進(jìn)一步篩選產(chǎn)出酒精能力較強的酵母菌株。

1.3.4菌株耐性試驗

（1）耐酸試驗：將活化后的野生酵母菌株取1 mL接種到檸檬酸質(zhì)量濃度分別為10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L的耐酸培養(yǎng)基（內(nèi)裝杜氏管）中，于30℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)酵，觀察產(chǎn)氣情況。

（2）耐酒精試驗：將活化后的野生酵母菌株取1 mL接種到乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為5%、10%、12%、14%、15%的耐酒精培養(yǎng)基（內(nèi)裝杜氏管）中［10］，于30℃恒溫培養(yǎng)箱發(fā)酵，觀察產(chǎn)氣情況。

（3）耐糖試驗：將活化后的野生酵母菌株取1 mL接種到白砂糖含量分別為10%、20%、30%、40%的耐糖培養(yǎng)基（內(nèi)裝杜氏管）中［7］，于30℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)酵，觀察產(chǎn)氣情況。

（4）耐SO2性能試驗：將活化后的野生酵母菌株取1mL接種到相當(dāng)于二氧化硫質(zhì)量濃度分別為80mg/L、100mg/L、120mg/L、140mg/L、160mg/L的耐SO2培養(yǎng)基（內(nèi)裝杜氏管）中［11］，于30℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)酵，觀察產(chǎn)氣情況。

1.3.5釀酒酵母的鑒定

取一滴0.05%美蘭染色液于載玻片中央，用滅菌后的接種環(huán)取酵母懸液與染色液混勻，染色2～3 min后加蓋玻片。再用低、高倍鏡分別觀察其細(xì)胞形態(tài)、芽殖方式。此外可以根據(jù)酵母是否染上藍(lán)色區(qū)別細(xì)胞的死活。

不同的酵母在WL培養(yǎng)基上呈現(xiàn)不同的菌落形態(tài)，因此可以利用WL培養(yǎng)基對篩選的菌株作初步的鑒定［12］。

1.3.6棗酒加工工藝流程

操作要點：將紅棗洗干凈后去核，于60℃的熱水中浸泡1h，打漿后加入0.08%的果膠酶于50℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)酶解3 h，可以提高棗汁中可溶性固形物含量。然后按照不同的料液比調(diào)整棗汁發(fā)酵液，使發(fā)酵液含糖量為20%左右。用檸檬酸調(diào)pH值為3.5［12］，向棗液中加入80 mg/L的SO2［13］，同時添加0.05%的酵母粉來補充所需要的氮源［14］。待棗液冷卻至35℃左右，以106個/mL接種酵母菌［15］（菌株活化參考文獻(xiàn)［15］），混勻，進(jìn)行酒精發(fā)酵，于25℃條件發(fā)酵7 d。當(dāng)發(fā)酵液糖度不再降低時，酒精度不再升高時，主發(fā)酵結(jié)束，同時降低發(fā)酵溫度于4～6℃的恒溫箱中進(jìn)行后發(fā)酵［16］。

1.3.7棗酒理化檢測及感官評定

樣品的色澤在波長425 nm處的吸光度值來表示［17］，用吸光度值反映樣品的色度值；酒精度的測定采用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的比重計法［18］；可溶性固形物含量用手持折光儀測定［19］。感官評定按照GB/T 10220—2012《感官分析方法學(xué)總論》中的方法［20］。

2　結(jié)果與分析

2.1酵母菌的初篩

經(jīng)過YPD液體培養(yǎng)基的富集培養(yǎng)以及通過在YPD固體培養(yǎng)基和麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基上多次劃線分離純化，在土壤中分離得到了10株酵母菌株，在棗汁發(fā)酵液中得到了36株酵母菌株，一共得到了46株菌株，分別命名為Z01、Z02……Z46。

2.2菌株杜氏小管發(fā)酵產(chǎn)氣性能比較

對獲得的46株菌株進(jìn)行杜氏管發(fā)酵產(chǎn)氣試驗，以釀酒活性干酵母作為對照菌株，產(chǎn)氣量較快的17株菌株試驗結(jié)果見表1。

表1　篩選菌株發(fā)酵產(chǎn)氣試驗結(jié)果Table 1 Results of gas production tests of screened strains

由表1可知，17株菌株均在第8小時開始發(fā)酵產(chǎn)氣，并且都能在12 h內(nèi)產(chǎn)滿杜氏小管，這一試驗結(jié)果說明這17株菌株發(fā)酵產(chǎn)氣性能優(yōu)良，并且與對照菌株相比，部分菌株發(fā)酵產(chǎn)氣速度快于于對照菌株，故將以上菌株作為下一步產(chǎn)酒精能力測試的菌株。

