高產(chǎn)林可霉素鏈霉菌的篩選及發(fā)酵條件的優(yōu)化

高產(chǎn)林可霉素鏈霉菌的篩選及發(fā)酵條件的優(yōu)化

鄧加聰1，施瀟蕊1，曾德樣1，張文森2，徐慧詮2，唐慧華2，鄭虹1*
（1.福建師范大學(xué)福清分校海洋與生化工程學(xué)院，福建福清350300；2.福建師范大學(xué)福清分校朗姆多果酒研究所，福建福清350300）

采用平板劃線(xiàn)，搖瓶復(fù)篩等方法從福清近海海域泥土中分離篩選到一株林可霉素產(chǎn)率較高的鏈霉菌株6204；采用單因素試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，從葡萄糖添加量、磷酸二氫鉀條件兩及金屬離子對(duì)菌株6204產(chǎn)林可霉素影響，并對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，最適的發(fā)酵條件為葡萄糖添加量10.0%，鎂離子質(zhì)量濃度0.10 g/L，磷酸二氫鉀添加量0.020%，在此優(yōu)化發(fā)酵條件下，菌株6204產(chǎn)林可霉素的含量可達(dá)3 907.738 μg/mL，與優(yōu)化前相比較，林可霉素的含量提高了1 823.082 μg/mL。

鏈霉菌；選育；林可霉素；發(fā)酵條件；優(yōu)化

林可霉素是林肯鏈霉菌（Streptomyces lincolnensis）發(fā)酵產(chǎn)生的一類(lèi)抗生素，對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）等革蘭氏陽(yáng)性菌具有較強(qiáng)的拮抗作用。在醫(yī)藥方面，主要用于呼吸道、皮膚及軟組織感染等疾病的治療，由于其療效穩(wěn)定、不良反應(yīng)小、使用安全，作為青霉素的替代藥逐漸被應(yīng)用于臨床中［1］。

目前對(duì)于產(chǎn)林可鏈霉菌的研究，國(guó)內(nèi)研究主要集中于菌種選育［2-4］、培養(yǎng)基優(yōu)化［5-6］，或采用基因工程的方法對(duì)產(chǎn)林可菌株進(jìn)行工程菌的改造［7-10］，以期提高菌株產(chǎn)林可的產(chǎn)量。在菌種選育方面，孟娜等［2］采用硫酸二乙酯和紫外復(fù)合誘變方法，得到一株遺傳性能良好的突變株，其林可霉素效價(jià)可達(dá)到4 082 U/mL，比出發(fā)菌株提高了107%；李靜仁［3］以林可霉素產(chǎn)生菌L92為出發(fā)菌株，采用氯化鋅、紫外線(xiàn)和硫酸二乙酯三重誘變，獲得高產(chǎn)菌株L-96，其搖瓶效價(jià)較出發(fā)菌株提高了50.2%。在培養(yǎng)基優(yōu)化方面，薛正蓮等［5］采用響應(yīng)面法對(duì)鏈霉菌SL-98-2-8的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳的發(fā)酵條件為淀粉2.1%，玉米漿0.33%，葡萄糖8.5%，豆餅粉2.53%，磷酸二氫鉀0.022%，在此條件下，林可霉素的含量為3 700 μg/mL，比優(yōu)化前提高了12%；鐘益清［6］通過(guò)罐上工藝改進(jìn)對(duì)林可霉素發(fā)酵進(jìn)行研究，使林可霉素的生物效價(jià)從無(wú)補(bǔ)料的3 851 μg/mL提高到7 421 μg/mL。陳林［7］以鏈霉菌N9為出發(fā)菌，增加林可霉素的甲基化基因orf25、orf12，調(diào)控基因orf22或整個(gè)生物合成基因簇IE8拷貝數(shù)的遺傳改造，林可霉素A產(chǎn)量分別提高5.52%、13.75%、6.24%、17.3%。薛正蓮等［8］用紫外線(xiàn)和激光對(duì)林肯鏈霉菌原生質(zhì)體進(jìn)行復(fù)合誘變，得到一株林可霉素高產(chǎn)菌株SL98-2-8-116，其搖瓶效價(jià)可達(dá)3 629 μg/mL，較出發(fā)菌株提高了18.3%。國(guó)外學(xué)者研究主要在于林可霉素的合成途徑，KAMENIK Z等［11］用高效液相色譜對(duì)林可霉素發(fā)酵過(guò)程的中間體進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)而推知跟林可霉素合成有關(guān)的關(guān)鍵步驟和中間體，對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)，提高林可霉素的產(chǎn)量。

