骨橋蛋白和CD44v6在惡性黑素瘤中的表達及其意義

周宇丹

（嘉興曙光中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院整形美容科　浙江　嘉興　314001）

骨橋蛋白和CD44v6在惡性黑素瘤中的表達及其意義

周宇丹

（嘉興曙光中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院整形美容科浙江嘉興314001）

目的：探討骨橋蛋白（OPN）和CD44v6在惡性黑素瘤中的表達特點及其生物學意義。方法：應(yīng)用免疫組化法分別檢測16例惡性黑素瘤患者皮損及12例良性黑素痣中OPN和CD44v6的表達情況。結(jié)果：OPN和CD44v6在惡性黑素瘤中陽性表達分別為87.5%%和75%，顯著高于良性黑素痣的16.7%和0（P＜0.01）。OPN和CD44v6呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.69，P＜0.05）。惡性黑素瘤中OPN和CD44v6陽性表達可能與其高轉(zhuǎn)移性能有關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論：OPN和CD44v6的高表達在惡性黑素瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中可能起著重要的協(xié)同作用。

骨橋蛋白；CD44v6；惡性黑素瘤；免疫組織化學

惡性黑素瘤是危害人類健康的主要皮膚腫瘤之一。近年來，隨著社會的發(fā)展以及生活環(huán)境的改變，其發(fā)病率也正在逐年增加。黑素瘤細胞可浸潤至皮下組織或粘膜深層組織，甚至相鄰器官，并可通過淋巴以及血行轉(zhuǎn)移。雖然經(jīng)過多年研究，人們對惡性黑素瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的機制尚不十分清楚。研究表明，骨橋蛋白（osteopontin，OPN）是一種與腫瘤細胞的轉(zhuǎn)化、浸潤和轉(zhuǎn)移有關(guān)的蛋白質(zhì)，可作為評估腫瘤患者預后、復發(fā)或轉(zhuǎn)移的指標［1］。OPN與細胞結(jié)合的能力是通過細胞表面的整合素以及CD44等細胞黏附分子所介導。CD44有多種變異體，其中CD44v6與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移關(guān)系最為密切，已經(jīng)成為腫瘤轉(zhuǎn)移的標記性分子之一［2］。筆者回顧性地檢測和分析了惡性黑素瘤組織標本中的OPN和CD44v6的表達情況，以探索其與惡性黑素瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1　材料和方法

1.1標本采集

所有標本選自筆者所在醫(yī)院病理科1999-2010年的石蠟包埋標本28例。其中，惡性黑素瘤16例（轉(zhuǎn)移性黑素瘤12例，原位黑素瘤4例），男10例，女6例，年齡42～76歲，平均（56.2±4.72）歲，全部患者術(shù)前均未接受化療。良性黑素痣組織12例，男7例，女5例，年齡32～57歲，平均（36.7±5.92）歲。

1.2試劑

鼠抗人OPN單克隆抗體、鼠抗人CD44v6單克隆抗體均購自美國Santa Cruz生物技術(shù)有限公司，兔抗鼠二抗、免疫組化標準化試劑盒和DAB顯色試劑盒由浙江大學呼吸病學研究所王蘋莉博士惠贈。

1.3免疫組化

所有標本由10%甲醛固定，石蠟包埋，切片5μm厚，分別行普通HE染色和免疫組化特染，所有實驗操作步驟按照說明書進行。比如，免疫組化具體步驟為：石蠟切片脫蠟至水，3%雙氧水室溫孵育5～10min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。蒸餾水沖洗，PBS浸泡2次，每次5min。5%～10%正常山羊血清（PBS稀釋）封閉，室溫孵育10min，傾去血清，勿洗。滴加一抗工作液，4℃過夜。PBS沖洗3次，每次5min。滴加適量生物素標記二抗工作液，37℃孵育 10-30min。PBS沖洗3次，每次5min。滴加適量辣根酶標記的鏈霉卵白素工作液，37℃ 孵育10～30min。PBS沖洗3次，每次5min。DAB顯色3～15 min。自來水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片。

