ITS2序列鑒定十大功勞屬藥用植物△

明孟碟，張超，嚴(yán)緒華，劉美霞，夏葉，楊紅兵*，胡志剛*

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430065；2.武漢市中醫(yī)醫(yī)院，湖北 武漢 430010)

·專題·

ITS2序列鑒定十大功勞屬藥用植物△

明孟碟1，張超1，嚴(yán)緒華2，劉美霞1，夏葉1，楊紅兵1*，胡志剛1*

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430065；2.武漢市中醫(yī)醫(yī)院，湖北 武漢 430010)

目的：基于ITS2序列鑒定十大功勞屬藥用植物，以避免該屬物種藥用基原混亂。方法：收集十大功勞屬物種作為實(shí)驗(yàn)材料，采用改良的CTAB法提取總DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增、雙向測(cè)序和序列拼接，應(yīng)用MEGA 6.0對(duì)該屬13個(gè)物種43條ITS2序列進(jìn)行序列變異分析，計(jì)算種內(nèi)種間Kimura 2-parameter(K2P)距離，構(gòu)建系統(tǒng)鄰接(NJ)樹。結(jié)果：十大功勞屬13個(gè)物種43條ITS2序列分析結(jié)果表明，各物種種內(nèi)最大(平均)K2P距離均不大于種間最小(平均)K2P距離；系統(tǒng)NJ樹結(jié)果顯示，十大功勞屬其中9個(gè)物種各自聚為一支。結(jié)論：ITS2序列對(duì)十大功勞屬藥用植物具有較好鑒定效果，為該屬藥用植物的臨床用藥安全提供了分子依據(jù)。

十大功勞屬；ITS2序列；藥用植物；分子鑒定

小檗科Berberidaceae 十大功勞屬M(fèi)ahonia植物是一類常見的藥用、觀賞兩用的植物[1]，在我國(guó)分布有31種[2]，其中藥用22種[3]，主要以根、莖入藥?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》(2015年版)將該屬物種闊葉十大功勞Mahoniabealei(Fort.) Carr.和細(xì)葉十大功勞M.fortunei(Lindl.) Fedde.的干燥莖作為“功勞木”藥材的來源，功勞木含有生物堿、揮發(fā)油及總黃酮等多種有效成分[4-5]，具有清熱燥濕、瀉火解毒、滋陰益肺、兼補(bǔ)肝腎的功效[6]。由于該屬物種形態(tài)上極為相似，市場(chǎng)上存在用長(zhǎng)柱十大功勞M.duclouxianaGagnep.和小果十大功勞M.bodinieriGagnep.等充當(dāng)“功勞木”藥材使用的情況[7-8]，給用藥安全帶來隱患。運(yùn)用傳統(tǒng)的鑒定方法區(qū)分該屬物種存在一定的局限性[9-11]。如何快速、準(zhǔn)確地區(qū)分十大功勞屬藥用植物，對(duì)該屬藥用物種的資源開發(fā)和臨床應(yīng)用具有重要意義。

隨著分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，利用遺傳物質(zhì)DNA鑒定物種逐漸成為國(guó)際分子鑒定的研究熱點(diǎn)。DNA條形碼是利用基因組中一段公認(rèn)的、相對(duì)較短的DNA片段來實(shí)現(xiàn)物種鑒定的一種分子生物學(xué)技術(shù)，是近年來生物分類學(xué)的研究熱點(diǎn)[12]。該方法具有快速、準(zhǔn)確、不受樣品的形態(tài)性狀限制等優(yōu)點(diǎn)，適用于藥材和基原物種的鑒定，是傳統(tǒng)中藥鑒定方法的有效補(bǔ)充。陳士林等[13-17]在研究了6115個(gè)物種30 886個(gè)樣品的基礎(chǔ)上，提出了以ITS2為主體條形碼序列鑒定中藥材的方法體系，推動(dòng)中藥鑒定學(xué)邁入規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化基因鑒定時(shí)代。有關(guān)學(xué)者利用ITS2序列鑒定葶藶子[18]、羌活[19]、赤芍[20]、金沸草[21]、紅景天[22]以及谷物芽類[23]等藥材，均取得了較好的鑒定結(jié)果。本研究運(yùn)用ITS2序列對(duì)十大功勞屬藥用植物進(jìn)行分子鑒定，為十大功勞屬藥用植物的區(qū)分提供分子依據(jù)。