本研究從福清近海海域泥土中，分離篩選出一株林可霉素產(chǎn)量較高的菌株鏈霉菌6204，并采用單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化研究，得到該菌株產(chǎn)林可霉素的最適發(fā)酵條件，提高鏈霉菌6204林可霉素的產(chǎn)量，為林可霉素的后期純化和研究應(yīng)用提供一定的基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1實(shí)驗(yàn)菌株

鏈霉菌（Streptomyces）：分離于福清近海海域泥土。

1.1.2化學(xué)試劑

玉米漿粉、黃豆餅粉：市售；林可霉素注射液（2 mL/0.6 g）：購(gòu)自福清永惠醫(yī)藥超市；可溶性淀粉、葡萄糖、硫酸氫二鉀、硝酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉等試劑（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司。

1.1.3培養(yǎng)基

平板培養(yǎng)基/斜面培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g/L，KNO31 g/L，K2HPO4·3H2O 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，NaCl 0.5g/L，黃豆餅粉5g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O0.01g/L，瓊脂粉18g/L，pH 7.2～7.3，121℃滅菌15 min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖15 g/L，可溶性淀粉20 g/L，玉米漿粉16 g/L，黃豆餅粉15 g/L，（NH4）2SO41.6 g/L，pH 7.0，121℃滅菌15 min。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖100 g/L，玉米漿粉1 g/L，黃豆餅粉26 g/L，（NH4）2SO48 g/L，KH2PO40.2 g/L，NaCl 5 g/L，NaNO38 g/L，CaCO38 g/L，pH 7.0，121℃滅菌15 min。

1.2儀器與設(shè)備

NRY2102C恒溫振蕩器：上海南榮實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；LDZX-50BI立式自動(dòng)電熱壓力蒸氣滅菌器：上海申安醫(yī)療器械有限公司；SPX-150B-2生化培養(yǎng)箱：南京艾賽特科技有限公司；SW-CJ-IFD超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；THZ-C臺(tái)式恒溫振蕩器：太倉(cāng)市華美生化儀器廠(chǎng)；DHG-9076A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；H1850R高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1鏈霉菌牛奶凍干管的稀釋涂布

稱(chēng)取1 g近海海泥，加入100 mL無(wú)菌蒸餾水，靜置30 min，充分混勻后，用無(wú)菌蒸餾水稀釋至梯度為10-2、10-3、10-4，充分混勻后，取0.2 mL稀釋液涂布于平板培養(yǎng)基，30℃倒置培養(yǎng)15～20 d，挑取顏色白、菌落大的單菌落，接種于試管斜面，培養(yǎng)后，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2林可霉素高產(chǎn)菌株的篩選

將挑取到的單菌落接種于試管斜面活化；接種于裝有100 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)72 h；按10%接種量將種子液接種于裝液量為100 mL/250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)96 h，發(fā)酵液4℃、8 000 r/min離心5 min，測(cè)定上清液中林可霉素的含量并計(jì)算其相對(duì)效價(jià)。

1.3.3鏈霉菌6204的活化及種子液的制備

4℃保存的鏈霉菌6204接種于試管斜面活化；接種于種子培養(yǎng)基，30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)72 h。

1.3.4單因素試驗(yàn)

（1）葡萄糖添加量對(duì)鏈霉菌6204產(chǎn)林可霉素的影響

改變基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖的含量，葡萄糖添加量分別為2.5%、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%，30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)96h，測(cè)定發(fā)酵液中林可霉素的含量并計(jì)算其相對(duì)效價(jià)。

（2）金屬離子對(duì)鏈霉菌6204產(chǎn)林可霉素的影響

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加0.20g/L的ZnSO4、MgSO4、FeSO4、Fe2（SO4）3、MnSO4、CuSO4，30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)96 h，測(cè)定發(fā)酵液中林可霉素的含量并計(jì)算其相對(duì)效價(jià)。

（3）磷酸二氫鉀添加量對(duì)鏈霉菌6204產(chǎn)林可霉素的影響

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同含量（0.005%、0.010%、0.015%、0.020%、0.025%、0.030%）的磷酸二氫鉀，30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)96 h，測(cè)定發(fā)酵液中林可霉素的含量并計(jì)算其相對(duì)效價(jià)。

