北京地區(qū)野生柴胡種質(zhì)資源的ISSR研究△

趙香妍，劉長利，薛文峰，張夏楠，羅容

(首都醫(yī)科大學(xué) 中醫(yī)藥學(xué)院，中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點實驗室，北京 100069)

·專題·

北京地區(qū)野生柴胡種質(zhì)資源的ISSR研究△

趙香妍，劉長利*，薛文峰，張夏楠，羅容

(首都醫(yī)科大學(xué) 中醫(yī)藥學(xué)院，中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點實驗室，北京 100069)

目的：通過ISSR分子標(biāo)記技術(shù)考察北京地區(qū)野生柴胡不同種質(zhì)資源之間的親緣關(guān)系。方法：從43條引物中篩選出8條合適的引物，對北京地區(qū)不同產(chǎn)地采集的15份野生柴胡種質(zhì)資源進(jìn)行ISSR分析，構(gòu)建聚類系統(tǒng)樹狀圖。結(jié)果：8條引物共擴(kuò)增出130條條帶，其中多態(tài)性條帶114條，占87.7%，聚類分析顯示北京地區(qū)野生柴胡遺傳多樣性較高，并存在明顯的種內(nèi)遺傳變異。結(jié)論：北京地區(qū)野生柴胡呈現(xiàn)一定的地域性分布趨勢，應(yīng)加以保護(hù)，初步認(rèn)為百花山山腰及山腳柴胡值得推廣種植，研究為北京地區(qū)柴胡種質(zhì)親緣關(guān)系研究及栽培品種的選育奠定了基礎(chǔ)。

柴胡；ISSR；北京地區(qū)；種質(zhì)資源；親緣關(guān)系

柴胡(Bupleuri Radix)是被中國藥典所收錄的傳統(tǒng)常用大宗中藥材之一，具有疏散退熱，疏肝解郁，升舉陽氣等功效。藥典規(guī)定柴胡為傘形科柴胡屬植物柴胡BupleurumchinenseDC.或狹葉柴胡BupleurumscorzonerifoliumWilld.的干燥根[1]。但柴胡屬作為傘形科最大的屬，其品種繁多，文獻(xiàn)記載表明[2-4]市場流通的商品柴胡竟達(dá)12種之多，依次為北柴胡、狹葉柴胡、膜緣柴胡、錐葉柴胡、小葉黑柴胡、黑柴胡、霧靈柴胡、銀州柴胡、秦嶺柴胡、興安柴胡等，可見各地藥用柴胡的品種非常混亂，且野生柴胡資源正在減少，市場需求又在不斷擴(kuò)大，因此，迫切需要開展野生道地柴胡的種質(zhì)研究及良種選育工作，運(yùn)用分子技術(shù)研究種質(zhì)之間的遺傳多樣性及親緣關(guān)系，有助于優(yōu)良種質(zhì)的篩選及培育。

ISSR(簡單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性，Inter Simple Sequence Repeat)具有快速、高效、高遺傳多樣性、高重復(fù)性、高穩(wěn)定性等特點，其結(jié)合了RAPD(隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記，Random Amplified Polymorphic DNA)及SSR(微衛(wèi)星標(biāo)記，Simple Sequence Repeat)分子標(biāo)記的優(yōu)點，是近些年分子生物學(xué)的研究熱點。Zhang L等[5]就利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對87個油桐樹樣本進(jìn)行了遺傳關(guān)系研究，結(jié)果顯示樣本呈明顯的地理分化。Medhi K等[6]應(yīng)用RAPD及ISSR兩種分子標(biāo)記技術(shù)研究了三種花椒屬植物的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)ISSR具有較高的多態(tài)性條帶比例及較多的擴(kuò)增條帶數(shù)。Zhan Q Q等[7]利用ISSR和SSR分子標(biāo)記構(gòu)建北柴胡遺傳圖譜，構(gòu)建了包含13個連鎖群、80個位點的首張北柴胡遺傳圖譜，為北柴胡性狀基因定位及優(yōu)種選育奠定了基礎(chǔ)。

