吉林地區(qū)尖銳濕疣疣體內(nèi)高危型人乳頭瘤病毒的檢測與分型

叢樂樂，崔傳信，楊宏鳳，趙 晴，李曉麗

（吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春130033）

尖銳濕疣（CA），是由人乳頭瘤病毒（HPV）感染所致的以生殖器部位增生性損害為主要表現(xiàn)的疾病，具有較強的傳染性和較高的復(fù)發(fā)率，并以亞臨床感染的形式存在于人體中，根據(jù)致癌性的高低，將HPV分為低危型、高危型，感染型別多為低危型，多無癌變傾向，高危型HPV持續(xù)感染是99%以上宮頸癌發(fā)生的必要條件［1］。各地區(qū)流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)不同人群的HPV感染型別有著較大的區(qū)別，對尖銳濕疣患者HPV感染亞型的調(diào)查，可對患者的治療預(yù)后進行有效的判斷，具有極其重要的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 2012年3月至2014年2月就診于自吉林大學(xué)第三醫(yī)院的皮膚科門診尖銳濕疣患者，記錄患者姓名，性別，年齡，疣體位置，大小，形態(tài)，病史，治療史。

1.1.2 標(biāo)本收集 對經(jīng)臨床和醋白試驗證尖銳濕疣患者，簽知情同意書，局麻，剪取3mm×3mm大小疣體組織。將其放入備有1ml無菌生理鹽水的試管中，標(biāo)記，放入－20℃冰箱中冷藏備用。

1.1.3 試劑與儀器 高危型人乳頭瘤病毒（HPV）分型核酸測定試劑盒（上海之江生物科技股份有限公司）。ABI Prism?7000型熒光定量PCR儀。

1.2 方法

采用HPV13種型別的特異性引物及熒光探針，應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）結(jié)合Tapman技術(shù)，對HPV13種型別的特異性DNA核酸片段進行分型檢測。

1.2.1 樣本DNA提取 取約50mg組織于試管中，置室溫解凍，研磨，加入1ml生理鹽水，充分震蕩搖勻，將液體轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，以13，000 rpm離心5min。沉淀加無菌生理鹽水1ml混勻，以13，000rpm離心5min，棄上清。沉淀后直接加入100μl核酸提取液充分混勻，沸水浴10min后13，000rpm離心5min，取上清4μl作為PCR反應(yīng)模板。

1.2.2 質(zhì)量控制 H2O檢測結(jié)果應(yīng)為儀器FAM、VIC通道Ct欄均顯示UNDET（ABI Prism?7000）或循環(huán)閾值欄均顯示40（SLAN熒光定量PCR檢測系統(tǒng)），陽性對照品檢測結(jié)果應(yīng)為Ct值≤35，否則實驗視為無效。結(jié)果判斷Ct值等于40.0或UNDET的樣本為陰性，Ct值≤35的檢測樣本為陽性。

2 結(jié)果

2.1 HPV感染型別分布 280例疣體樣本中，HPV高危型陽性例數(shù)為76例，感染率為27.14%。檢測的13種亞型均有出現(xiàn)。檢出率前7位感染的HPV亞型分別為 HPV16，18，59，58，56，33，39。見表1。

表1 HPV感染的型別分布（前7位）

2.2 HPV高危型多重感染分布 280例尖銳濕疣患者共檢測出高危型HPV 76例，其中單一型感染35例（46.1%），多重感染41例（53.9%）。其中二重感染21例，（27.6%）；三重感染14例，（18.4%）；四重感染4例，（5.3%）；五重感染2例，（2.6%）

2.3 不同年齡段HPV高危型感染率比較 本研究共收集280例尖銳濕疣患者，年齡最小20歲，最大67歲，平均37.6歲，年齡中位數(shù)為37歲，20－29歲102例，占36.4%。50歲以上32例。見表2。

表2 尖銳濕疣患者性別及年齡分布（n/%）

可見，20－29歲為高發(fā)年齡段，均高于其他各組。采用SPSS11.5χ2統(tǒng)計分析軟件分析，不同年齡段男女患者發(fā)病情況無顯著性差異（P＞0.05）。

3 討論

3.1 HPV高危型單一感染和多重感染的情況HPV由于各種亞型之間編碼外殼蛋白是基因變異較大，不同亞型病毒之間基本上沒有交叉保護性抗體，容易造成不同亞型HPV的多重感染和多次感染，HPV多重感染發(fā)生宮頸癌的風(fēng)險比單一型別感染增加1.5倍［2］。本實驗中尖銳濕疣組織中共檢測出高危型 HPV感染率為27.14%（76/280），多重感染高達53.9%（41/76）。關(guān)于HPV多重感染是否會增加宮頸癌的風(fēng)險，目前尚無統(tǒng)一意見，但更多學(xué)者傾向認為，HPV多重感染更易導(dǎo)致宮頸病變，增加宮頸癌的風(fēng)險。

3.2 HPV感染的高發(fā)年齡 有研究表明，在292例HPV陽性的尖銳濕疣患者中，HPV構(gòu)成比以20－29歲年齡段最高［3］。雷振春等［4］在780例尖銳濕疣患者中證明HPV陽性構(gòu)成比最高的年齡段在20－29歲，與本文相符。但是從統(tǒng)計學(xué)上來說，20－29歲年齡段與30－39歲年齡段的發(fā)病率并無差異，兩個年齡段的發(fā)病率相加高達68.57%。由此可見，20－39歲為HPV感染的高發(fā)年齡。其原因可能與該年齡段的患者性生活相對頻繁有關(guān)系。

3.3 熒光定量PCR檢測HPV基因型意義 熒光定量 PCR （Quantitative Real－time PCR）是 一 種 在DNA擴增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)檢測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析。實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每輪循環(huán)均可檢測熒光信號強度，并記錄，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。能一次性檢測出多種不同的基因序列，具有快速、簡便、高效、高敏感性、高特異性等特點，尤其適用于基因分型、病原體的檢測等方面。因此適于研究HPV感染的流行病學(xué)和正常人HPV感染篩查。

3.4 HPV相關(guān)疾病的流行病學(xué)調(diào)查 經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，宮頸癌、肛門癌和外生殖器癌、喉癌與HPV 的相關(guān)性約為100%、85%、50%［5］。2004－2008年在美國，每年有新的HPV相關(guān)口咽鱗癌病例報告多達12000例，過去20－30年里增長了高達225%［6］。有學(xué)者認為，HPV－16在HNSCC的進程中是至關(guān)重要的因素［7］。陰莖癌最常見于50－70歲左右的男性，在發(fā)展中國家有著較高的患病率，約10%。在侵襲性陰莖腫瘤組織中HPV16高達60.2%，是最常見的型別，其次為 HPV18（13.3%）［8］。宮頸癌是婦女發(fā)病率較高的惡性腫瘤，全球每年新發(fā)宮頸癌患者約為45萬人，有22萬人死于該?。?］。

綜上所述，高危型HPV與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。因此，HPV分型檢測是宮頸癌等病變篩查的必要手段。通過分型檢測進行個體化評估，預(yù)測腫瘤發(fā)生的風(fēng)險度，從而決定篩查的間隔，選擇和制定治療方案。結(jié)果也可為監(jiān)測疫苗的效果及為未來制作相應(yīng)型別的疫苗提供理論依據(jù)。

［1］Richa Tripathi，Gayatri Rath，et al.Clinical Impact of De－Regulated Notch－1and Notch－3in the Development and Progression of HPVAssociated Different Histological Subtypes of Precancerous and Cancerous Lesions of Human Uterine Cervix［J］.PLoS One，2014，9（6）：e98642.

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