馬奶酒發(fā)酵劑用菌種的篩選研究

GAN-OD NAMNANSUREN，徐　敏，霍貴成*（東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030）

馬奶酒發(fā)酵劑用菌種的篩選研究

GAN-OD NAMNANSUREN，徐敏，霍貴成*
（東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030）

采用乳酸菌聯(lián)合酵母的發(fā)酵方法，制備一種新型馬奶酒并為工業(yè)化生產(chǎn)馬奶酒提供新型發(fā)酵劑。通過考察8%酵母菌（F1）、6%酵母菌聯(lián)合2%嗜酸乳桿菌（F2）、6%酵母菌聯(lián)合2%瑞士乳桿菌（F3）、6%酵母菌聯(lián)合1%嗜酸乳桿菌及1%瑞士乳桿菌（F4）以上四種發(fā)酵菌種配比，以酒精度、酸度、感官品質為考察指標，開發(fā)適合馬奶酒工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)良發(fā)酵劑。結果表明，當采用6%酵母菌聯(lián)合1%嗜酸乳桿菌及1%瑞士乳桿菌（F4）的發(fā)酵方式時，馬奶酒酒精度為1.39%vol，馬奶酒酸度為90°T，感官評分為91分，且馬奶酒香醇可口、組織均勻，適于大眾飲用；因此6%酵母菌聯(lián)合1%嗜酸乳桿菌及1%瑞士乳桿菌，可作為工業(yè)化生產(chǎn)馬奶酒所用的發(fā)酵劑。

乳酸菌；酵母；發(fā)酵劑；馬奶酒

馬奶酒是用鮮馬奶經(jīng)過發(fā)酵變酸釀制而成的飲料；其最早始于秦漢時代，歷史悠久，味道酸辣，被稱為元玉漿，是“蒙古八珍”之一［1］。馬奶酒性溫，有驅寒、舒筋、活血、健胃等功效［2］。傳統(tǒng)的馬奶酒是在鮮馬奶中加入天然發(fā)酵劑，經(jīng)自然發(fā)酵形成，呈乳白色的、質地均勻的飲料［3］。馬奶酒作為一種中國特色飲料，逐漸受到大眾的喜愛；隨著人民生活節(jié)奏的不斷加快，市場迫切需要將這種傳統(tǒng)方便飲料工業(yè)化生產(chǎn)，其中發(fā)酵劑在馬奶酒的加工過程中起著至關重要的作用［4］。然而，傳統(tǒng)天然發(fā)酵劑很大程度上影響馬奶酒的工業(yè)化生產(chǎn)；目前國外對于新發(fā)酵劑的開發(fā)很多依靠基因工程，但是其應用受到消費者和歐盟的阻礙［5］。因此，傳統(tǒng)的篩選和鑒定方法對于馬奶酒發(fā)酵劑的開發(fā)仍起著一定程度的作用［6］。根據(jù)文獻，酵母菌聯(lián)合乳酸菌制備馬奶酒時，且酵母菌含量為2/3時，馬奶酒品質較好［7-10］，因此該實驗考察酵母菌（F1）、酵母菌聯(lián)合嗜酸乳桿菌（F2）、酵母菌聯(lián)合瑞士乳桿菌（F3）、酵母菌聯(lián)合兩種乳桿菌（F4）四種發(fā)酵劑，以酒精度、酸度、感官品質為評價指標，開發(fā)適合馬奶酒工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)良發(fā)酵劑。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種及來源

本研究選擇接種比例為：F1（酵母菌8%）；F2（酵母菌6%∶嗜酸乳桿菌2%）；F3（酵母菌6%∶瑞士乳桿菌2%）；F4（酵母菌6%∶嗜酸乳桿菌1%∶瑞士乳桿菌1%）。

酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）：市售；嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）：乳品科學教育部重點實驗室。

1.1.2培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨5 g、牛肉膏5 g、酵母粉5 g、胰蛋白胨10 g、葡萄糖20 g、吐溫-80 1.1 g、磷酸氫二鉀2 g、檸檬酸氫二氨2 g、乙酸鈉5 g、硫酸鎂0.58 g、硫酸錳0.25 g，蒸餾水950 mL。固體培養(yǎng)基添加1.6%的瓊脂粉，121℃高壓滅菌15 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）：酵母膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL。

1.1.3主要試劑

蛋白胨、牛肉膏：北京奧博星生物技術有限公司；胰蛋白胨、酵母粉：英國OXOID公司；葡萄糖：天津光復科技發(fā)展有限公司；磷酸氫二鉀：天津光復科技發(fā)展有限公司；硫酸錳、檸檬酸氫二胺、乙酸鈉（均為分析純）：天津東麗區(qū)天大化學儀器廠；Tween-80：天津光復精細化工研究所；營養(yǎng)瓊脂：天津光復科技發(fā)展有限公司。