目前，湖北?？?、陜西、山西等地柴胡種質(zhì)ISSR親緣關(guān)系研究均有報道，但迄今未見北京地區(qū)柴胡種質(zhì)資源ISSR研究的報道，且歷史上北京地區(qū)燕山、太行山一帶是道地藥材“北柴胡”的主要產(chǎn)區(qū)之一，經(jīng)本草考據(jù)和產(chǎn)地調(diào)查，其原植物來源、外觀性狀和內(nèi)在質(zhì)量均優(yōu)于其它[8]，因此，北京地區(qū)柴胡優(yōu)良種質(zhì)篩選與研究顯得尤為重要。實驗以北京產(chǎn)道地柴胡為材料，通過ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對比考察柴胡種內(nèi)及種間的親緣關(guān)系，為北京地區(qū)柴胡優(yōu)良種質(zhì)篩選及種苗繁育奠定理論基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Veriti PCR儀(美國ABI)，DYY-6D電泳系統(tǒng)(北京市六一儀器廠)，離心機(jī)(美國，scilogex)，紫外凝膠成像分析儀(法國，VILBER LOURMAT)，MM400混合型球磨儀(德國，Retsch)，微量移液器(德國，BRAND)。

1.2 試劑

DNA提取所用試劑購自天根生化科技(北京)有限公司，Taq DNA聚合酶(Takara)，100 bp DNA Ladder(NEB)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 實驗材料

實驗所用柴胡樣品共計15份(表1)，所有樣品均于2014年6～9月采收于北京房山、延慶、門頭溝等京郊山區(qū)。樣品由北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授和首都醫(yī)科大學(xué)劉長利副教授鑒定。各產(chǎn)地樣品分別取其幼嫩無蟲害的葉片，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 實驗材料及來源

2 試驗方法

2.1 基因組DNA提取

取植物新鮮葉片約30 mg，液氮研磨成粉末，利用植物基因組提取試劑盒提取樣本的總DNA。提取的DNA于1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測10 min，以2000 bp DNA Marker 為分子標(biāo)記，在凝膠掃描儀下觀察并拍照。

2.2 ISSR-PCR

實驗中ISSR-PCR 反應(yīng)體系為：25 μL反應(yīng)體系：含有10×PCR buffer 2.5 μL，MgCl2(25 mmol·L-1)2.5 μL，dNTP mix(2.5 mmol·L-1)3.5 μL，Taq DNA聚合酶(5 U·μL-1)0.2 μL，引物(10 pmol·μL-1)1.5 μL，DNA模板2.0 μL。擴(kuò)增程序為：預(yù)變性94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，52 ℃(因引物不同而異[9])45 s，72 ℃ 2 min，45個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。以ddH2O為陰性對照。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳分離檢測(電壓83 V，120 min)在凝膠掃描儀下觀察并拍照(見圖1)。

2.3 數(shù)據(jù)分析

對產(chǎn)生了多態(tài)性擴(kuò)增的電泳結(jié)果統(tǒng)計各樣品的電泳條帶，按相同遷移位置上有擴(kuò)增條帶(不論強(qiáng)弱)計為1，無帶計為 0，得到全部樣品的ISSR圖譜的0/1數(shù)據(jù)矩陣，用NTSYS2.10軟件計算個體間的相似系數(shù)，進(jìn)行UPGMA聚類分析，構(gòu)建聚類系統(tǒng)樹狀圖。

M為100 bp DNA ladder，1～15為材料編號同表1，0為陰性對照圖1 引物808 ISSR擴(kuò)增結(jié)果

3 結(jié)果

3.1 引物篩選

利用4個樣本對43條加拿大British Columbia大學(xué)提供的ISSR引物進(jìn)行篩選，共初步篩選出15條可擴(kuò)增出3條以上電泳條帶的引物作為實驗有效引物，再利用全部樣本進(jìn)行復(fù)篩，最終，確定8條有效引物(見表2)。

表2 有效引物及其擴(kuò)增結(jié)果

3.2 野生柴胡ISSR遺傳多樣性

從初篩的15條引物中篩選出8條多態(tài)性好、條帶清晰的引物，用于15個實驗樣本的PCR擴(kuò)增，大部分?jǐn)U增片段大小在100～1500 bp。表2表明，8條引物共擴(kuò)增出130條條帶，其中多態(tài)性位點114個，每個引物擴(kuò)增位點為14～20個，平均16.25個，其中多態(tài)性位點8～18個，平均14.25個，多態(tài)性比率為87.7%。這說明供試樣本存在較大的遺傳變異。

3.3 遺傳相似系數(shù)

