綠色木霉和釀酒酵母降解稻草轉化為乙醇的研究

呂繼良，陳傲玉，王　振（湖北理工學院環(huán)境科學與工程學院，湖北黃石435003）

綠色木霉和釀酒酵母降解稻草轉化為乙醇的研究

呂繼良，陳傲玉，王振
（湖北理工學院環(huán)境科學與工程學院，湖北黃石435003）

以稻草作為碳源、污泥作為氮源，利用綠色木霉（Trichoderma viride）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）降解稻草轉化為乙醇，并對該過程中影響乙醇產(chǎn)量的因素進行優(yōu)化。結果表明，當預處理稻草與預處理污泥質量比為1∶10（g∶g）、降解培養(yǎng)基初始pH值為7、綠色木霉和釀酒酵母的接種量分別為4%和3%、降解溫度為37℃和降解時間為48 h時，可得到乙醇的含量為49.25 mg/L。

稻草；污泥；綠色木霉；釀酒酵母；乙醇

礦物質能源的消耗、枯竭以及長期使用造成的環(huán)境污染是全球面臨的重要問題，開發(fā)新的可再生的綠色能源迫在眉睫。乙醇作為一種高效、清潔、可再生的能源成為最有潛力的替代能源之一。將乙醇作為含氧添加劑以一定比例添加到汽淮（柴淮）中，制成清潔環(huán)保的車用乙醇汽淮（乙醇柴淮），受到了世界各國的高度重視［1］。我國是一個農(nóng)業(yè)大國，水稻是我國的主要農(nóng)作物之一，每年隨著水稻的豐收會產(chǎn)生大量的稻草，如果處理不當會造成環(huán)境污染。稻草主要成分為纖維素、半纖維素和木質素，可采用適宜技術將稻草中的纖維素轉化成還原糖，進一步發(fā)酵可生成燃料乙醇。因為稻草中半纖維素和木質素與纖維素的復雜結構及纖維素分子高度結晶特性，限制了稻草轉化為還原糖和燃料乙醇，所以需要進行適當?shù)念A處理，降低纖維素的結晶度，增加纖維素的多孔性，去除木質素的保護作用，減少酶的無效結合，增加酶與底物的接觸位點和接觸面積，從而提高酶解的效率［2-4］。

根據(jù)2014年第一季度住建部發(fā)布的通報，截至2014年3月底，全國累計建成城鎮(zhèn)污水處理廠3 622座，污水處理能力約1.53億m3/d，較2013年底新增約430萬m3/d［5］。目前大部分國家污水處理廠采用活性污泥法，在我國超過85%的污水處理廠釆用活性污泥法［6］，活性污泥法會伴隨產(chǎn)生大量污泥副產(chǎn)物，以含水率80%計，我國2010年污泥產(chǎn)生量約2 076萬t，2011年污泥產(chǎn)生量超過3 000萬t［7-10］。雖然污泥中含有會污染環(huán)境并威脅公眾健康的重金屬、病原微生物、寄生蟲卵、鹽類以及放射性核素等物質，但污泥中還存在大量的有機物質、豐富的氮、磷和多種微量元素等可利用物質，因此，對污泥進行資源化利用應是目前對污泥處置的最佳方法［11-12］。污泥中的大多數(shù)有機物存在于污泥絮體中，其是在胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS）和陽離子的作用下將微生物細胞與有機物質、無機顆粒連接形成的絮狀物質［13］。由于細胞壁及絮狀體的阻隔，使胞內(nèi)物質無法到達胞外被水解，影響厭氧消化過程中胞內(nèi)物質的降解［14］。通過對污泥進行適當?shù)念A處理可以有效破壞微生物細胞壁，從而釋放胞內(nèi)的有機物質，同時還可降解細胞壁外的胞外聚合物（EPS），增加污泥液相中有機物的濃度［12］。

