腫瘤壞死因子Ⅱ型受體基因多態(tài)性與特發(fā)性間質(zhì)性肺炎的相關(guān)性研究

李 寧，代華平，朱 敏，辛 萍，肖 白

（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院－北京呼吸疾病研究所，北京100020；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京復(fù)興醫(yī)院 呼吸科，北京100038）

特發(fā)性間質(zhì)性肺炎（idiopathic interstitial pneumonia，IIP）是一組發(fā)病原因不明的間質(zhì)性肺疾?。↖LD），以肺實(shí)質(zhì)受到不同形式和程度的炎癥和纖維化損害為特點(diǎn)，特發(fā)性肺纖維化（IPF）是IIP中最常見(jiàn)的一種。目前認(rèn)為與炎癥損傷及組織修復(fù)相關(guān)的細(xì)胞因子影響了IIP的發(fā)病，其中，腫瘤壞死因子及其受體在介導(dǎo)肺的炎癥和纖維化的過(guò)程中起著重要作用。我們應(yīng)用多聚酶鏈反應(yīng)－限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 （PCR－RFLP）技術(shù)和測(cè)序的方法，對(duì)中國(guó)漢族人群TNFRⅡ196位點(diǎn)多態(tài)性與IIP，特別是與IPF發(fā)病的關(guān)系做初步探討。

1 材料與方法

1.1 對(duì)象

收集2001.1－2013.12住北京朝陽(yáng)醫(yī)院呼吸內(nèi)科確診為特發(fā)性間質(zhì)性肺炎（IIP）的患者100例，包括：IPF患者83例，均符合中華結(jié)核和呼吸雜志2002年發(fā)布《特發(fā)性肺纖維化診斷和治療指南（草案）》IPF臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)［1］，其中6例經(jīng)外科肺活檢確診為普通型間質(zhì)性肺炎（usual interstitial pneumonia，UIP）；非IPF的IIP患者17例，診斷參考2002年ATS/ERS聯(lián)合發(fā)表的《特發(fā)性間質(zhì)性肺炎分類(lèi)》的多學(xué)科國(guó)際共識(shí)意見(jiàn)［2］，其中包括非特異性間質(zhì)性肺炎（nonspecific interstitial pneumonia，NSIP）3例，其中1例經(jīng)外科肺活檢證實(shí)；隱源性機(jī)化性肺炎（cryopgenic organized neumonia，COP）11例，其中1例經(jīng)外科肺活檢證實(shí)；呼吸性細(xì)支氣管炎性間質(zhì)性肺疾?。╮espiratory bronchiolites－interstitial lung diseases，RB－ILD）3 例。對(duì)照組100例，入選標(biāo)準(zhǔn)：與IIP患者1∶1配對(duì)的中國(guó)漢族人群；性別相同，年齡±2（歲）；吸煙指數(shù)±200（年·支）；且無(wú)IIP病史，與IIP患者無(wú)血緣關(guān)系；主要來(lái)自健康體檢者及因急診外傷、骨折等而住院的無(wú)慢性疾病的住院病人。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 采集外周靜脈血3－5ml，2%EDTA抗凝液抗凝，－20℃低溫保存。用常規(guī)酚－氯仿－異戊醇抽提法提取基因組DNA。

1.2.2 TNFRⅡ196位點(diǎn)基因多態(tài)性分析 按文獻(xiàn)［3］報(bào)道的序列合成引物，擴(kuò)增包含有TNFRⅡ196位點(diǎn)的目的基因片段。TNFRⅡ196位點(diǎn)上游引物：5’－ACTCTCCTATCCTGCCTGCT －3’，下 游引 物：5’－TTCTGGAGTTGGCTGCGTGT －3’。PCR反應(yīng)總體積為25μl，包括10×PCR反應(yīng)緩沖液（含 Mg2＋）2.5μl，dNTP mixture 2.0μl，上游引物0.2μl，下游引物 0.2μl，ExTaq DNA 聚合酶0.2μl，DNA 模板1.0μl，ddH2O 18.9μl。

PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2min，然后95℃變性30s，62℃退火30s，72℃ 延伸30s，40個(gè)循環(huán)后，72℃繼續(xù)延伸7min，降至4℃保存。

用2.5%瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8μl，與限制性核酸內(nèi)切酶NlaⅢ1 μl，Buffer緩沖液1μl于37℃條件下消化6－8h，酶解產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 SPSS19統(tǒng)計(jì)軟件整理與分析。IIP組和對(duì)照組的年齡、吸煙指數(shù)及吸煙狀態(tài)的差異分別采用t檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)?；蛐头植际欠穹?Hardy－Weinberg遺傳平衡定律及兩組間基因型和等位基因頻率的差異比較采用卡方檢驗(yàn)。TNFRⅡ196位點(diǎn)突變基因型及突變等位基因與IIP、IPF的相對(duì)危險(xiǎn)度分析采用Logistic回歸計(jì)算比值比（OR）和95%可信區(qū)間（95%CI）。P＜0.05為差異有顯著性的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 Hardy－Weinberg遺傳平衡定律檢測(cè)

TNFRⅡ196位點(diǎn)的各種基因型在IIP組和對(duì)照組人群的分布均符合 Hardy－Weinberg遺傳平衡，結(jié)果有代表性（P＞0.05）。

2.2 IIP組與對(duì)照組基本資料的比較

對(duì)IIP組和對(duì)照組的年齡做t檢驗(yàn)，吸煙指數(shù)做秩和檢驗(yàn)，吸煙狀態(tài)做卡方檢驗(yàn)，結(jié)果均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（見(jiàn)表1）。

表1 IIP組（包括IPF和非IPF－IIP）與對(duì)照組基本資料的比較

2.3 TNFRⅡ196位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的限制性酶切結(jié)果

TNFRⅡ196位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增片段大小為242 bp。經(jīng)NlaⅢ酶切后的PCR產(chǎn)物產(chǎn)生3種基因型，見(jiàn)圖 1。分別為 196M/M（133bp 和 109bp）；196M/R（242bp、133bp、109bp）；196R/R（242 bp）。

2.4 TNFRⅡ196位點(diǎn)基因型、等位基因頻率分析及與發(fā)生IIP、IPF的相對(duì)危險(xiǎn)度分析（見(jiàn)表2－3）

圖1 TNFRⅡ196位點(diǎn)酶切產(chǎn)物電泳

IIP組與對(duì)照組中的196R/R＋196M/R突變基因型和196M/M野生基因型的差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著性意義（P＝1.000）；兩組中196R突變型和196M野生型等位基因的差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著性意義（P＝0.898）。IPF組與對(duì)照組中的196R/R＋196M/R突變基因型和196M/M野生基因型的差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著性意義（P＝0.868）；兩組中196R和196M等位基因的差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著性意義（P＝1.000）。

TNFRⅡ196位點(diǎn)突變基因型196R/R＋196M/R及突變196R等位基因與IIP及IPF的發(fā)生無(wú)顯著相關(guān)性。

表2 TNFRⅡ196位點(diǎn)基因型和等位基因在IIP組和對(duì)照組的分布及相對(duì)危險(xiǎn)度分析

表3 TNFRⅡ196位點(diǎn)基因型和等位基因在IPF組和對(duì)照組的分布及相對(duì)危險(xiǎn)度分析

3 討論

近年來(lái)，在肺纖維化發(fā)病機(jī)制的研究中，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為這組疾病是由環(huán)境和遺傳等多種因素共同作用而導(dǎo)致的一類(lèi)極其復(fù)雜的疾病，遺傳因素在其發(fā)病中可能起了重要的作用。它們的易感基因可能包括與上皮細(xì)胞損傷和異常損傷修復(fù)有關(guān)的多個(gè)基因多態(tài)性的聯(lián)合作用，故各種細(xì)胞因子和表面蛋白基因成為候選基因。最近的研究表明，TNF－α，TGF－β1，IL－4受體拮抗劑等的基因多態(tài)性可能增加肺纖維化 發(fā) 生 的 風(fēng) 險(xiǎn)［4－6］。Pantelidis［5］等 的 研 究 表 明TNFR II和IL－6的基因多態(tài)性與IPF的發(fā)生有顯著相關(guān)性。