遺傳相似系數(shù)是評價物種及居群間親緣關(guān)系的重要指標(biāo)，其值越大，說明親緣關(guān)系越近，反之，則越小。15份北京野生柴胡的樣本之間相似系數(shù)在0.571～0.813之間(見表3)，其中，來自房山區(qū)將軍坨的4號北柴胡樣本與延慶松山自然保護(hù)區(qū)的10號北柴胡樣本親緣關(guān)系最近，相似系數(shù)為0.813。而北京市房山區(qū)百草畔山頂草甸的3號霧靈柴胡樣品則與房山區(qū)蒲洼鄉(xiāng)富合村的5號北柴胡樣本親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，遺傳相似系數(shù)為0.571。說明同一物種生活在相近環(huán)境中，親緣關(guān)系較近，不同物種生活在不同生態(tài)環(huán)境中，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。且15份樣本均采自北京各郊區(qū)，地理位置較近，所以樣本親緣關(guān)系大都較近，而由于品種、生活環(huán)境或基因交流等原因致使一些樣本親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

表3 ISSR標(biāo)記15份樣本之間的相似系數(shù)和遺傳距離

注：下三角為相似系數(shù)，上三角為遺傳距離。

3.4 北京地區(qū)野生柴胡聚類分析

利用ISSR標(biāo)記數(shù)據(jù)計算15份野生柴胡間的遺傳相似系數(shù)，并采用UPGMA法構(gòu)建了北京地區(qū)野生柴胡的遺傳關(guān)系聚類圖(圖2)，顯示實驗樣本可分為兩大組，第一組共14份樣品，包括除5號樣品的所有樣品，并分為二個亞類，第一亞類包括1號來自房山區(qū)六合，4號來自房山將軍坨，10號、11號來自延慶松山，12號來自平谷區(qū)鎮(zhèn)羅營鎮(zhèn)，6號、8號、7號來自門頭溝區(qū)百花山，9號來自海淀區(qū)西山森林公園，3號來自房山百草畔。第二亞類包括來自房山區(qū)十渡孤山寨的2號樣品，來自平谷區(qū)大華山鎮(zhèn)與王辛莊鎮(zhèn)的13、14號樣品，以及來自密云霧靈山的15號樣本。而第二組則只有來自房山區(qū)蒲洼鄉(xiāng)富合村的5號樣本。

圖2 15份北京野生柴胡聚類圖

4 討論

葛亞瑩等[10]利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對41個麗穗鳳梨品種進(jìn)行遺傳多樣性研究，12條引物共擴(kuò)增出132個位點，其中多態(tài)性位點125個，多態(tài)位點百分率達(dá)94.70%，表明ISSR標(biāo)記具有較高的多態(tài)性檢測水平。劉君等[11]則對9種狗牙根進(jìn)行鑒定分析，結(jié)果顯示ISSR可有效揭示9種狗牙根的親緣關(guān)系并可用于構(gòu)建指紋圖譜。Feicui Zhao等[12]利用RAPD和ISSR技術(shù)研究烏頭屬4種植物的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)兩種方法均適用于烏頭屬植物的分析，但其中ISSR更具有較高的多態(tài)性。Jun Liu等[13]則利用ISSR及SRAP(相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性，Sequence-Related Amplified Polymorphism)兩種方法分析89份香菇植株的遺傳多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這2種標(biāo)記都能揭示材料間較高的遺傳多樣性，而且ISSR標(biāo)記的多態(tài)性又高于SRAP標(biāo)記。研究表明ISSR是一種有效的揭示品種間遺傳多樣性的實驗技術(shù)，實驗中利用8條引物，擴(kuò)增出130條條帶，其中多態(tài)性位點114個，每個引物平均擴(kuò)增位點16.25個，多態(tài)性比率為87.7%，表明北京地區(qū)柴胡種質(zhì)資源存在較大的遺傳變異，實驗研究結(jié)果為北京地區(qū)野生柴胡種質(zhì)親緣關(guān)系研究奠定了基礎(chǔ)。

Xu L等[14]利用ISSR和SP-SRAP(單引物相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性，Single Primer-Sequence Related Amplification Polymorphism)研究100份黑粉菌的親緣關(guān)系，發(fā)現(xiàn)生態(tài)環(huán)境的特異性質(zhì)在樣品分化過程中起到了重要的作用。Yu J等[15]研究15個居群的長芒草的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)其與地理距離有很大關(guān)系，并認(rèn)為ISSR分子標(biāo)記技術(shù)可有效可靠地評價長芒草的遺傳多樣性。盧萍等[16]則利用ISSR技術(shù)研究了6個種群的小花棘豆的遺傳多樣性，聚類結(jié)果表明，生態(tài)地理條件相近的種群會優(yōu)先聚集。遺傳聚類結(jié)果顯示，部分結(jié)果與上述研究結(jié)果相似，6號、7號、8號均來源于門頭溝百花山，9號采自海淀區(qū)西山森林公園，其生長環(huán)境與百花山山腳環(huán)境相類似，所以顯示出較近的親緣關(guān)系，13、14、15號樣品均來源于北京平谷區(qū)、密云區(qū)，也具有較高的相似性，表明生態(tài)環(huán)境相近的聚為一類。