1.2儀器與設備

DU800紫外可見分光光度計：美國BECKMAN公司；GL-21M離心機：上海市離心機械研究所；DHP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；PL2002電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HVE-50全自動高壓滅菌鍋：日本HIRAYAMA公司；XK96-A快速混勻器：姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1新型馬奶酒生產(chǎn)工藝流程

1.3.2操作要點

（1）馬奶的驗收：產(chǎn)自健康奶牛乳房，細菌數(shù)低、體細胞數(shù)低、乳成分正常、無抗生素殘留、無沉淀物和異味、不摻水的自然馬乳；驗收后4℃保存?zhèn)溆茫?1］。

（2）菌種的活化：將從-20℃冰箱中取出乳酸菌及酵母菌粉，以2%的接種量分別接種到5mL的液體培養(yǎng)基中進行活化，37℃培養(yǎng)14 h后，用混勻器將培養(yǎng)液充分混勻，用接種環(huán)在培養(yǎng)液中輕沾少許液體，在固體培養(yǎng)基上進行三區(qū)劃線，然后進行培養(yǎng)［12］。

（3）乳酸菌發(fā)酵液的制備：將-20℃冰箱保存的嗜酸乳桿菌、瑞士乳桿菌取出，分別接種于MRS液體培養(yǎng)基內(nèi)，37℃培養(yǎng)24 h，傳代2～3次后，取穩(wěn)定期初的嗜酸乳桿菌、瑞士乳桿菌菌液，于4℃儲存，備用。

（4）酵母發(fā)酵液的制備：無菌環(huán)境下將酵母菌接種于YPD培養(yǎng)基中活化，置于28℃培養(yǎng)48 h，于4℃儲存，備用。

考慮到乳酸菌及酵母菌的最適生長溫度及其生長曲線，馬奶酒的發(fā)酵溫度定為37～40℃，發(fā)酵時間定為12～14h。

1.3.3菌體及菌落形態(tài)的觀察及生長曲線測定

菌株在MRS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后，選取一個較大菌落，挑取其中的1/2菌落，進行革蘭氏染色和淮鏡觀察，并照相；酵母菌原理同上。

用接種環(huán)挑取另外的1/2菌落，接種于MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)約14 h，以2%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)約14 h時，再以2%接種量分別接種于54個盛有MRS液體培養(yǎng)基的試管中，并在54個試管分別標上0、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h、22 h、24 h、26 h、28 h、30 h（共18個時間段，每個時間段3個平行），37℃恒溫培養(yǎng)，從起點開始計時當，到達上述時間時，將對應的3支試管取出放入4℃冰箱中，待18個時間段全部取出后一起用紫外分光光度計測定吸光度值；采用梯度平板稀釋法測定0～30 h內(nèi)的活菌數(shù)，重復3次，作生長曲線。酵母菌原理同上。

1.3.4分析測定方法

酒精度的測定用酒精計進行測定；酸度測定用酸堿滴定法進行測定［2-4］。

1.3.5馬奶酒感官的評定

采用綜合評分法，在有明亮自然光、溫度為25℃的房間內(nèi)進行馬奶酒感官評定。根據(jù)口感（35分），香味（35分），組織狀態(tài)（20分），色澤（10分）進行綜合評分，滿分100分［14-15］。評定方法：隨機選取50名性別不同、年齡各異、語言表達能力強的人員進行感官評價，排除偏差，試驗結果取平均值，然后進行分析，馬奶酒的感官評分標準見表1。

表1　馬奶酒的感官評分標準Table1 Sensory evaluation standards of kumiss

2　結果與分析

2.1菌株生長曲線

分別將三株菌接種于液體培養(yǎng)基中，以培養(yǎng)時間為橫坐標，OD600nm值為縱坐標，繪制3株菌的生長曲線，結果見圖1。

由圖1可知，瑞士乳桿菌在培養(yǎng)4 h時開始迅速生長，進入生長的對數(shù)期，在16 h后進入生長的相對穩(wěn)定期，菌體生長緩慢，瑞士乳桿菌在28 h時進入衰退期；嗜酸乳桿菌在3 h時開始迅速生長，進入生長的對數(shù)期，14 h進入穩(wěn)定期，未檢測出衰退期；酵母菌在培養(yǎng)2 h時開始迅速生長，進入生長的對數(shù)期，在14 h后進入生長的相對穩(wěn)定期，菌體生長緩慢，酵母菌在28 h時進入衰退期。因此，本研究發(fā)酵制備馬奶酒采用三株菌的發(fā)酵時間分別為：瑞士乳桿菌為16 h，嗜酸乳桿菌為14 h，酵母菌為14 h。