目前已證實(shí)產(chǎn)生于巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子TNF－α在介導(dǎo)肺的炎癥的和纖維化的過(guò)程中起著重要作用。TNF－α可以引起以肺泡上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞壞死為主的彌漫性肺泡損傷。它是一種前炎癥細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)血小板活化因子、IL－1、IL－8等致纖維化因子的釋放，抑制肺泡Ⅱ型細(xì)胞表面活性物質(zhì)；并可能間接通過(guò)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β或血小板衍化生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)途徑促進(jìn)成纖維細(xì)胞增生、分化和膠原轉(zhuǎn)錄；大量的TNF－α還可誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞凋亡而引起肺纖維化反應(yīng)。Liu等［7］發(fā)現(xiàn)，TNF－α不但直接促進(jìn)纖維化的發(fā)生，而且促進(jìn)纖維蛋白溶酶原抑制物I的產(chǎn)生，抑制細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）降解。研究［8］證實(shí)在纖維化的肺部組織中，TNF－α大量增殖，TNF－αmRNA的水平高于正常肺組織。因此認(rèn)為T(mén)NF－α在肺纖維化發(fā)病的過(guò)程中是一個(gè)關(guān)鍵性因子。

在體內(nèi)，TNF－α的生物學(xué)活性必須依賴(lài)細(xì)胞表面的 TNF受體（TNF receptor，TNFR）來(lái)完成。TNF－α/TNFR系統(tǒng)是體內(nèi)重要的炎癥因子，同時(shí)對(duì)細(xì)菌感染，某些自身免疫疾病和退化性疾病有保護(hù)功能，因此，TNFR的生物學(xué)活性取決于影響TNF－α/TNFR平衡的諸多因素，并且受遺傳和環(huán)境因素，細(xì)胞分化的不同時(shí)期以及細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)間的信息傳遞等的影響。

TNFR有TNFR I和TNFR II兩種受體。TNFR I參與活化NF－κB，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，成纖維細(xì)胞增殖等；而TNFR II可通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活NF－κB，傳遞胸腺細(xì)胞和NK等淋巴細(xì)胞的增殖信號(hào)，使細(xì)胞增殖和分化。近年研究認(rèn)為，當(dāng)細(xì)胞表面TNFR2表達(dá)上調(diào)或過(guò)度表達(dá)時(shí)，TNFR2可直接與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（TRAF2）結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)TNFR1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的TRAF2分子，TNFR2還通過(guò)其適配分子—細(xì)胞性凋亡抑制因子－1（CIAP1）引發(fā)TRAF2發(fā)生泛素化及蛋白降解反應(yīng)，從而增強(qiáng)TNFR1介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用［9］。Erickson的研究［10］顯示TNFRII基因敲除的小鼠對(duì)TNF致肺纖維化的敏感性降低，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的增殖活性明顯被抑制，說(shuō)明TNFRII在肺纖維化的發(fā)病中起著重要作用。

