果膠酶解法提取陳皮中橙皮苷的工藝研究△

許玲玲，楊曉東，李群力，陳貴穎，盛柳青，陳菲，蔡蕓蕓

(金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，浙江 金華 321007)

·中藥工業(yè)·

果膠酶解法提取陳皮中橙皮苷的工藝研究△

許玲玲，楊曉東*，李群力，陳貴穎，盛柳青，陳菲，蔡蕓蕓

(金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，浙江 金華 321007)

目的：研究酶解法提取陳皮中橙皮苷的工藝條件。方法：在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法對提取工藝進行優(yōu)化。結(jié)果：最佳工藝條件液料比為40∶1(mL·g-1)；果膠酶用量為3.2%；pH值為3.0；酶解溫度為45 ℃；酶解時間為2.3 h。在此條件下，橙皮苷提取率理論值為5.45%，實測值為5.40%。結(jié)論：酶解法提取橙皮苷操作簡單、提取率高，有利于企業(yè)大生產(chǎn)，但存在著提取時間長、溶劑用量大等缺點。

酶解法；響應(yīng)面分析；陳皮；橙皮苷；提取

橙皮苷具有降低血管脆性、降血壓、抗過敏、抑制腫瘤、抗氧化和清除自由基等作用[1-3]，在臨床上用于心血管系統(tǒng)疾病的輔助治療[4]，也可用于醫(yī)藥工業(yè)中制藥的原料，橙皮苷還作為天然抗氧化劑用于食品和化妝品行業(yè)[5]。

從陳皮中提取橙皮苷通常采用熱水提取、醇回流提取、堿提酸沉等方法[6-7]，這些方法都是采用化學(xué)溶劑浸潤、溶解藥材中的有效成分，雖然操作簡單，但提取不完全，會造成一些橙皮苷殘留在果渣里，使用的化學(xué)試劑也易造成環(huán)境污染[8]。近年來有報道[9-10]微波和超聲波輔助提取橙皮苷，雖然這兩種方法提取時間短，但超聲法噪音很大，微波法有輻射，它們對提取設(shè)備有很高的要求，這在一定程度上限制了其在企業(yè)大生產(chǎn)中的應(yīng)用。

為了探索一種操作簡單、產(chǎn)率高，有利于企業(yè)大生產(chǎn)的橙皮苷提取新方法，我們采用酶解法破壞藥材細(xì)胞壁和細(xì)胞間的果膠，使橙皮苷充分溶解出來，提高橙皮苷的提取率。先通過單因素試驗考察酶解法各因素對橙皮苷提取率的影響，再采用響應(yīng)面分析法對酶解工藝進行優(yōu)化，得到最佳工藝。

1 材料與儀器

1.1 材料

陳皮(金華市三溪堂國藥館，四川產(chǎn))；果膠酶(天津市諾奧科技發(fā)展有限公司)；橙皮苷對照品(中國食品藥品鑒定研究院，批號：110721-201115)；甲醇為色譜純；水為純凈水；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

SP-2012UV PC紫外可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司)；Waters高效液相色譜儀(2487紫外分光檢測器)；1004 型電子天平(上海天平儀器廠)；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)。

2 方法

2.1 酶解法提取陳皮中的橙皮苷

取適量陳皮粗粉置于錐形瓶中，加入蒸餾水和酶，調(diào)節(jié)pH值，置于恒溫水浴箱中酶解一段時間，取出，放冷過濾，得橙皮苷提取液。

2.1.1 單因素試驗考察酶解法影響因素 通過單因素試驗，分別考察酶的用量、酶解時間、酶解溫度、pH值、液料比等因素對橙皮苷提取率的影響，每個處理重復(fù)3次，取平均值。

2.1.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，選取對橙皮苷提取率影響較大的3個因素，進行中心組合試驗設(shè)計，做多組試驗。然后采用Design-Expert 8.0.5.0程序，對數(shù)據(jù)處理，進行響應(yīng)面分析優(yōu)化，最終得到優(yōu)化工藝參數(shù)。

2.2 橙皮苷含量測定方法

2.2.1 對照品溶液的配制 精確稱取橙皮苷對照品10.1 mg，加入適量甲醇，超聲溶解，用甲醇定容到25 mL，配制成質(zhì)量濃度為0.404 mg·mL-1的橙皮苷對照品溶液。

2.2.2 陳皮樣品液的制備 將酶解工藝提取所得的溶液，稀釋適當(dāng)倍數(shù)，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.3 檢測波長的確定 以空白溶劑甲醇為參比溶液，通過紫外可見分光光度計對橙皮苷對照品溶液進行掃描(200～400 nm)，同時，對陳皮樣品溶液進行光譜掃描。結(jié)果顯示，橙皮苷對照品溶液和陳皮樣品液都在285 nm處有強吸收峰，因此取285 nm為檢測波長。