房山百草畔的3號霧靈柴胡樣本與延慶松山的11號北柴胡樣本聚在一起，其原因可能由于柴胡雌雄蕊異熟的特性導(dǎo)致其異交授粉為主的繁殖方式，一定程度上促進(jìn)了居群間基因交流，進(jìn)而出現(xiàn)基因漸滲現(xiàn)象，使得柴胡屬植物的鑒定存在困難，以此，采用多種遺傳分子標(biāo)記方法與傳統(tǒng)性狀鑒定相結(jié)合的方法確定植物基源更為可靠。此外，來源于房山區(qū)蒲洼鄉(xiāng)富合村的5號樣本則可能是采集地地勢相對較高，且地處偏僻的山區(qū)，基因交流相對較少，所以自成一支。

由于經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使，人們對于野生柴胡資源的亂采濫挖現(xiàn)象日益嚴(yán)重，從而使得野生柴胡資源遭到嚴(yán)重破壞，藥用資源得不到保障。另外，各地藥用柴胡來源的復(fù)雜性造成了柴胡質(zhì)量的不穩(wěn)定性，以至于臨床療效受到嚴(yán)重影響?；谝陨蠁栴}，開展柴胡藥材的質(zhì)量研究及人工栽培優(yōu)良種質(zhì)篩選尤為重要，而ISSR分子標(biāo)記技術(shù)則能很好的揭示品種間的親緣關(guān)系，并為栽培品種的選育奠定基礎(chǔ)。賈金萍等[17]通過對北柴胡樣本的皂苷含量、指紋圖譜及AFLP(擴(kuò)增片段長度多態(tài)性，Amplified Fragment Length Polymorphism)分子標(biāo)記研究，認(rèn)為柴胡的化學(xué)表型差異與其遺傳差異具有一定的相關(guān)性，且AFLP分子標(biāo)記法可有效區(qū)分不同的柴胡種群。而也有學(xué)者[18]表示皂苷含量較高且遺傳多樣性豐富的種質(zhì)資源更具有推廣的價值。實驗結(jié)果顯示，皂苷含量較高的西山森林公園的9號樣本(課題組已測定)與門頭溝百花山的7號、8號樣本親緣關(guān)系較近(見表3)，初步認(rèn)為百花山山腳與山腰的柴胡種質(zhì)遺傳多樣性較好，值得推廣種植。此外，柴胡屬植物由于基因漸滲出現(xiàn)的資源混亂的復(fù)雜問題，則可利用ISSR等分子標(biāo)記技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)藥材進(jìn)行親緣關(guān)系研究，并與形態(tài)鑒定結(jié)合的方式進(jìn)行鑒定，使得結(jié)果更加可靠，進(jìn)而提高用藥效果。

5 結(jié)論

利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對北京地區(qū)野生柴胡的親緣關(guān)系研究中，15份樣本擴(kuò)增出130條條帶，其中多態(tài)性位點114個，每個引物平均擴(kuò)增位點16.25個，相似系數(shù)在0.571～0.813之間，表明北京地區(qū)野生柴胡具有較高的遺傳多樣性，并同時存在一定的種內(nèi)遺傳變異。而利用UPGMA聚類分析，則將15份材料進(jìn)行分類，聚類結(jié)果呈現(xiàn)出一定的地域性分布趨勢。綜上，北京地區(qū)野生柴胡應(yīng)加以保護(hù)，初步認(rèn)為百花山山腰及山腳柴胡值得推廣種植，研究為今后開展北京地區(qū)柴胡種質(zhì)親緣性研究及栽培品種的選育奠定了基礎(chǔ)。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：263.

[2] 舒璞，袁昌齊，佘孟蘭，等.中國柴胡屬藥用植物的數(shù)量分類研究(Ⅰ)[J].西北植物學(xué)報，1998，18(2)：277-283.

[3] 潘勝利.中藥柴胡的藥源調(diào)查及商品鑒定[J].中藥材，1996，19(5)：231-234.

[4] 王有志，張亞云.中藥柴胡的物種調(diào)查和鑒定[J].中國藥學(xué)雜志，1994，29(1)：16-18.

[5] Zhang L，Lu S，Sun D，et al.Genetic variation and geographical differentiation revealed using ISSR markers in tung tree，Vernicia fordii[J].Journal of genetics，2014：1-5.