TNFR I由TNFRSF1A編碼，TNFR II由TNFRSF1B編碼。編碼TNFR II的基因位于染色體1p36，它有許多多態(tài)性位點(diǎn)，其基因多態(tài)性可能影響TNFR II的功能和（或）分泌。TNFRII基因第6外顯子196位點(diǎn)存在T→G堿基的突變（即ATG→AGG），這一突變導(dǎo)致基因產(chǎn)物多肽鏈中的一個(gè)甲硫氨酸（methionine，M）被精氨酸（methionine，R）取代，目前推測(cè)196G是一個(gè)失去功能的置換，其多態(tài)性影響TNFRII的轉(zhuǎn)錄，直接調(diào)控TNFRII的表達(dá)量，從而使TNFRII功能異常，可能導(dǎo)致該基因的個(gè)體表現(xiàn)過(guò)度的免疫反應(yīng)和過(guò)強(qiáng)的凋亡作用；同時(shí)，與TNFRII 196T相比，196G對(duì)IL－6的合成和分泌有明顯的促進(jìn)作用，并增加細(xì)胞毒性［11］。Till等［12］對(duì)TNFRⅡ196R轉(zhuǎn)染的人類(lèi)Hela細(xì)胞系進(jìn)行研究，證明TNFRⅡ196位的變異改變了NF－kB信號(hào)傳導(dǎo)通路，使TNF－α誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用增強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)胞增生及慢性炎癥性疾病的發(fā)生；從而提示TNFRⅡ196位點(diǎn)的多態(tài)性可能在許多不同的慢性疾病的發(fā)病中起作用。

目前已有多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)TNFR196位點(diǎn)基因突變與多種慢性病癥易感性相關(guān)，如自身免疫性疾病、感染性疾病、惡性腫瘤等疾病的進(jìn)程及嚴(yán)重程度相關(guān)。

Cipriano［13］等發(fā)現(xiàn)在社區(qū)獲得性肺炎患者中，攜帶TNFRSF1B＋196TG基因型的患者比攜帶TT或GG基因型患者死亡率低。近年的研究［14］顯示，TNFRII 196位點(diǎn)GG基因型與歐洲人群類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）患者存在關(guān)聯(lián)。此外，臺(tái)灣地區(qū)的CH Tung等人［15］的研究發(fā)現(xiàn) TNFRSF1B＋196T/G的單核苷酸多態(tài)性與強(qiáng)直性脊柱炎的發(fā)病有相關(guān)性。結(jié)締組織病患者多有多臟器累及，據(jù)報(bào)道，其中發(fā)生肺間質(zhì)病變（CTD－ILD）在臨床診療中并不少見(jiàn)。目前其發(fā)病機(jī)理不明，可能與血管炎有關(guān)，血管壁的免疫復(fù)合物激活補(bǔ)體釋放中性粒細(xì)胞趨化因子，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞在局部聚集釋放膠原酶及氧自由基，破壞肺實(shí)質(zhì)，造成肺泡炎，而晚期逐漸進(jìn)展為肺纖維化病變。目前認(rèn)為，不同結(jié)締組織病所致肺間質(zhì)病變的機(jī)理各有不同，但細(xì)胞因子在其纖維化的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用，如IL－1、IL－8、TGF－β1、TNF－α、胰島素樣生長(zhǎng)因子－α（IGF－α）等［16］，故它可能與IIP存在著共同的病理特點(diǎn)和致病基因。而國(guó)內(nèi)李霖等［17］的研究認(rèn)為T(mén)NFRⅡ196位點(diǎn)的基因多態(tài)性與中國(guó)漢族人群矽肺的發(fā)病可能無(wú)關(guān)。

目前TNFRII基因196位點(diǎn)多態(tài)性與IIP、IPF相關(guān)性的報(bào)道較少。本研究結(jié)果提示了中國(guó)漢族人群中TNFRⅡ196位點(diǎn)基因多態(tài)性可能與IIP，特別是與IPF的發(fā)生無(wú)關(guān)聯(lián)，但尚需做進(jìn)一步研究證實(shí)。

本研究結(jié)果表明中國(guó)漢族人群中TNFRII 196位點(diǎn)基因多態(tài)性可能與IIP、IPF的發(fā)生無(wú)關(guān)聯(lián)。但是本實(shí)驗(yàn)也存在一定的局限性：本研究中非IPF－IIP患者較少，故未能做非IPF組與IPF組的比較，因此今后需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究；另外，還需對(duì)IIP的環(huán)境危險(xiǎn)因素及遺傳因素進(jìn)行交互作用分析等研究工作，以期為IIP疾病的早期預(yù)防、早期發(fā)現(xiàn)及早期治療提供科學(xué)依據(jù)。

［1］中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì).特發(fā)性肺（間質(zhì)）纖維化診斷和治療指南（草案）［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2002，25（7）：387.