1.3.5發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以林可霉素含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用3因素3水平設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，其因素與水平見(jiàn)表1。

表1　發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

1.3.6林可霉素含量的測(cè)定

采用紫外分光光度法［12-13］測(cè)定溶液中林可霉素的含量。林可霉素的含量及相對(duì)效價(jià)計(jì)算公式如下：

2　結(jié)果與分析

2.1牛奶凍干管的稀釋涂布

將鏈霉菌牛奶凍干管進(jìn)行稀釋涂布，從分離平板上篩選出17株菌落大且顏色白的單菌落，接種于試管斜面，菌株編號(hào)為：6101、6102、6201、6202、6203、6204、6205、6301、6302、6303、6304、6305、6401、6402、6403、6404、6405。

2.2高產(chǎn)林可霉素鏈霉菌菌株的篩選

將挑取到的單菌落接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)96 h，測(cè)定發(fā)酵液的林可霉素含量并計(jì)算其相對(duì)效價(jià)。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1　不同菌株產(chǎn)林可霉素的影響Fig.1 Effect of different strains on lincomycin production

由圖1可知，不同菌株產(chǎn)林可霉素效價(jià)各不相同，其中林可霉素含量最高的菌株是鏈霉菌6204，該菌株發(fā)酵液中林可霉素的含量達(dá)2 773.07 μg/mL，相對(duì)效價(jià)為100%。因此，選用鏈霉菌6204進(jìn)行下列的發(fā)酵試驗(yàn)。

2.3單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1葡萄糖添加量對(duì)鏈霉菌6204產(chǎn)林可霉素的影響

改變基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖的添加量，30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)96 h，測(cè)定發(fā)酵液中林可霉素的含量并計(jì)算其相對(duì)效價(jià)。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2　葡萄糖添加量對(duì)菌株產(chǎn)林可霉素的影響Fig.2 Effect of glucose addition on lincomycin production

由圖2可知，菌株林可霉素的含量隨著葡萄糖添加量的增加呈先增后降的趨勢(shì)，當(dāng)葡萄糖添加量為7.5%時(shí)，發(fā)酵液中林可霉素的含量達(dá)到最大，為2 481.48 μg/mL，相對(duì)效價(jià)119.04%。葡萄糖的添加量過(guò)低會(huì)影響菌體的生長(zhǎng)，而過(guò)高又會(huì)出現(xiàn)葡萄糖效應(yīng)，進(jìn)而影響林可霉素的生產(chǎn)合成。因此，基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖的最適添加量為7.5%。

2.3.2金屬離子對(duì)鏈霉菌6204產(chǎn)林可霉素的影響

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入0.20 g/L的ZnSO4、MgSO4、FeSO4、Fe2（SO4）3、MnSO4、CuSO4，30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)96 h，測(cè)定發(fā)酵液中林可霉素的含量并計(jì)算其相對(duì)效價(jià)。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3　不同的金屬離子對(duì)菌株產(chǎn)林可霉素的影響Fig.3 Effect of different metal ion on lincomycin production

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［14-15］，發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一定量的金屬離子，對(duì)菌株產(chǎn)林可霉素具有一定的影響。由圖3可知，金屬離子對(duì)菌株產(chǎn)林可霉素的影響順序如下：Mg2+＞Cu2+＞Fe3+＞Zn2+＞Fe2+＞Mn2+，不添加任何金屬離子的對(duì)照（CK）組對(duì)比，添加有Mg2+、Fe3+、Cu2+的發(fā)酵培養(yǎng)基中，林可霉素的相對(duì)效價(jià)均＞100%，其中添加有Mg2+的發(fā)酵培養(yǎng)基中，菌株6204產(chǎn)林可霉素的量可達(dá)2 471.56 μg/mL，相對(duì)效價(jià)為118.56%。與CK相比，林可霉素的產(chǎn)量提高了18.56%。因此，基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中最適添加0.20 g/L金屬離子Mg2+。

2.3.3磷酸二氫鉀添加量對(duì)鏈霉菌6204產(chǎn)林可霉素的影響

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入不同含量的磷酸二氫鉀，30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)96 h，測(cè)定發(fā)酵液中林可霉素的含量并計(jì)算其相對(duì)效價(jià)。結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4　磷酸二氫鉀含量對(duì)菌株產(chǎn)林可霉素的影響Fig.4 Effect of KH2PO4addition on lincomycin production