由于污泥中含有大量的含氮物質，稻草中含有大量的含碳物質，可分別作為微生物生長所需的氮源和碳源。若利用綠色木霉和釀酒酵母降解稻草，產(chǎn)纖維素酶的綠色木霉可將稻草中的纖維素降解成葡萄糖，釀酒酵母將葡萄糖發(fā)酵成乙醇，而污泥可提供綠色木霉和釀酒酵母生長所需的氮源等營養(yǎng)物質。這樣不僅能夠解決因稻草和污泥處理不當對環(huán)境造成的不利影響，而且能夠將其資源化為可再生能源，實現(xiàn)經(jīng)濟社會的可持續(xù)發(fā)展。本研究主要是以稻草作為碳源、污泥作為氮源，利用綠色木霉（Trichoderma viride）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）將稻草降解轉化為乙醇，并對該過程中影響乙醇產(chǎn)量的因素進行優(yōu)化，為微生物降解稻草轉化為乙醇的工程放大及過程優(yōu)化控制提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1材料

稻草：取自于貴州省茅臺鎮(zhèn)附近的村莊，將取來的稻草秸稈去除其根部和穗部，風干后，用微型粉碎機將其粉碎成能夠通過40目篩但不能通過60目篩的粉末，貯于廣口瓶中。

污泥：取自湖北省黃石市青山湖污水處理廠脫水后的干污泥，并將取來的污泥放置于陰暗處。

1.1.2菌種

綠色木霉（Trichoderma viride）：購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.1.3培養(yǎng)基

保藏培養(yǎng)基A：土豆500g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L，121℃滅菌30 min。

保藏培養(yǎng)基B：麥芽浸粉20 g/L，瓊脂15 g/L，自然pH，121℃滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基A：將保藏培養(yǎng)基A去除瓊脂，121℃滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基B：將保藏培養(yǎng)基B去除瓊脂，121℃滅菌30 min。

降解培養(yǎng)基：未處理或預處理稻草若干，未處理或預處理污泥若干，調(diào)節(jié)至設定pH，121℃滅菌30 min。

1.1.4試劑

葡萄糖（分析純）、重鉻酸鉀（分析純）：天津博迪化工股份有限公司；麥芽浸粉：北京奧博星生物技術有限責任公司；瓊脂：青島水產(chǎn)品加工廠；氫氧化鈉（分析純）、乙醇（分析純）：天津市凱通化學試劑有限公司；鹽酸（分析純）：中平能化集團開封東大化工有限公司；濃硫酸（分析純）：信陽市化學試劑廠。

1.2儀器與設備

YM50立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海三申醫(yī)療器械有限公司；TS-200B氣浴恒溫振蕩器：匡貝實業(yè)（上海）有限公司；SW-CJ-1D單人單面垂直送風凈化工作臺：杭州哈析儀器儀表有限公司；TD6M離心機：長沙平凡儀器儀表有限公司；UV-6100A紫外可見分光光度計：謹誠（北京）科技有限公司；FZ102微型植物粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；SE2001F電子天平：上海舜宇恒平科技儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：匡貝實業(yè)（上海）有限公司；XM-600烘箱：余姚市亞泰儀表有限公司；PHS-25pH測定儀：上海精密科學儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1稻草秸稈的堿預處理

稱取20 g稻草粉末置于500 mL的大燒杯中，加入3.5% NaOH溶液400 mL（固液比為1∶20（g∶mL）），放置在數(shù)顯恒溫水浴鍋中，100℃水浴加熱35 min。然后用濾紙過濾，并用蒸餾水將濾餅洗滌至中性，將濾餅65℃烘干后，用于轉化乙醇實驗。

1.3.2污泥的堿預處理

在250mL錐形瓶中，加入5 g污水處理廠脫水后的干污泥，用1 mol/L NaOH溶液將污泥的pH值調(diào)節(jié)至12，然后將錐形瓶置于37℃、轉速為110 r/min的氣浴恒溫振蕩器中振蕩24 h。用濾紙過濾，并用蒸餾水將濾餅洗滌至中性，將濾餅65℃烘干后，用于轉化乙醇實驗。