1 材料

本研究收集十大功勞屬8個(gè)物種32份實(shí)驗(yàn)材料，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室張秀橋教授鑒定，另從GenBank下載11條序列，經(jīng)查閱文獻(xiàn)證實(shí)其基原準(zhǔn)確可靠[24-26]。植物材料來源及GenBank下載序列信息詳見表1。

表1 十大功勞屬實(shí)驗(yàn)材料及GenBank下載序列信息

2 方法

2.1 DNA提取

取樣品的干燥葉片30 mg，用球磨儀(Retsch MM400)以30 Hz/s研磨2 min，利用改良的CTAB法[27]提取總DNA。

2.2 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

ITS2序列：正向引物 ITS2-2F(5′-ATGCGATAC-TTGGTGTGAAT-3′)，反向引物ITS2-3R(5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′)；反應(yīng)體系：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，正、反向引物(2.5 μmol·L-1)各1.0 μL，總DNA 2 μL，加滅菌雙蒸水至25 μL；擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s(進(jìn)行40個(gè)循環(huán))；72 ℃延伸10 min[28]。

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物情況，用ABI 3730XL測(cè)序儀(Applied Biosystems Co.，USA)對(duì)條帶單一且清晰的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序。

2.3 數(shù)據(jù)處理

所得序列使用CondonCode Aligner V 4.2.4(CondonCode Co.，USA)軟件進(jìn)行質(zhì)量分析和拼接；使用基于隱馬爾可夫模型的HMMer 注釋方法去除兩端5.8S和28S區(qū)段，獲得ITS2間隔區(qū)序列[29]。所有序列用MEGA(Molecular Evolutionary Genetics Analysis)6.0 進(jìn)行序列比對(duì)分析[30]，基于K2P(Kimura2-Parameter)雙參數(shù)模型計(jì)算種內(nèi)種間遺傳距離，采用鄰接(Neighbor Joining，NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹。

3 結(jié)果與分析

3.1 十大功勞屬藥用植物序列變異分析

十大功勞屬13個(gè)物種43條序列比對(duì)后長(zhǎng)度為224 bp，共產(chǎn)生28個(gè)變異位點(diǎn)；細(xì)梗十大功勞與寬苞十大功勞、細(xì)葉十大功勞與北江十大功勞之間未出現(xiàn)種間變異，其它物種均存在種間變異位點(diǎn)。

3.2 十大功勞屬藥用植物遺傳距離分析

運(yùn)用K2P模型對(duì)十大功勞屬物種ITS2序列進(jìn)行遺傳距離分析，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，細(xì)葉十大功勞與北江十大功勞、寬苞十大功勞與細(xì)梗十大功勞兩組序列無變異位點(diǎn)，故其種內(nèi)最大K2P距離均等于種間最小K2P距離，其它各物種的種內(nèi)最大(平均)K2P距離均小于其與其它物種種間最小(平均)K2P距離。

表2 十大功勞屬各物種種內(nèi)及與其它物種種間K2P距離

3.3 十大功勞屬藥用植物系統(tǒng)NJ 樹鑒定

基于ITS2序列，應(yīng)用鄰接(NJ)法構(gòu)建十大功勞屬藥用植物的系統(tǒng)聚類樹，見圖1。從系統(tǒng)NJ樹看出，細(xì)葉十大功勞與北江十大功勞聚為一支，寬苞十大功勞與細(xì)梗十大功勞聚為一支；除此以外，該屬其它物種各自聚為一支，各物種間能明顯區(qū)分開。

注：bootstrap 1000次重復(fù)，僅顯示支持率≥50%的分支圖1 基于ITS2 序列構(gòu)建的十大功勞屬藥用植物鄰接(NJ)樹

4 討論

根據(jù)文獻(xiàn)記載[3]，我國(guó)十大功勞屬植物中具有藥用價(jià)值的有22種，它們無論在植物形態(tài)還是藥材形狀方面都具有一定的相似性，易造成混用。采用DNA條形碼這種快速、有效、準(zhǔn)確的鑒定方法對(duì)我國(guó)十大功勞屬藥用植物進(jìn)行鑒定，可有效解決物種基原混亂等問題，為合理開發(fā)利用我國(guó)十大功勞屬植物資源提供理論依據(jù)。