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［17］，一定含量的磷酸鹽會(huì)影響菌株林可霉素的合成。由圖4可知，林可霉素的含量隨著磷酸二氫鉀添加量的升高呈先增后降的趨勢(shì)，當(dāng)磷酸二氫鉀的添加量為0.01%時(shí)，發(fā)酵液中林可霉素的含量達(dá)到最大值，為2 742.725 μg/mL，相對(duì)效價(jià)達(dá)到131.57%?？赡苁怯捎谠诟邼舛攘姿猁}的環(huán)境下，有利于微生物蛋白質(zhì)的合成，進(jìn)而延長(zhǎng)了菌株的生長(zhǎng)期，但由于后期營(yíng)養(yǎng)不足，使得林可霉素的合成受到影響。因此，基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中磷酸二氫鉀的最適添加量為0.01%。

2.4發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以林可霉素含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)，結(jié)果與分析見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表2　發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

表3　正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，3個(gè)因素對(duì)林可霉素含量的影響大小分別為磷酸二氫鉀添加量＞葡萄糖添加量＞鎂離子質(zhì)量濃度。菌株6204產(chǎn)林可霉素的最佳配比組合為A3B1C3，即葡萄糖添加量10.0%，鎂離子質(zhì)量濃度0.10 g/L，磷酸二氫鉀添加量0.020%，在此最佳發(fā)酵條件下，菌株6204產(chǎn)林可霉素的量可達(dá)3 907.738 μg/mL。

由表3可知，磷酸二氫鉀添加量對(duì)菌株6204產(chǎn)林可霉素有著極顯著（P＜0.01）影響，葡萄糖添加量對(duì)菌株6204產(chǎn)林可霉素有著顯著（P＜0.05）影響，而鎂離子質(zhì)量濃度對(duì)菌株6204產(chǎn)林可霉素影響不顯著（P＞0.05）。

3　結(jié)論

從福清海域泥土中分離篩選到一株產(chǎn)林可霉素較高的菌株6204，根據(jù)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，研究葡萄糖添加量、磷酸二氫鉀添加量及金屬離子質(zhì)量濃度對(duì)菌株6204產(chǎn)林可霉素的影響，并對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得到菌株6204產(chǎn)林可霉素的最佳發(fā)酵條件，即葡萄糖添加量10.0%，鎂離子質(zhì)量濃度0.10 g/L，磷酸二氫鉀含量0.020%，在此最佳發(fā)酵條件下，林可霉素的含量可達(dá)3 907.738 μg/mL。

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Screening ofStreptomycessp.with high-yield lincomycin and its fermentation condition optimization

DENG Jiacong1，SHI Xiaorui1，ZENG Deyang1，ZHANG Wensen2，XU Huiquan2，TANG Huihua2，ZHENG Hong1*
（1.School of Ocean and Biochemical Engineering，F(xiàn)uqing Branch of Fujian Normal University，F(xiàn)uqing 350300，China；2.Reseach Institute of Rum Wine，F(xiàn)uqing Branch of Fujian Normal University，F(xiàn)uqing 350300，China）

Abastract：Strain 6204 with high-yield lincomycin was isolated and screened from soil of coastal waters by plate streaking and shaking flask.And the fermentation conditions of strain 6204 were studied and optimized by single factor and orthogonal experiment，using glucose addition，potassium dihydrogen phosphate concentration and metal ions as evaluation factors.The results showed that the optimum fermentation conditions were glucose 10.0%，magnesium ion 0.10 g/L，potassium dihydrogen phosphate 0.020%.Under the conditions，the lincomycin concentration produced by strain 6204 could up to 3 907.738 μg/ml，which improved 1 823.082 μg/ml than that before optimization.

Streptomycessp.；screening；lincomycin；fermentation conditions；optimization

TQ925

A

0254-5071（2015）11-0099-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.11.023

2015-10-15

福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2015J01132）；福建省教育廳中青年教師項(xiàng)目（JA15569）；福建省中青年教師教育科研項(xiàng)目（JA11285）；福建省科技計(jì)劃引導(dǎo)性項(xiàng)目（2015N0004）；福建省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)基金項(xiàng)目（20422337）

鄧加聰（1981-），男，副教授，博士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锞旰Y選及發(fā)酵。

鄭虹（1981-），女，實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向?yàn)槲⑸锞旰Y選及發(fā)酵。