1.3.3菌種種子培養(yǎng)基的制備

從保藏培養(yǎng)基A上取一環(huán)綠色木霉，接入100mL種子培養(yǎng)基A中，置于30℃、150r/min的恒溫振蕩器培養(yǎng)36h。從保藏培養(yǎng)基B上取一環(huán)釀酒酵母，接入100mL種子培養(yǎng)基B中，置于25℃、150 r/min的恒溫振蕩器內(nèi)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)后的綠色木霉、釀酒酵母液體種子培養(yǎng)基用于轉化乙醇實驗。

1.3.4菌株的培養(yǎng)條件對降解稻草轉化乙醇的影響

將綠色木霉和釀酒酵母接入100 mL含有稻草和污泥（經(jīng)121℃滅菌30 min處理）的降解培養(yǎng)基中，在轉速為110r/min的氣浴恒溫振蕩器中培養(yǎng)一定時間后，6000r/min離心樣品5 min，取上清液用于測定乙醇含量。以乙醇含量為評價指標，考察降解培養(yǎng)基的初始pH值、接種量、降解溫度、降解時間、稻草和污泥的質量比（g∶g）及預處理方法對乙醇含量的影響。

1.3.5乙醇含量的測定方法

采用重鉻酸鉀比色法測定乙醇含量［15-16］。

2　結果與分析

2.1降解培養(yǎng)基初始pH值對乙醇含量的影響

接入1%綠色木霉和1%釀酒酵母種子液于降解培養(yǎng)基中，同時在降解培養(yǎng)基中加入預處理稻草和預處理污泥質量比為1∶5（g∶g），分別調(diào)節(jié)初始pH值為5、6、7、8、9，然后置于37℃、轉速為110 r/min的氣浴恒溫振蕩器中降解48 h后取樣，乙醇含量檢測結果如圖1所示。

由圖1可知，當初始pH值在5～7時，乙醇含量隨著初始pH值的增高而增加；當初始pH值在7～9時，乙醇含量先隨著初始pH值的增高而減少，然后隨著pH值的增高略有增高；當發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值為7時，乙醇含量最高為24.37 mg/L。由于在pH值為7時，綠色木霉和釀酒酵母大量繁殖，綠色木霉產(chǎn)的纖維素酶活性最大，能使稻草中更多的纖維素降解生成葡萄糖，而此時釀酒酵母將更多的葡萄糖轉化為乙醇，從而使乙醇產(chǎn)量增加。因此，選定最適初始pH值為7。

圖1　初始pH值對乙醇含量的影響Fig.1 Effect of initial pH on ethanol concentration

2.2菌種接種量對乙醇含量的影響

向初始pH值為7的降解培養(yǎng)基中，加入預處理稻草和預處理污泥質量比為1∶5（g∶g），同時接入綠色木霉和釀酒酵母種子液的接種量百分比為1∶1、2∶1、3∶1、3∶2和4∶3，然后置于37℃、轉速為110 r/min的氣浴恒溫振蕩器中降解48 h后取樣，乙醇含量檢測結果如圖2所示。

圖2　接種量比對乙醇含量的影響Fig.2 Effect of inoculum ratio on ethanol concentration

由圖2可知，當釀酒酵母的接種量為1%、綠色木霉的接種量為1%～3%時，乙醇含量隨著綠色木霉的接種量的增加而增加；當綠色木霉的接種量為3%、釀酒酵母的接種量為1%～2%時，隨著釀酒酵母的接種量的增加，乙醇含量略有增加；當綠色木霉的接種量為4%、釀酒酵母的接種量為3%時，可得到最高的乙醇含量為49.08mg/L。因此，選定綠色木霉的最適接種量為4%、釀酒酵母的最適接種量為3%。