圖1三株菌的生長曲線
Fig. 1 Growth curves of three strains

2.2不同菌株發(fā)酵過程對馬奶酒酒精度的影響

在馬奶酒生產(chǎn)中，除了酵母菌及根據(jù)需要所接種的微生物外，還有其他多種微生物的作用，如作為糖化曲的乳酸菌菌種。其中，酵母菌的主要作用是參與酒精發(fā)酵。不同菌種發(fā)酵對馬奶酒酒精度的影響結果見圖2。由圖2可知，當酵母菌所占的比例較少時，馬奶酒的酒精含量較低，酒精積累量隨添加酵母菌比例的增大而升高，當酵母菌接種量為8%時，馬奶酒的酒精含量最高為1.69%vol，說明大量的糖與酸都轉化成了酒精；然而，6%酵母菌聯(lián)合2%嗜酸乳桿菌（F2）與6%酵母菌聯(lián)合2%瑞士乳桿菌（F3）和6%酵母菌聯(lián)合1%嗜酸乳桿菌及1%瑞士乳桿菌（F4）所得的產(chǎn)品酒精度差異顯著（P＜0.05）。

圖2　不同發(fā)酵方式對馬奶酒酒精度的影響Fig.2 Effect of different fermentation methods on alcohol content of kumiss

2.3不同菌株發(fā)酵過程對馬奶酒酸度的影響

酵母菌進行酒精發(fā)酵后，乳酸菌（如植物乳桿菌、瑞士乳桿菌）可以進一步的以L-蘋果酸為底物通過蘋果酸-乳酸酶將其轉化為L-乳酸；馬奶酒的酸性物質主要由乳酸菌產(chǎn)生，乳酸菌除產(chǎn)生乳酸外，還產(chǎn)生少量的乙酸、甲酸、丙酸等酸性物質。不同菌種發(fā)酵對馬奶酒酸度的影響結果見圖3。由圖3可以看出，當接種菌種全部為酵母菌時，馬奶酒的酸度最低，隨著乳酸菌的接入，馬奶酒的酸度增大，可能是由于乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生了乳酸，降低了馬奶酒的酸度。當接種6%酵母菌聯(lián)合1%嗜酸乳桿菌及1%瑞士乳桿菌（F4）時，馬奶酒的酸度達到最大，達到90°T，接種6%酵母菌聯(lián)合2%嗜酸乳桿菌（F2）、與6%酵母菌聯(lián)合2%瑞士乳桿菌（F3）兩種發(fā)酵方式所得的馬奶酒酸度次之，且無顯著差異。

圖3　不同發(fā)酵方式對馬奶酒酸度的影響Fig.3 Effect of different fermentation methods on the acidity of kumiss

2.4不同菌株發(fā)酵過程對馬奶酒品質的影響

圖4　不同發(fā)酵方式對馬奶酒感官評分的影響Fig.4 Effect of different fermentation methods on the sensory evaluation score of kumiss

由于乳酸菌的代謝會改變酒中醛類、酯類、氨基酸、維生素等微量成分的含量及呈香物質的含量。并且，乳酸菌還會產(chǎn)生一些微量的醇、醛、酯、酚等呈香物質。發(fā)酵過程的主發(fā)酵期主要是高溫乳酸菌生長、代謝，后發(fā)酵期主要是低溫乳酸菌的作用，這時部分高溫乳酸菌死亡、自溶，給酵母菌和低溫乳酸菌提供營養(yǎng)，也就是乳酸菌與酵母菌相互作用，推動馬奶酒發(fā)酵，增強馬奶酒口味的豐滿性和濃厚感，形成馬奶酒優(yōu)良的品質。不同菌種發(fā)酵對馬奶酒酸度的影響結果見圖4，由圖4可以看出，酵母菌接種量為8%時，馬奶酒的感官評分較低，顯著差別于接種6%酵母菌聯(lián)合2%嗜酸乳桿菌（F2）、6%酵母菌聯(lián)合2%瑞士乳桿菌（F3）、6%酵母菌聯(lián)合1%嗜酸乳桿菌及1%瑞士乳桿菌（F4），其中，F(xiàn)2、F3、F4三種馬奶酒的發(fā)酵方式之間感官評分差異不顯著，以6%酵母菌聯(lián)合1%嗜酸乳桿菌及1%瑞士乳桿菌（F4）的發(fā)酵方式制出的馬奶酒感官評分最高，達91分。