［2］American Thoracic Society/European Respiratory Society International Multi－disciplinary Consensus Classification of the Idiopathic Interstitial Pneumonias［J］.Am J Respir Crit Care Med，2002，165：277.

［3］Al－Ansari AS，Ollier WE，Villarreal J，et al.Tumor necrosis factor receptorⅡ（TNFRⅡ）exon 6polymorphism in systemic lupus erythematosus［J］.Tissue Antigens，2000，55（1）：97.

［4］Son JY，Kim SY，Cho SH，et al.TGF－β1T869Cpolymorphism may affect susceptibility to idiopathic pulmonary fibrosis and disease severity［J］.Lung，2013，191（2）：199.

［5］Pantelidis P，F(xiàn)anning GC，Wells AU，et al.Analysis of tumor necrosis factor－α，lymphotoxin－α，tumor necrosis factor receptor II，interleukin－6polymorphisms in patients with idiopathic pulmonary fibrosis［J］.Am J Respir Crit Care Med，2001，163：1432.

［6］Vasakova M，Sterclova M，Matej R，et al.IL－4gene polymorphisms and lung tissue markers in idiopathic pulmonary fibrosis［J］.Hum Immunol，2013，74（10）：1346.

［7］LIU RM.oxidative stress，plasminogen activalor inhibitor1and lung fibiosis［J］.Antioxid Redox Signal，2008，10（2）：303.

［8］Higgins DF，Kimura K，Bernhardt WM，et al.Hypoxia promotes fibrogenesis in vivo via HIF－1simulation of epithelial to mesenchymal transition［J］.J Clin Invest，2007，117（12）：3810.

［9］Wicovsky A1，Henkler F，Salzmann S，et al.Tumor necrosis factor receptor－associated factor－1enhances proinflammatory TNF receptor－2signaling and modifies TNFR1－TNFR2cooperation［J］.Oncogene，2009，28（15）：1769.

［10］Erickson，SLFJ，DeSauvage K.Kildy K，et al.1994.Decreased sensitivity to tumor necrosis factor but normal T－cell development in TNF receptor－2－deficient mice［J］.Nature，1994，372：560.

［11］Nakamura T，Kimoto Y，Mitoma H，et al.A functional M196R polymorphism of tumour necrosis factor receptor type 2is associated with systemic lupus erythematosus：a case－control study and a meta－analysis［J］.Ann Rheum Dis，2007，66（3）：320.

［12］Till A，Rosenstiel P，Krippner－Heidenreich A，et al.The met－196→arg variation of human tumor necrosis factor receptor 2（TNFR2）affects TNF－α－induced apoptosis by impaired NF－kB signaling and target gene expression［J］.J Biol Chem，2005，280（7）：5994.

［13］Cipriano C，Caruso C.Lio D，et al.The－308G/A polymorphism of TNF－a influences immunological parameters in old subjects affected by infectious diseases［J］.Int J Immunogenet，2005，32（1）：13.

［14］Song GG1，Bae SC，Lee YH.Associations between functional TNFR2 196M/R polymorphisms and susceptibility to rheuma－toid arthritis：a meta－analysis［J］.Rheumatol Int，2014，34（11）：1529.

［15］Tung CH，Lu MC，Huang KY，et al.Association between ankylosing spondylitis and polymorphism of tumour necrosis factor receptor II in Taiwanese patients［J］.Scand J Rheumatol，2009，38（5）：395.

［16］Jian XD，Guo GR.Clinical observation of rheumatoid arthritis associatesd interstitial lung disease patients and changes of serum cytokines thereof［J］.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2008，88（27）：1884.

［17］李 霖，余 晨，等.腫瘤壞死因子－α及其Ⅱ型受體基因多態(tài)性與矽肺［J］.中華勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病雜志，2004，22（5）：323.