2.3稻草和污泥質量比對乙醇含量的影響

向初始pH值為7的降解培養(yǎng)基中接入4%綠色木霉和3%釀酒酵母種子液，同時加入預處理稻草和預處理污泥質量比為1∶1、1∶10、1∶5、2∶5和3∶5（g∶g），然后置于37℃、轉速為110 r/min的氣浴恒溫振蕩器中降解48 h后取樣，乙醇含量檢測結果如圖3所示。

圖3　稻草與污泥質量比對乙醇含量的影響Fig.3 Effect of rice straw and sludge mass ratio on ethanol concentration

由圖3可知，當預處理污泥質量為5 g、預處理稻草質量分別為1 g、2 g和3 g時，稻草與污泥質量比為1∶5（g∶g）得到的乙醇含量最高，為49.08 mg/L；稻草與污泥質量比為3∶5（g∶g）得到的乙醇含量次之，為36.71 mg/L；稻草與污泥質量比為2∶5（g∶g）得到的乙醇含量最低，為27.46 mg/L。當預處理稻草質量為1 g、預處理污泥質量分別為1 g、5 g和10 g時，稻草與污泥質量比為1∶10（g∶g）得到的乙醇含量最高，為49.25 mg/L；稻草與污泥質量比為1∶5（g∶g）得到的乙醇含量次之，為49.08 mg/L；稻草與污泥質量比為1∶1（g∶g）得到的乙醇含量最低，為34.15 mg/L。因此，選擇預處理稻草與預處理污泥最適質量比為1∶10（g∶g）為宜。

2.4稻草和污泥預處理方法對乙醇含量的影響

取1 g未處理稻草和10 g未處理污泥（標記為均未預處理組）、1 g預處理稻草和10 g未處理污泥（標記為稻草預處理組）、1 g未處理稻草和10 g預處理污泥（標記為污泥預處理組）、1 g預處理稻草和10 g預處理污泥（標記為均預處理組），將初始pH值調(diào)節(jié)為7，同時接入4%綠色木霉和3%釀酒酵母種子液于稻草和污泥中，然后置于37℃、轉速為110 r/min的氣浴恒溫振蕩器中降解48 h后取樣，乙醇含量檢測結果如圖4所示。

圖4　稻草和污泥預處理方法對乙醇含量的影響Fig.4 Effect of pretreatment methods of rice straw and sludge on ethanol concentration

由圖4可知，均預處理組得到的乙醇含量最高，為49.25 mg/L；污泥預處理組得到的乙醇含量次之，為29.58 mg/L；稻草預處理組得到的乙醇含量再次之，為21.37 mg/L；均未預處理組得到的乙醇含量最低，為19.75 mg/L。NaOH處理會引起稻草中纖維素的孔隙率增加、聚合度降低、結晶度下降和木質素的去除，使稻草中纖維素的降解率大大提高［17-18］，從而使乙醇含量增加。而對污泥進行預處理，可以破壞污泥細胞、釋放大量的有機物，從而增強污泥中有機物的利用率［19］。因此，選擇均預處理組為宜。

2.5降解溫度對乙醇含量的影響

向初始pH值為7的降解培養(yǎng)基中，加入預處理稻草和預處理污泥質量比為1∶10（g∶g），同時接入4%綠色木霉和3%釀酒酵母種子液，然后分別置于不同的溫度、轉速為110 r/min的氣浴恒溫振蕩器中降解48 h后取樣，乙醇含量檢測結果如圖5所示。