2.3菌株的產(chǎn)酒精能力比較

通過檢測以上17株酵母菌株的發(fā)酵液的酒精度，得出產(chǎn)酒精度＞7%vol的酵母菌有5株，產(chǎn)酒精度5%vol～7%vol的酵母菌有10株，并且這15株酵母菌株發(fā)酵生產(chǎn)出的紅棗酒棗香味較濃郁，有典型的棗酒風(fēng)味，故將這15株酵母菌株作為下一步耐性篩選的備選菌株。而菌株Z12、Z14產(chǎn)酒精度＜5%vol，產(chǎn)酒精能力較弱，故不予考慮。

2.4菌株耐酸試驗

對上述獲得的15株菌株進(jìn)行耐酸試驗，以釀酒活性干酵母作為對照菌株，結(jié)果見表2。

表2　篩選菌株耐酸試驗結(jié)果Table 2 Results of acid resistance tests of screened strains

續(xù)表

續(xù)表

由表2可知，在檸檬酸質(zhì)量濃度為10 g/L時，所有的菌株均能在10 h內(nèi)使杜氏小管產(chǎn)滿氣體，當(dāng)檸檬酸質(zhì)量濃度增大至25 g/L時，可以看出Z15、Z17、Z18、Z23、Z24、Z30菌株發(fā)酵產(chǎn)氣能力較弱，故淘汰這5株菌株。同時Z03、Z07、Z09、Z13、Z21、Z26、Z33、Z34菌株均能在檸檬酸質(zhì)量濃度＞25 g/L時發(fā)酵產(chǎn)氣，并且耐酸性也優(yōu)于釀酒活性干酵母，因此將其作為下一步耐酒精的測試菌株。

2.5菌株耐酒精試驗

對上述獲得的8株菌株進(jìn)行耐酒精試驗，以釀酒活性干酵母作為對照菌株，結(jié)果見表3。

表3　篩選菌株耐酒精試驗結(jié)果Table 3 Results of alcohol resistance tests of screened strains

由表3可知，在酒精度為5%vol和10%vol時，以上菌株發(fā)酵產(chǎn)氣均能在24 h內(nèi)產(chǎn)滿杜氏小管，當(dāng)酒精度為12%vol和14%vol時，Z21菌株未能發(fā)酵產(chǎn)氣，故淘汰Z21菌株。在酒精度為14%vol時，Z03、Z07、Z13、Z26、Z33、Z34均能發(fā)酵產(chǎn)氣，且產(chǎn)氣較快，故作為下一步耐糖試驗的備選菌株。

2.6菌株耐糖試驗

對上述獲得的7株菌株進(jìn)行耐糖試驗，以釀酒活性干酵母作為對照菌株，結(jié)果見表4。

表4　篩選菌株耐糖試驗結(jié)果Table 4 Results of glucose resistance tests of screened strains

由表4可知，在糖含量為10%～30%時，以上酵母菌株均能發(fā)酵產(chǎn)氣，其中Z03、Z07、Z09、Z13、Z34酵母菌株與對照菌株相比均能在10h內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)氣產(chǎn)滿杜氏小管，在糖含量為40%時Z03、Z13、Z34等酵母菌株發(fā)酵產(chǎn)氣能力較好。但Z26、Z33菌株在糖含量逐漸增大時發(fā)酵產(chǎn)氣能力越來較弱，不合適用于棗酒發(fā)酵生產(chǎn)，故淘汰這兩株酵母菌株。

2.7菌株耐SO2試驗

對上述獲得的5株菌株進(jìn)行耐SO2試驗，以釀酒活性干酵母作為對照菌株，結(jié)果見表5。

表5　篩選菌株耐SO2試驗結(jié)果Table 5 Results of SO2resistance tests of screened strains

由表5可知，Z07、Z09酵母菌株在二氧化硫質(zhì)量濃度為140 mg/L和160 mg/L時產(chǎn)氣較慢，且不能產(chǎn)滿杜氏小管，故淘汰這兩株菌株。而Z03、Z13、Z34酵母菌株在80 mg/L和160 mg/L之間耐受二氧化硫性能較好，故保留這三株酵母菌株作為棗酒發(fā)酵生產(chǎn)的菌株，并對其進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。

2.8菌株的細(xì)胞及菌落形態(tài)