2.2.4 色譜條件 色譜柱：Waters Symmetry C18(250 mm×4.6 mm，5μm)；流動相：甲醇-2%冰醋酸溶液(34∶66)；流速：0.5 mL·min-1；檢測波長：285 nm；溫度為室溫；進樣量：20 μL；橙皮苷保留時間為5.1 min。

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密吸取橙皮苷對照品溶液1、2、3、4、5 mL于10 mL的容量瓶中，用甲醇定容，配成質(zhì)量濃度分別為40.4、80.8、121.2、161.6、202 μg·mL-1的一系列對照品溶液，進行HPLC測定。在285 nm處測峰面積，以橙皮苷對照品溶液的濃度X(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，以其峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=185 220X-25 642，r=0.999，線性范圍為40.4～202 μg·mL-1。橙皮苷對照品溶液的HPLC圖見圖1。

圖1 橙皮苷對照品溶液的HPLC圖

2.2.6 精密度試驗 精密吸取陳皮樣品溶液20 μL，進樣，測定。連續(xù)重復(fù)5次，計算橙皮苷峰面積的RSD為1.15%(n=5)。表明本法精密度良好。陳皮樣品溶液HPLC圖見圖2。

圖2 陳皮樣品溶液的HPLC圖

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 精密吸取陳皮樣品溶液20 μL，分別在0、2、4、8、12、24 h進樣，測定峰面積，計算橙皮苷峰面積的RSD為2.21%(n=5)。表明制備的陳皮樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性試驗 精密稱取陳皮粗粉20 g，5份，加蒸餾水200 mL，加入0.6 g果膠酶，溶液pH值為5.0，置于45 ℃的恒溫水浴箱中，酶解4 h。然后升溫到100 ℃，煮沸20 min滅酶，取出，放冷過濾。濾液稀釋后，進樣測定，計算橙皮苷的含量，RSD為4.85%(n=5)，表明重復(fù)性較好。

2.2.9 加樣回收試驗 精密稱取陳皮粗粉20 g，5份，置于錐形瓶中，分別精密加入一定量的橙皮苷對照品溶液，按照2.2.8項下酶解方法處理，進樣測定，計算橙皮苷的回收率。測得平均回收率95.58%，RSD為4.33%(n=5)，表明該法測定橙皮苷準(zhǔn)確度高。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗結(jié)果與分析

3.1.1 果膠酶用量對橙皮苷提取率的影響 稱取陳皮粗粉各20.00 g，加水200 mL，即液料比10∶1(mL·g-1)，加果膠酶的用量分別為陳皮藥材的0%、0.5%、0.75%、1.50%、3.00%、4.50%、6.00%，pH值為5.0，置于45 ℃的恒溫水浴箱中，酶解4 h。然后升溫到100 ℃，煮沸20 min滅酶，取出，放冷過濾，濾液稀釋后，測定峰面積，計算含量。結(jié)果見圖3。

圖3 果膠酶用量對橙皮苷提取率的影響

由圖可以看出，僅用水提取陳皮中的橙皮苷時，提取率很低，當(dāng)加入果膠酶后，提取率明顯提高。當(dāng)加入果膠酶的用量是3%時，提取率最高。

3.1.2 酶解溫度對橙皮苷提取率的影響 稱取陳皮粗粉各20.00 g，加水使液料比為10∶1(mL·g-1)，加入果膠酶3%，pH值為5.0，分別置于40、45、50、55、60、65 ℃的恒溫水浴箱中，酶解4 h。然后滅酶，過濾，測定含量。結(jié)果見圖4。

圖4 酶解溫度對橙皮苷提取率的影響

由圖可以看出，果膠酶對溫度比較敏感。當(dāng)酶解溫度達(dá)到45 ℃，橙皮苷提取率達(dá)到最高，當(dāng)溫度繼續(xù)升高時，橙皮苷提取率逐漸下降。這是由于溫度過高會影響果膠酶的活性。因此，酶解適宜溫度為45 ℃。

3.1.3 酶解時間對橙皮苷提取率的影響 稱取陳皮粗粉各20.00 g，加水使液料比為10∶1(mL·g-1)，加入果膠酶3%，pH值為5.0，45 ℃條件下，分別酶解1、2、3、4、5 h。然后滅酶，過濾，測定含量。結(jié)果見圖5。

圖5 酶解時間對橙皮苷提取率的影響

由圖可以看出，酶解時間太短，酶解不完全。當(dāng)酶解時間為2 h時，橙皮苷提取率最高，延長時間，提取率下降，增加了勞動成本。因此，酶解時間2 h適宜。

3.1.4 液料比對橙皮苷提取率的影響 稱取陳皮粗粉各20.00 g，加水使液料比分別為5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1(mL·g-1)，加入果膠酶3%，pH值為5.0，置于45 ℃條件下，酶解2 h。然后滅酶，過濾，測定含量。結(jié)果見圖6。

