RP-HPLC同時測定健陽片中3種成分

校軍彥，薛艷許，王小敏，劉新月

(神威藥業(yè)集團有限公司，河北 石家莊 051430)

·中藥工業(yè)·

RP-HPLC同時測定健陽片中3種成分

校軍彥*，薛艷許，王小敏，劉新月

(神威藥業(yè)集團有限公司，河北 石家莊 051430)

目的：建立同時測定健陽片中甘草苷、甘草酸、淫羊藿苷3種成分的RP-HPLC方法。方法：Dionex Acclaim C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流動相為乙腈-0.05%磷酸溶液；流速為0.8 mL·min-1，梯度洗脫；柱溫為30 ℃。分別對線性關系、精密度、重復性、穩(wěn)定性及加樣回收率進行考察。結(jié)果：被測定的3種指標成分中甘草苷在0.036 4～0.546 0 μg(r=0.999 8)、甘草酸在0.321 2～4.818 0 μg(r=0.999 7)、淫羊藿苷在0.384 0～5.760 0 μg(r=0.999 9)線性關系良好；平均加樣回收率在99.60%～100.76%(RSD≤2.0%)。結(jié)論：該方法簡便、準確，重復性好，可為健陽片的質(zhì)量控制提供參考。

健陽片；高效液相色譜法；甘草苷；甘草酸；淫羊藿苷

健陽片收載于《衛(wèi)生部藥品標準·中藥成方制劑》第八冊，由蜈蚣粉、淫羊藿提取物粉、甘草提取物粉及蜂王漿4味中藥組成。其作為純中藥制劑具有補腎益精、助陽興萎的功能，用于治療腎虛陽衰引起的陽萎、早泄等性功能低下癥，療效顯著。

原質(zhì)量標準中，僅采用總氮法對含氮量進行控制，對具有補脾益氣、調(diào)和藥性作用的甘草提取物只有鑒別控制，對具有補腎陽、強筋骨功能的淫羊藿提取物沒有控制。為了更好地控制健陽片質(zhì)量，有必要對原質(zhì)量標準進行升級。筆者查閱健陽片質(zhì)量標準研究的相關文獻，沒有發(fā)現(xiàn)使用HPLC同時測定多指標成分的相關報道，本試驗采用梯度洗脫法，首次建立了RP-HPLC同時測定甘草苷、甘草酸和淫羊藿苷3種指標成分的方法。結(jié)果表明，該方法簡便、快速、靈敏度高，為健陽片的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UltiMate 3000高效液相色譜儀(美國賽默飛世爾科技公司，包括四元泵、自動進樣器、UV檢測器)；賽托利斯CPA225D電子天平(十萬分之一)；舒美KQ300DA型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 材料

甘草苷、甘草酸銨、淫羊藿苷(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為111610-201106，110731-201317，110737-200415)；健陽片(神威藥業(yè)集團有限公司，規(guī)格：0.64 g，批號分別為1405152，1405162，1405172，1405182，1405192，1405202)；乙腈(色譜純，F(xiàn)isher公司)；超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Dionex Acclaim C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流動相：乙腈(A)-0.05%磷酸溶液(B)，按表1規(guī)定進行梯度洗脫；流速：0.80 mL·min-1；檢測波長：237 nm；柱溫30 ℃；進樣量：10 μL。

表1 梯度洗脫條件

2.2 混合對照品溶液制備

精密稱取對照品適量，加70%乙醇溶解，配成質(zhì)量濃度分別為0.018 2、0.160 6、0.192 0 mg·mL-1的甘草苷、甘草酸(甘草酸重量=甘草酸銨重量/1.020 7)、淫羊藿苷的混合對照品溶液，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液制備

取本品10片，除去糖衣，精密稱定，研細，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL稱重，超聲處理(功率為250 W，頻率為40 kHz)30 min，放置至室溫，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 空白對照溶液制備

根據(jù)健陽片的生產(chǎn)工藝標準，取蜂王漿、蜈蚣粉以及相關輔料制得健陽片陰性樣品，按照2.3項下方法制得空白對照溶液。

2.5 方法學考察

2.5.1 專屬性考察 按照2.1、2.2、2.3項下方法進行試驗，結(jié)果供試品中各待測成分色譜峰的分離度均大于1.5，對照品、樣品及空白對照品的色譜圖見圖1。

注：A.空白對照品；B.混合對照品；C.樣品；1.甘草苷；2.淫羊藿苷；3.甘草酸。圖1 健陽片及其對照品高效液相色譜圖

2.5.2 線性關系考察 分別精密吸取混合對照品溶液2、5、10、15、20、30 μL，注入液相色譜儀測定。以進樣量(μg)為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程，甘草苷：Y=36.523 5X+0.096 9，r=0.999 8，線性范圍0.036 4～0.546 0 μg；甘草酸：Y=12.909 1X+0.425 6，r=0.999 7，線性范圍0.321 2～4.818 0 μg；淫羊藿苷：Y=33.337 5X+1.265 8，r=0.999 9，線性范圍0.384 0～5.760 0 μg。結(jié)果表明各化合物在各自的進樣范圍內(nèi)線性關系良好。