Z03、Z13、Z34菌株的細(xì)胞及菌落形態(tài)觀察結(jié)果分別見圖1和圖2。

由圖1可知，菌株Z03的細(xì)胞形態(tài)大部分為球形，部分為橢圓形，大部分酵母細(xì)胞以單端出芽為主，菌株Z13和菌株Z34細(xì)胞形態(tài)大部分為球形，也以單端出芽的方式繁殖。同時3株酵母菌的活細(xì)胞較多，說明菌株細(xì)胞活力較強。

由圖2可知，菌株Z03、Z13、Z34在WL培養(yǎng)基上菌落形態(tài)特征四周為奶淮色，中間為綠色，球形突起，表面光滑，不透明，符合釀酒酵母的菌落形態(tài)特征，所以Z03、Z13、Z34初步鑒定為釀酒酵母。

圖1　菌株Z03（A），Z13（B）及Z34（C）的細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Cell morphology of strain Z03（A），Z13（B）and Z34（C）

圖2　菌株Z03（A），Z13（B）和Z34（C）的菌落特征Fig.2 Colony characteristics of strain Z03（A），Z13（B）and Z34（C）

2.9棗酒發(fā)酵質(zhì)量評定

以篩選出的菌株Z03、Z13、Z34研制棗酒，以釀酒活性干酵母作為對照，其感官評定及理化檢測結(jié)果分別見表6及表7。

表6　棗酒感官評定結(jié)果Table 6 Sensory evaluation results of jujube wine

表7　棗酒理化檢測指標(biāo)Table 7 Physical and chemical indexes of jujube wine

由表6和表7可知，Z03菌株發(fā)酵出來的棗酒稍渾濁，且棗香味較淡，不適合作為棗酒生產(chǎn)用的菌株。Z13和Z34的菌株發(fā)酵生產(chǎn)的棗酒風(fēng)味和口感較符合人們需求，并且這兩株菌株發(fā)酵生產(chǎn)的棗酒的酒精度也符合低度酒的要求，因此可以確定菌株Z13和Z34是適合生產(chǎn)棗酒的優(yōu)良菌株。

3　結(jié)論

本研究通過對棗樹土壤和紅棗發(fā)酵液中的酵母菌株進(jìn)行分離篩選和性能測試，得到了兩株具有高性能的酵母菌株，應(yīng)用這兩株野生酵母菌株發(fā)酵生產(chǎn)的棗酒的酒精度分別9.5%vol和10.8%vol，并且棗酒的口感、香氣、和典型性特征方面均達(dá)到果酒生產(chǎn)要求的國家標(biāo)準(zhǔn)，各項理化指標(biāo)也優(yōu)于釀酒活性干酵母。本研究對這兩株野生酵母菌株只是進(jìn)行了初步的鑒定，若應(yīng)用于大規(guī)模的生產(chǎn)實踐，還需要對菌株深入進(jìn)行分子生物學(xué)方面的鑒定。

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Screening and fermentation properties of yeast for jujube wine

WANG Qingke1，2，SUN Zhongguan2，3*，CHEN Qing2
（1.College of Food Science，Hainan University，Haikou 570228，China；2.College of Life Science，Zaozhuang University，Zaozhuang 277160，China；3.College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

Superior yeasts for jujube wine was obtained from the jujube fermentation broth and jujube orchard soil by enrichment culture and repeated plate streaking.Comparing with gas production and alcohol production performance of yeast and alcohol resistance，acid resistance，sugar resistance，SO2resistance and other performance tests，the yeast（Z03，Z13，Z34）which had strong fermentation properties were obtained.After staining，cell morphology and budding way，it was determined asSaccharomycetessp.Then it was identified asSaccharomyces cerevisiaeafter WL cultivate. According to the jujube wine fermentation process，using the three strains of yeast and active dry yeast，jujube wine was fermented.By sensory evaluation and physicochemical examination，the yeast which was suited for jujube wine was determined as yeast Z13 and Z34，and the alcohol content of jujube wine was 9.5%vol and 10.8%vol，respectively.

jujube；Saccharomyces cerevisiae；screening；identification；jujube wine

Q939

A

0254-5071（2015）11-0103-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.11.024

2015-09-21

校級博士科研啟動基金（NO.2014BS14）

王慶科（1990-），男，碩士研究生，研究方向為應(yīng)用微生物技術(shù)。

孫中貫（1984-），男，講師，博士，研究方向為現(xiàn)代釀造技術(shù)。