基于MEGA 6.0軟件的序列變異分析結(jié)果顯示，細(xì)葉十大功勞與北江十大功勞間未產(chǎn)生變異位點(diǎn)，寬苞十大功勞與細(xì)梗十大功勞間未產(chǎn)生變異位點(diǎn)，因此基于變異位點(diǎn)無法區(qū)分這兩組物種；這一結(jié)果在兩組物種間的K2P距離和NJ 樹分析結(jié)果中也得到了驗(yàn)證。目前十大功勞屬藥用植物的鑒定研究不多，運(yùn)用DNA分子鑒定技術(shù)對(duì)該屬藥用植物鑒定，針對(duì)無法區(qū)分的細(xì)葉十大功勞與北江十大功勞、寬苞十大功勞與細(xì)梗十大功勞兩組物種，可考慮篩選其它序列或復(fù)合序列進(jìn)行分子鑒定。除這兩組物種外，該屬其它各物種種間均存在變異位點(diǎn)；各物種種內(nèi)最大(平均)K2P距離均小于其與其它物種種間最小(平均)K2P距離；系統(tǒng)NJ 樹結(jié)果表明，各物種均各自聚為一支，相互之間能很好地區(qū)分開。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，ITS2序列可以較好地鑒定十大功勞屬藥用植物。

十大功勞屬藥用植物種類繁多，形態(tài)相似，給藥材的識(shí)別和流通帶來了困難。為更便捷地實(shí)現(xiàn)對(duì)該屬藥用植物的鑒定，可將中藥材二維DNA 條形碼技術(shù)運(yùn)用于藥材的鑒定中來。中藥材二維DNA條形碼[31]是指基于開源代碼QR Code(quick response code) 將DNA條形碼技術(shù)與二維碼技術(shù)相結(jié)合，以達(dá)到快速、穩(wěn)定、便捷地鑒定中藥材的目的。為此，可在本研究的基礎(chǔ)上，將各物種的ITS2序列轉(zhuǎn)換為二維碼，通過掃描識(shí)讀，以實(shí)現(xiàn)對(duì)該屬藥用植物的快速、準(zhǔn)確識(shí)別。

綜上，該研究所采用的各種分析方法都表明，ITS2序列可用于鑒定十大功勞屬藥用植物，為該屬藥用植物的區(qū)分和臨床用藥安全提供了分子依據(jù)。

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IdentificationofGenusMahoniaMedicinalPlantsBasedonITS2Sequence

MINGMengdie1，ZHANGChao1，YANXuhua2，LIUMeixia1，XIAYe1，YANGHongbing1*，HUZhigang1*

(1.HubeiUniversityofChineseMedicine，Wuhan430065，China；2.WuhanHospitalofTraditionalChineseMedicine，Wuhan430010，China)

Objective：To Identify the genusMahoniamedicinal plants，based on ITS2 sequences.Methods：Total genomic DNA was extracted from experimental materials by the improved CTAB method.The ITS2 sequences were obtained after PCR amplification，bidirectional sequencing and sequence assembly.The genetic distances based on the Kimura 2-parameter(K2P)model，variable sites and neighbor-joining(NJ)phylogenetic tree were computed by MEGA 6.0.Results：Based on ITS2 sequences，the study indicated that the intraspecific maximum and average genetic distances were no greater than the interspecific ones.In all of the 13 samples，9 of them were respectively clustered into a single branch in the NJ phylogenetic tree.Conclusion：ITS2 sequence has a good effect on the identification of the genusMahoniamedicinal plants，which can provide basis to ensure the safety of medicines of the genusMahoniamedicinal plants.

Mahonia；ITS2 sequence；medicinal plants；molecular identification

2015-08-08)

重大新藥創(chuàng)制國(guó)家重大科技專項(xiàng)子課題(2014ZX09304307001-021)；湖北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2015BCA275)

*

楊紅兵，教授，研究方向：中藥品種、質(zhì)量與資源研究；Tel：027-68890106，E-mail：yanghb321@126.com；胡志剛，副教授，研究方向：中藥資源與分子鑒定；Tel：027-68890106，E-mail：zghu0608@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.10.001