圖6 液料比對橙皮苷提取率的影響

由圖可以看出，水的用量對橙皮苷的提取有很大影響。加水多，增加了藥材細(xì)胞內(nèi)外濃度差，有利于橙皮苷的溶出，但加水量太多，不利于藥液的濃縮。

3.1.5 pH值對橙皮苷提取率的影響 稱取陳皮粗粉各20.00 g，加水使液料比10∶1(mL·g-1)，加入果膠酶3%，調(diào)節(jié)溶液的pH值分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，置于45 ℃條件下，酶解2 h。然后滅酶，過濾，測定含量。結(jié)果見圖7。

圖7 pH值對橙皮苷提取率的影響

由圖可以看出，pH值對酶的活性有較大影響，果膠酶pH 值為3.0的條件下最為適宜，橙皮苷提取率最高，當(dāng)pH值繼續(xù)增大，橙皮苷提取率反而下降。

3.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝

3.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案 根據(jù)響應(yīng)面中心組合試驗設(shè)計，研究各酶解因素對橙皮苷提取率的影響，從而得到酶解的最佳條件。在酶解溫度為45 ℃，酶解液pH值為3.0的條件下，選取果膠酶用量(X1)、液料比(X2)和酶解時間(X3)這3個因素為自變量，橙皮苷的提取率為響應(yīng)值。試驗因素與水平的取值見表1。

表1 響應(yīng)面分析試驗因素和水平

通過Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理進行設(shè)計，響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果見表2。試驗號1、2、4、8、17為5個中心試驗，用來估計試驗誤差，其余為析因試驗。

表2 響應(yīng)面試驗方案設(shè)計及結(jié)果

3.2.2 模型的建立及分析 對響應(yīng)值與各因素進行二次線性回歸擬合，得到回歸方程：Y=-0.56+1.205 25X1+0.092 275X2+1.108 5X3+0.002 5X1X2+0.017 5X1X3+0.004 75X2X3-0.209X12-0.000 79X22-0.296 5X32，r=0.987 1。式子中：Y表示橙皮苷的提取率(%)，X1表示果膠酶用量(%)，X2表示液料比(mL·g-1)，X3表示酶解時間(h)。

響應(yīng)面回歸模型的顯著性檢驗和方差分析見表3，根據(jù)方差分析結(jié)果，該Quadratic回歸模型的P<0.000 1，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明與實際試驗擬合好。模型的相關(guān)系數(shù)r為0.987 1，說明因變量和自變量線性關(guān)系顯著。失擬項的P為0.119，P>0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明試驗誤差小，回歸模型可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實關(guān)系，故可以用該回歸方程代替實際試驗對試驗結(jié)果的分析和預(yù)測。由表3可以看出，在總的作用因素中，一次項和平方項的影響較大，而交互項的影響較小。對橙皮苷的提取率影響因素順序依次為液料比>酶解時間>酶用量。

表3 方差分析表

注：**表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

響應(yīng)面圖也可以直觀地反映各因素對響應(yīng)值的影響。見圖8～10。等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強弱。由圖8可看出，酶解時間和酶用量等高線近似圓形，可知他們之間的相互作用對橙皮苷提取率的影響很小。圖9、圖10表明，液料比對橙皮苷的提取率影響最為突出，表現(xiàn)為曲線很陡峭。

圖8 時間和酶用量對提取率的響應(yīng)面圖

圖9 液料比和酶用量對提取率的響應(yīng)面圖

圖10 液料比和時間對提取率的響應(yīng)面圖

3.2.3 響應(yīng)面分析優(yōu)化及驗證性試驗 采用Design-Expert 8.0.5.0程序進行響應(yīng)面分析優(yōu)化，理論上可得橙皮苷最佳提取工藝條件：果膠酶的用量為3.22%；液料比為40∶1(mL·g-1)；酶解時間為2.29 h，提取率為5.45%?？紤]到實際操作的簡便，修正最佳提取工藝條件：果膠酶的用量為3.2%；酶解時間液料比為40∶1(mL·g-1)；酶解時間為2.3 h。根據(jù)以上條件進行橙皮苷的提取，試驗重復(fù)3次，橙皮苷的實際提取率為5.40%，RSD為3.57%，與理論值比較接近。表明響應(yīng)面分析法所得的優(yōu)化條件真實可靠，具有實用價值。