[6] Medhi K，Sarmah D K，Deka M，et al.High gene flow and genetic diversity in three economically important Zanthoxylum Spp.of Upper Brahmaputra Valley Zone of NE India using molecular markers[J].Meta gene，2014，2：706-721.

[7] Zhan Q Q，Sui C，Wei J H，et al.Construction of genetic linkage ma Pof Bupleurum chinense DC.using ISSR and SSR markers[J].Acta pharmaceutica Sinica，2010，45(4)：517-523.

[8] 魏建和，陳士林，魏淑秋，等.北柴胡適生地分析及數(shù)值區(qū)劃研究[J].世界科學(xué)技術(shù)——中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2006，7(6)：125-129.

[9] Sui C，Wei J H，Chen S L，et al.Establishment and optimization of ISSR-PCR reaction system for Bupleurum chinense DC[J].LiShiZhen Med Mater Med Res (時珍國醫(yī)國藥)，2008，19(8)：1837-1839.

[10] 葛亞英，張飛，沈曉嵐，等.麗穗鳳梨 ISSR 遺傳多樣性分析與指紋圖譜構(gòu)建[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45(4)：726-733.

[11] 劉君，趙琴，楊志民.ISSR分子標(biāo)記對9種狗牙根的鑒定分析[J].草業(yè)學(xué)報，2012，21(6)：159-165.

[12] Zhao F C，Nie J H，Chen M Z，et al.Assessment of genetic characteristics ofAconitumgermplasms in Xinjiang Province (China) by RAPD and ISSR markers.[J].Biotechnology & Biotechnological Equipment，2008，8：1837-1839.

[13] Liu J，Wang Z R，Li C，et al.Evaluating genetic diversity and constructing core collections of Chinese Lentinula edodes cultivars using ISSR and SRA Pmarkers.[J].Journal of Basic Microbiology，2015，55(6)：749-760.

[14] Xu L，Lu Y，You Q，et al.Biogeographical variation and population genetic structure of Sporisorium scitamineum in Mainland China：insights from ISSR and SP-SRA Pmarkers.[J].The Scientific World，2014.

[15] Yu J，Jing Z B，Cheng J M.Genetic diversity and population structure of Stipa bungeana，an endemic species in Loess Plateau of China，revealed using combined ISSR and SRA Pmarkers.[J].Genetics and Molecular Research，2015，29(2)：309-314.

[16] 盧萍，趙萌莉，韓國棟，等.內(nèi)蒙古小花棘豆遺傳多樣性的ISSR分析[J].西北植物學(xué)報，2007，27(6)：1102-1107.

[17] 賈金萍，劉曉節(jié)，邢婕等.北柴胡藥材種質(zhì)資源的化學(xué)與遺傳分析[A]；第十屆全國中藥和天然藥物學(xué)術(shù)研討會論文集[C]；2009年.

[18] 楊旻，白楊，胡繼鷹.?？挡窈N質(zhì)資源的ISSR研究[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐，2013，27(2)：25-27.

ISSRResearchonGermplasmofBupleurumchinenseDC.inBeijing

ZHAOXiangyan，LIUChangli*,XUEWenfeng，ZHANGXianan,LUORong

(SchoolofTraditionalChineseMedicine，CapitalMedicalUniversity，BeijingKeyLabofTCMCollateralDiseaseTheoryResearch，Beijing100069，China)

Objective：To assess population genetic diversity of different kinds of individuals ofBupleurumchinensein Beijing area by inter simple sequence repeat (ISSR) technique.Methods：Eight appropriate ones were selected from a total of forty-three primers for ISSR PCR amplification to analyse theBupleurumin Beijing area and draw dendrograms by using genetic distance UPGMA method.Results：A total of 130 bands and 114 polymorphic bands were amplified by 8 primers，the polymorphic loci accounted for 87.7%.The cluster analysis showed that genetic diversity was high inBupleurum， the intraspecific genetic variation was obvious.Conclusion：The distribution ofBupleurumgermplasm in Beijing exhibited a certain regional characteristics.It is imperative to strengthen the protection ofBupleurumwild resources.The plants in the foot and hillside of Baihuashan is good for cultivating.This study laid a foundation for the research of relationship betweenBupleurumand the breeding of cultivars.

Bupleurum；ISSR；Beijing area；germplasm；genetic relationship

2015-07-01)

北京市自然科學(xué)基金資助項目(6142002)；首都中醫(yī)藥研究專項(14ZY04)

*

劉長利，副教授，研究方向：中藥材規(guī)范化生產(chǎn)及其藥材質(zhì)量調(diào)控研究；Tel：(010)83911633，E-mail：lcl74@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.10.004