1.4結(jié)果判定

在胞質(zhì)或胞膜中可見棕黃色顆粒為陽性細胞，否則為陰性。根據(jù)陽性染色細胞的百分數(shù)及其染色深淺強度進行分級評判。陽性染色細胞的百分數(shù)分級：陽性細胞≤5%為0分；6%～25%為1分；26%～50%為2分；≥50%為3分。染色深淺強度：無染色為0分，輕度染色為1分，中度染色為2分，強染色為3分。以上兩項相乘為分級標準：（-）為0-1分；（+）為2-3分；（++）為4-6分；（+++）為9分。

1.5統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，采用χ2檢驗進行兩兩間比較，應(yīng)用Spearman等級相關(guān)對兩種分子在惡黑組織中的表達情況及兩者的相互關(guān)系進行分析。以α=0.05作為檢驗水準，當P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1HE結(jié)果

HE染色可見，惡性黑素瘤組織的基底層可見不典型的黑素細胞連續(xù)增生。表真皮交界處腫瘤細胞呈巢，部分巢融合真皮中下部彌漫性增生，腫瘤細胞異形明顯，核大而深染，細胞形態(tài)大小不一，見圖1。

2.2OPN、CD44v6在惡性黑素瘤和良性黑素痣中的表達

OPN在16例惡性黑素瘤患者標本中有14例（87.5%）表達陽性，其中5例為弱陽性，6例為中度，剩余3例為強陽性，陽性顆粒主要見于細胞漿內(nèi)，呈小片狀以及巢狀分布；CD44v6在16例惡性黑素瘤患者標本中有12例（75.0%）表達陽性，其中4例為弱陽性，6例為中度，2例為強陽性，陽性顆粒主要見于細胞膜上，偶見細于胞漿內(nèi)（圖2）。12例良性黑素痣組織中有2例（16.7%）OPN表達陽性，均為弱陽性。12例良性黑素痣未見CD44v6表達陽性（表1）。OPN和CD44v6在惡性黑素瘤的表達與在良性黑素痣中的表達相比，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.3OPN和CD44v6在惡性黑素瘤組織中表達的相關(guān)性

14例陽性表達OPN的患者中有12例CD44v6表達呈陽性，2例陰性表達OPN的患者中CD44v6陽性和陰性表達各占1例，兩者為正相關(guān)（r=0.69，P＜0.05（表1））。

2.4OPN和CD44v6的表達與惡性黑素瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)系

在16例惡性黑素瘤患者標本中，OPN在12例轉(zhuǎn)移黑素瘤中的表達高于4例原位黑素瘤，兩者之間差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.16，P＜0.05）。在16例惡性黑素瘤患者標本中，CD44v6在12例轉(zhuǎn)移黑素瘤中的表達亦高于4例原位黑素瘤，兩者之間差異有統(tǒng)計學意義（χ2=3.96，P＜0.05）。其中，在12例轉(zhuǎn)移黑素瘤病例中，OPN和CD44v6全部表達陽性，而4例原位黑素瘤中，OPN有2例表達陽性，2例表達陰性，CD44v6則全部表達陰性。詳見表2。

圖1　惡性黑素瘤組織病理圖（HE×40）

圖2A　OPN在惡性黑素瘤的表達（DAB染色×100）

圖2　B　OPN在惡性黑素瘤的表達（DAB染色×400）

圖2　C　CD44v6在惡性黑素瘤的表達（DAB染色×100）

圖2　D　CD44v6在惡性黑素瘤的表達（DAB染色×400）

表1　OPN和CD44v6在惡性黑素瘤和良性黑素痣中的表達及兩者在惡性黑素瘤中的相關(guān)性

3　討論

OPN是一種分泌型磷酸化糖蛋白，具有多種生物學活性，并受到多種激素和細胞因子的調(diào)控。大量研究表明，OPN能夠促進腫瘤細胞的趨化、黏附和遷移，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移和復發(fā)有關(guān)［1］。OPN與細胞的結(jié)合力是通過細胞表面的受體所介導。OPN的受體家族主要包括整合素和CD44。OPN可通過細胞粘附序列RGD識別整合素αvβ3與細胞表面結(jié)合，也還可以與細胞表面的跨膜糖蛋白CD44相互作用，OPN與CD44的相互作用可增高其CD44依賴的趨化性，引起粘附和抗凋亡作用［3-5］。研究表明，OPN在惡性腫瘤中的主要受體是CD44v，OPN協(xié)同CD44v在各種腫瘤中的高表達能夠增加其與ECM的黏附，促進腫瘤的轉(zhuǎn)移，越有轉(zhuǎn)移潛能的病變，OPN的表達就越顯著［2，4］。