3　結論

在馬奶酒的生產(chǎn)中，發(fā)酵劑的主要作用是產(chǎn)酸、產(chǎn)酒精，以及改善馬奶酒的質構及促進風味物質形成，因此選擇合適的發(fā)酵劑對馬奶酒的工業(yè)化生產(chǎn)尤為重要。通過對菌株一定程度的活化、培養(yǎng)，得到最佳狀態(tài)的酵母菌、嗜酸乳桿菌及瑞士乳桿菌，然后綜合不同指標，如產(chǎn)酒精度、產(chǎn)酸及馬奶酒感官品質，研究不同發(fā)酵方式對馬奶酒的影響，從而篩選出最佳馬奶酒發(fā)酵劑。試驗結果表明，當發(fā)酵劑為F4（即6%酵母菌聯(lián)合1%嗜酸乳桿菌及1%瑞士乳桿菌）時，馬奶酒酒精度為1.39%vol，馬奶酒酸度為90°T，感官評分達到91分，且馬奶酒品質最佳，因此，確定馬奶酒工業(yè)化生產(chǎn)發(fā)酵劑為6%酵母菌聯(lián)合1%嗜酸乳桿菌及1%瑞士乳桿菌。

［1］單藝，張?zhí)m威，崔宏斌.傳統(tǒng)法釀造糯米酒中酵母菌的篩選及發(fā)酵特性研究［J］.食品工業(yè)科技，2007，28（8）：88-90.

［2］張和平，孫天松，郝林科，等.利用開菲爾發(fā)酵劑制備牛乳酸馬奶酒的研究［J］.中國乳品工業(yè)，1996，24（4）：16-20.

［3］劉慧，虎硯穎，周雨，等.功能性開菲爾牛乳酸馬奶酒的最佳發(fā)酵條件［J］.食品工業(yè)，2004（1）：35-37.

［4］田芬，陳俊亮，粘靖祺，等.嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌益生特性的研究［J］.食品工業(yè)科技，2012，33（7）：139-142.

［5］秦立虎，周密.我國馬奶酒制作方法的歷史沿革［J］.中國乳品工業(yè)，1996，24（6）：32-33.

［6］華朝麗，趙征.瑞士乳桿菌、丁二酮乳鏈球菌混合培養(yǎng)制作酮香型酸奶的研究［J］.中國乳品工業(yè)，2004，32（2）：17-20.

［7］閔建，李理.瑞士乳桿菌與干酪乳桿菌在不同原料中的發(fā)酵特性研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2009，25（11）：1269-1274.

［8］王友湘，陳慶森.瑞士乳桿菌對小鼠腸道微生物區(qū)系的影響［J］.食品科學，2008，29（9）：542-546.

［9］楊印民.蒙元時期的葡萄酒和馬奶酒［J］.歷史教學問題，2007，22（4）：75-78.

［10］趙瑞香，王大紅，牛生洋，等.超聲波細胞破碎法檢測嗜酸乳桿菌β-半乳糖苷酶活力的研究［J］.食品科學，2006，27（1）：47-50.

［11］賀銀鳳，王鋰韞，李少英，等.酸馬奶酒中一株糞腸球菌抑菌物質的粗提及特性研究［J］.農(nóng)業(yè)工程學報，2007，23（1）：264-267.

［12］敖道夫，布日額.酸馬奶酒的研究進展［J］.中國民族醫(yī)藥雜志，2008，22（4）：65-67.

［13］殷文政，劉立一，馬玉玲，等.馬奶酒抑菌活性的研究［J］.中國乳品工業(yè)，2005，33（7）：15-17.

［14］徐敏，杜金城，于上富，等.藏式酥淮茶生產(chǎn)工藝研究［J］.食品研究與開發(fā)，2015，36（18）：72-75.

［15］徐敏，田輝，杜金城，等.多菌種共固定化發(fā)酵制備枸杞紅棗乳酸飲料［J］.中國釀造，2015，34（7）：164-167.

Screening of starter culture of kumiss

GAN-OD NAMNANSUREN，XU Min，HUO Guicheng*
（College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

Using lactic acid bacteria and yeast co-fermentation method，a new kind of kumiss was developed and new starter was prepared for industrial production.The effect of four starter culture inoculums：yeast 8%（F1），yeast 6%andLactobacillus acidophilus2%（F2），yeast 6%andLactobacillus helveticus2%（F3），and yeast 6%withL.acidophilus1%andL.helveticus1%（F4）on alcohol content，acidity and sensory evaluation quality was investigated.Results showed that when using yeast 6%withL.acidophilus1%andL.helveticus1%as starter，the alcohol content of kumiss was 1.39%vol，the acidity was 90°T，and the sensory evaluation score was 91.The product was sweet and delicious，the organization was uniform which was suitable for people.So yeast 6%withL.acidophilus1%andL.helveticus1%was the optimal starter for kumiss.

lactic acid bacteria；yeast；starter；kumiss

TS261.1

A

0254-5071（2015）11-0095-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.11.022

2015-10-10

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201203009）

GAN-OD NAMNANSUREN（1986-），男，碩士研究生，研究方向為食品科學。

霍貴成（1958-），男，教授，博士，研究方向為食品科學。