圖5　降解溫度對乙醇含量的影響Fig.5 Effect of degradation temperature on ethanol concentration

由圖5可知，當降解溫度在27～37℃時，乙醇含量隨著發(fā)酵溫度的升高而增加；降解溫度為37℃時，乙醇含量最高，為49.25 mg/L；當降解溫度在37～47℃時，乙醇含量隨著發(fā)酵溫度的升高而降低，可能是由于溫度較高，綠色木霉產(chǎn)的纖維素酶活性不高，致使糖化速率降低，從而限制了降解過程。ANDERSON P J等［20］研究結果表明，當溫度＞43℃時，酵母的活性有所降低，因此，高溫可能降低酵母的菌體活性以及菌體對乙醇的耐受程度。LARKN等［21］利用馬克斯克魯維酵母（Kluveromyces marxianus）同步糖化發(fā)酵造紙污泥時，發(fā)現(xiàn)最適溫度為38℃，高于或低于38℃都將導致乙醇發(fā)酵效率降低。江丹等［22］利用利用商業(yè)纖維素酶和酒精酵母SHY08-3同步糖化發(fā)酵脫墨廢紙污泥和化學制漿污泥產(chǎn)乙醇，研究結果表明，在37℃條件下脫墨廢紙污泥和化學制漿污泥均可獲得最大乙醇發(fā)酵速率。因此，選定最適降解溫度為37℃。

2.6降解時間對乙醇含量的影響

向初始pH值為7的降解培養(yǎng)基中，加入預處理稻草和預處理污泥質量比為1∶10（g∶g），同時接入4%綠色木霉和3%釀酒酵母種子液，然后置于37℃、轉速為110 r/min的氣浴恒溫振蕩器中降解12 h、24 h、36 h、48 h和60 h后取樣，乙醇含量檢測結果如圖6所示。

圖6　降解時間對乙醇含量的影響Fig.6 Effect of degradation time on ethanol concentration

由圖6可知，當降解時間在0～12 h時，乙醇含量增加迅速，表明綠色木霉和釀酒酵母能較快的將稻草轉化為乙醇；當降解時間在12～24 h時，乙醇含量減少，說明綠色木霉將稻草中的纖維素轉化為葡萄糖的速度較釀酒酵母將葡萄糖轉化為乙醇的速度快，所以葡萄糖對綠色木霉產(chǎn)的纖維素酶活性存在反饋抑制，導致乙醇含量減少；當降解時間在24～48 h時，乙醇含量迅速增加，表明葡萄糖對綠色木霉產(chǎn)的纖維素酶活性的反饋抑制消除；當降解時間在48～60 h時，乙醇產(chǎn)量較少，表明綠色木霉和釀酒酵母進入衰亡期，從而使乙醇含量減少。當降解時間為48 h時，乙醇含量最高，為49.25 mg/L。因此，選定降解時間為48 h為宜。

3　結論

本研究選用綠色木霉和釀酒酵母降解稻草轉化為乙醇，并利用污泥作為該過程中綠色木霉和釀酒酵母生長所需的氮源，對該過程中影響乙醇產(chǎn)量的因素進行優(yōu)化。優(yōu)化后的降解條件：降解培養(yǎng)基中預處理稻草和預處理污泥質量比為1∶10（g∶g），培養(yǎng)基初始pH值為7，綠色木霉和釀酒酵母的接種量分別為4%和3%，降解溫度為37℃，在此條件下降解48 h，可得到最高的乙醇含量為49.25 mg/L。

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Degradation of rice straw to ethanol usingTrichoderma virideandSaccharomyces cerevisiae

Lü Jiliang，CHEN Aoyu，WANG Zhen
（School of Environmental Science and Engineering，Hubei Polytechnic University，Huangshi 435003，China）

Rice straw and sludge were used as carbon source and nitrogen source respectively，rice straw were degraded to ethanol byTrichoderma virideandSaccharomyces cerevisiae.The factors affecting ethanol yield in degradation were optimized.The results showed that the highest ethanol concentration was 49.25 mg/L，under the conditions of the pretreated rice straw and sludge mass ratio 1∶10（g∶g），initial pH of degradation medium 7，T.virideandS.cerevisiaeinoculum 4%and 3%，degradation temperature 37℃and time 48 h.

rice straw；sludge；Trichoderma viride；Saccharomyces cerevisiae；ethanol

X705

A

0254-5071（2015）11-0079-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.11.018

2015-09-07

湖北省教育廳科學技術研究指導性項目（B2014030）

呂繼良（1982-），男，講師，博士，研究方向為生物質能源轉化。