2.5.3 精密度試驗 取同一供試品溶液，連續(xù)進樣6次，每次10 μL，記錄峰面積，甘草苷、甘草酸、淫羊藿苷峰面積的RSD分別為0.46%、0.53%、0.34%，表明精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8 h進樣10 μL測定，結(jié)果甘草苷、甘草酸、淫羊藿苷峰面積的RSD分別為0.79%、0.74%、0.56%，表明處理后的樣品中各待測成分在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5.5 重復性試驗 取同一批樣品(批號：1405152)，按2.3項下方法制備供試品溶液，進樣測定。結(jié)果甘草苷、甘草酸、淫羊藿苷含量分別為0.636 6、2.518 7、4.864 0 mg/片，RSD分別為0.65%、0.67%、0.56%，表明該方法重復性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗 精密稱取6份已知含量的樣品(批號：1405152)細粉適量，精密加入適量的甘草苷、甘草酸、淫羊藿苷對照品，按2.3項下方法制備所需溶液，按2.1項下色譜條件測定，計算回收率，結(jié)果見表2～4。

表2 甘草苷加樣回收率試驗

表3 甘草酸加樣回收率試驗

表4 淫羊藿苷加樣回收率試驗

2.6 樣品測定

取6批健陽片，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1色譜條件進樣測定，采用外標法計算，結(jié)果見表5。6批樣品批與批之間甘草苷、甘草酸、淫羊藿苷含量差異較小，可以有效地控制健陽片的質(zhì)量。

表5 健陽片中指標性成分的含量(n=2，mg/片)

3 討論

本次試驗比較了甲醇、乙醇、70%乙醇等不同提取溶劑的提取效果，結(jié)果70%乙醇對甘草苷、甘草酸、淫羊藿苷提取效率均較高；同時，考察了超聲提取法、加熱回流提取法，其中超聲提取法提取時間更短，產(chǎn)率也較高，可在室溫下進行，操作方便。故本文選用超聲提取法。

取3個對照品的混合溶液和供試品溶液，在200～400 nm進行紫外掃描，結(jié)果在237 nm波長下，3個成分均有較大吸收，且該波長下各成分分離度良好，故確定237 nm為檢測波長。

由于甘草苷、甘草酸、淫羊藿苷極性差異較大，等度洗脫難以實現(xiàn)同時分離，故采用梯度洗脫方式。試驗考查了多種流動相系統(tǒng)對分離的影響，結(jié)果乙腈-0.05%磷酸溶液系統(tǒng)梯度洗脫分離效果較好，基線平穩(wěn)，峰形對稱。

方法學研究表明，本方法具有良好的精密度、準確度和重復性，能夠同時測定甘草苷、甘草酸、淫羊藿苷的含量，可有效地控制健陽片的質(zhì)量。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

[2] 楊春靜.高效液相色譜法測定壯腎安神片中淫羊藿苷含量[J].中國藥業(yè)，2010，19(21)：31-32.

[3] 詹德智.HPLC測定巴仙蓯蓉強腎膠囊中淫羊藿苷含量[J].中國藥師，2009，12(12)：1750-1754.

[4] 張翔，韓繼永.HPLC法同時測定養(yǎng)血化瘀合劑中阿魏酸、甘草苷和甘草酸[J].中成藥，2011，33(04)622-625.

[5] 楊紅娟，郭偉斌，鄭淑鳳，等.RP-HPLC同時測定復方甘草片中4個成分的含量[J].藥物分析，2013，33(1)：141-145.

SimultaneousDeterminationofLiquiritin，GlycyrrhizicAcidandIcariininJianYangTabletsbyRP-HPLC

XIAOJunyan，XUEYanxu，WANGXiaomin，LIUXinyue

(ShinewayPharmaceuticalGroupLtd.，Shijiazhuang，Hebei051430，China)

Objective：To develop an RP-HPLC method for simultaneous determination of liquiritin，glycyrrhizic acid，icariin in Jian Yang Tablets.Methods：The chromatographic separation was achieved on a Dionex Acclaim C18column (250 mm×4.6 mm，5.0 μm) with acetonitrile-0.05% phosphate as mobile phases at the flow rate of 0.8 mL·min-1for gradient elution，and the column temperature was 30 ℃.Its linear relationship，precision，repeatability，stability，and recoveries were investigated.Results：The seven components were well separated and showed good linearity，such as liquiritin 0.036 4-0.546 0 μg(r=0.999 8)，glycyrrhizic acid 0.321 2-4.818 0 μg(r=0.999 7)，icariin 0.384 0-5.760 0 μg(r=0.999 9).The average recoveries were between 99.60% and 100.76% (RSD≤2.0%).Conclusion：The method is simple，accurate and repeatable.It can be applied to the quality control of Jian Yang Tablets.

Jian Yang Tablets；HPLC；liquiritin；glycyrrhizic acid；icariin.

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.6.019

2015-02-10)

*

校軍彥，工程師，研究方向：藥品質(zhì)量控制與檢驗；Tel：(0311)88030066-6595，E-mail:swyyxiy@163.com