Zhou等［6］的研究發(fā)現(xiàn)了近200個與惡黑遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，其中14個基因的表達超過正常個體20倍，Opn基因也名列其中。在蛋白質(zhì)層面，Philip等［7］研究發(fā)現(xiàn)，利用小干擾RNA技術(shù)使得黑素瘤細胞OPN的表達沉默后，可以顯著抑制細胞的增殖活性，而使用人乳中的OPN刺激B16黑素瘤細胞后，其增殖能力大增。以上結(jié)果足以表明，OPN在黑色素瘤這個疾病的發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用，將來有可能作為其特征性的標記分子［8］。

筆者研究結(jié)果提示，在惡性黑素瘤中，OPN與CD44v6均有較高的陽性表達率，且明顯高于良性黑素痣。該結(jié)果與國內(nèi)外關(guān)于單獨研究OPN在黑素瘤中的作用報道相一致［9，10］。此外，OPN與CD44v6的表達呈正相關(guān)，說明OPN與CD44v6可能通過某種協(xié)同效應(yīng)，OPN表達增強的同時能夠提高CD44v6的表達。當腫瘤細胞表面這兩種分子的表達量達到一定量時，能夠使腫瘤細胞的黏附和轉(zhuǎn)移相對變得更為輕松，在其它因素的共同作用下，發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。筆者下一步還需要研究其具體的病理機制。

表2　OPN和CD44v6在惡性黑素瘤與原位黑素瘤中的表達情況

筆者還發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移性惡性黑素瘤病例中OPN和CD44v6表達陽性率和染色強度均高于原位黑素瘤病例（P＜0.05），提示兩者的共同高表達可能與惡性黑素瘤的高度轉(zhuǎn)移能力有關(guān)，尤其是CD44v6，它作為淋巴細胞的“歸巢受體”，可以使淋巴細胞與毛細血管后小靜脈中的內(nèi)皮細胞發(fā)生結(jié)合，并使淋巴細胞穿過血管壁回到淋巴組織，因此，發(fā)生轉(zhuǎn)移的惡黑病例中CD44v6表達陽性率顯著增高［11］。黃長征等［9］的研究也認為，OPN參與惡性黑素瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，但并非通過淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。有研究推測，可能因為惡性黑素瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移非?？?，腫瘤尚未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時即已發(fā)生其他形式的轉(zhuǎn)移［12］。

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編輯/張惠娟

Expression and significance of osteopontin and CD44v6 in malignant melanoma

ZHOU Yu-dan
（Department of Plastic Surgery，Shuguang Hospitals of Traditional Chinese and Western Medicine，Jiaxing 314001，Zhejiang，China）

Objective To study the expression and biological significance of osteopontin（OPN）and CD44v6 in human malignant melanoma.MethodsThe distribution and expression of OPN and CD44v6 was detected in 16 malignant melanoma patients and in 12 patients with benign melanocytic nevi by immunohistochemistry.ResultsThe positive expression rates of OPN and CD44v6 in malignant melanoma were 87.5%and 75%，respectively.The expression of OPN and CD44v6 was significantly higher in malignant melanoma than that in benign melanocytic nevi tissues（P＜0.01））. There was a positive correlation between OPN and CD44v6（r=0.69，P＜0.05）.The positive rates of OPN and CD44v6 were associated with metastasis（P＜0.05）.Conclusion Overexpression of OPN and CD44v6 may contribute to the development and metastasis of malignant melanoma.

osteopontin；CD44v6；melanoma malignant；immunohistochemistry

R739.5

A

1008-6455（2015）16-0032-04

2015-05-16

2015-07-29