4 討論

因柑橘果皮富含果膠，果膠存在于相鄰細(xì)胞壁間的胞間層中，起著將細(xì)胞粘在一起的作用。通過果膠酶酶解，能有效地破壞細(xì)胞間的果膠，使橙皮苷充分地溶解出來。橙皮苷的含量受陳皮藥材的產(chǎn)地和采收季節(jié)的影響，本課題研究的陳皮藥材是四川產(chǎn)的。通過果膠酶解法，測得陳皮中橙皮苷的提取率為5.40%。據(jù)相關(guān)報道[9-10]，采用甲醇為溶劑，通過超聲法提取川陳皮中橙皮苷，測得其提取率分別為4.89%、4.93%。酶解法與文獻(xiàn)報道的超聲提取法相比，提取率提高了約10%。酶解法在橙皮苷提取率方面沒有大幅度提高，可能與果膠酶的質(zhì)量和活度有關(guān)。

根據(jù)研究結(jié)果，果膠酶用量比較大，原因可能是購買的果膠酶活力較小且柑橘果皮果膠含量較高。我們嘗試用纖維素酶來提取橙皮苷，但研究發(fā)現(xiàn)，其酶解效果不如果膠酶顯著。

通過單因素試驗和響應(yīng)面分析，得到橙皮苷的最佳提取工藝條件：陳皮粗粉適量，加水使其液料比為40∶1(mL·g-1)，加入果膠酶的量為藥材的3.2%，調(diào)節(jié)溶液的pH值為3.0，置于45 ℃恒溫條件下酶解2.3 h。

酶解法提取橙皮苷能耗小，無需特殊設(shè)備，所用溶劑環(huán)保、經(jīng)濟、操作簡單、生產(chǎn)安全性好，有利于企業(yè)大生產(chǎn)，但存在著溶劑用量大及提取時間長等缺點。為避免這些弊端，可考慮多次酶解法，或酶解法與其他提取方法相結(jié)合。

[1] 劉雅麗，陳思佳，張晨，等.橙皮苷、檸檬烯及茶多酚清除自由基能力的對比研究[J].口腔醫(yī)學(xué)研究，2015，31(1)：11-14.

[2] 黃芳，周宏，陳華，等.橘皮中橙皮苷提取的優(yōu)化及其對羥自由基清除作用[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38(5)：223-227.

[3] 鄒淑君，余子惠，許樹軍，等.橙皮苷及橙皮素清除自由基活性的研究[J].中醫(yī)藥學(xué)報，2013，41(1)：65-68.

[4] 劉學(xué)仁，張瑩，林志群.橙皮苷和橙皮素生物活性的研究進展[J].中國新藥雜志，2011，20(4)：331-333.

[5] 錢俊臻，王伯初.橙皮苷的藥理作用研究進展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2010，22：176-180.

[6] 蔡慶順，鐘小群，余華.陳皮不同提取工藝橙皮苷提取率分析[J].中成藥，2010，32(6)：1067-1070.

[7] 齊兵，何志勇，秦肪，等.陳皮中橙皮苷的提取與純化工藝研究[J].食品工業(yè)科技，2012，33(24)：343-346.

[8] 姚雪蓮，孫濤，廖夫生，等.高效液相法測定陳皮藥渣中橙皮苷含量[J].中國藥師，2012，15(2)：207-208.

[9] 禤雪梅.HPLC法測定不同產(chǎn)地藥材陳皮中橙皮苷的含量[J].北方藥學(xué)，2015，12(2)：9-12.

[10] 吳愫青，葉瑩，張俊.HPLC測定不同產(chǎn)地陳皮橙皮苷的含量[J].中國現(xiàn)代中藥，2008，10(8)：20-22.

OptimizationofExtractionofEsperidinfromTangerinePeelwithEnzymaticMethod

XULingling，YANGXiaodong*，LIQunli，CHENGuiying，SHENGLiuqing，CHENFei，CAIYunyun

(MedicalCollegeofJinhuaProfessionandTechnologyCollege，JinhuaZhangjiang，321007)

Objective：To research extraction process of esperidin from tangerine peel by enzymatic method.Methods：On the basis of single factor test，the optimum condition of extraction was conducted through response surface methodology.Results：The optimum conditions were as followed：ratio of liquor to material 40∶1(mL·g-1)，pectinase 3.2%，pH 3.0，enzyme digestion temperature of 45 ℃ and enzymolysis time of 2.3 h.Under these conditions，the extraction rate was 5.45%，actually 5.40%.Conclusion：The enzymatic method has advantages in simple operation，higher extraction rate and large scale production.But it is time-consuming and requires large amount of solvents.

Enzymatic methods；response surface methodology；tangerine peel；hesperidin；extraction

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.11.020

2015-03-06)

浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新項目(2013R465005)；浙江省科技廳分析測試項目(2014C37057)

*

楊曉東，教授，研究方向：天然產(chǎn)物的研究與開發(fā)；E-mail:jhyxd@163.com