不同生長期穿心蓮葉中6種同工酶分析△

邵艷華，高俊麗，李倩，章潤菁，丁平，賴小平

(廣州中醫(yī)藥大學 中藥學院，廣東 廣州 510006)

·基礎研究·

不同生長期穿心蓮葉中6種同工酶分析△

邵艷華，高俊麗，李倩，章潤菁，丁平*，賴小平

(廣州中醫(yī)藥大學 中藥學院，廣東 廣州 510006)

目的：研究不同生長期穿心蓮葉中6種同工酶的酶譜變化規(guī)律，為探討同工酶與穿心蓮次生代謝產(chǎn)物形成之間的關系奠定基礎。方法：以不同生長時期的穿心蓮頂端全展葉為供試材料，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)法得到穿心蓮葉過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、多酚氧化酶(PPO)、過氧化氫酶(CAT)、細胞色素氧化酶(CYT)及酯酶(EST)同工酶的電泳酶譜，對不同生長期穿心蓮葉中上述6種同工酶圖譜進行比較分析。結果：不同生長期穿心蓮葉中6種同工酶的酶帶亮度(酶活性)均隨著生長時期的不同顯示出明顯差別，且均具有各自的主要特征酶帶。POD、CYT和PPO同工酶酶譜在質(酶帶數(shù))和量(酶活性)上均表現(xiàn)出不同程度的差異，其酶活性在花果期顯著增強，其中POD受物候期的影響最為顯著；EST同工酶的酶活性也在花果期明顯提高；CAT和SOD同工酶在穿心蓮生長過程中相對穩(wěn)定。結論：POD、EST、PPO以及CYT同工酶酶譜的變化可以明顯反映不同生長期穿心蓮的生長發(fā)育特異性，尤其是POD可以作為觀察穿心蓮生長變化以及深入研究次生代謝產(chǎn)物生成的一種生理指標。

穿心蓮；不同生長期；同工酶

穿心蓮Andrographispaniculata(Burm.f.) Nees為爵床科一年生草本植物，在中國、印度、馬來西亞等國家的傳統(tǒng)醫(yī)學及養(yǎng)生保健文化中具有悠久的藥用歷史，廣泛用于治療感冒、痢疾、肝膽疾病及毒蛇咬傷等，現(xiàn)代藥理研究表明其具有治療潰瘍性結腸炎、糖尿病、上呼吸道損傷、高血壓、肝炎及艾滋病等作用，這些主要歸功于大量存在于穿心蓮葉中的穿心蓮二萜內酯類化學成分[1]，前期研究表明穿心蓮二萜內酯類成分隨著生長時期的不同會發(fā)生質和量的變化[2-3]。同工酶為催化反應相同而結構及理化性質不同的酶的分子類型，是生物機體中的天然標記，可反映出機體里的各種變化，機體發(fā)育過程的變化可以隨某些同工酶的改變而特征化，在植物生長發(fā)育過程中普遍存在同工酶的階段特異性，其酶譜表現(xiàn)與生長發(fā)育階段密切相關，且不同同工酶種類其特異性不同[4-7]，可作為研究生理和代謝產(chǎn)物變化的指標[8]，Morimoto等研究表明黃芩體內的過氧化物酶能催化黃芩苷生成黃芩素[9]。目前關于穿心蓮不同生長期同工酶的研究尚未見報道，穿心蓮生長過程中二萜內酯類化學成分的變化是否與同工酶的變化有關尚不清楚，因此本文擬通過對不同生長期穿心蓮葉中的過氧化物酶(POD) 、超氧化物歧化酶(SOD)、多酚氧化酶(PPO)、過氧化氫酶(CAT)、細胞色素氧化酶(CYT)、酯酶(EST)等6種同工酶酶譜變化進行研究，以揭示穿心蓮中不同同工酶與其生長特性的相關性，掌握穿心蓮的生長發(fā)育規(guī)律，進一步了解物候期對穿心蓮生理生化的影響，從而為研究同工酶與次生代謝產(chǎn)物合成的關系奠定基礎，同時為指導穿心蓮規(guī)范化種植提供科研依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

BIO-RAD電泳儀及BIO-RAD mini垂直電泳槽，5417R E endorf高速冷凍離心機。

1.2 試藥

試劑：丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、甘氨酸、過硫酸銨、Tris、溴酚藍，TEMED(廣州昂科生物科技有限公司)，水為去離子水。

樣品：實驗用穿心蓮葉采自廣州中醫(yī)藥大學藥王山穿心蓮樣地，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學丁平研究員鑒定為爵床科植物穿心蓮Andrographispaniculata(Burm.f.) Nees。采樣時間為2013年7月20日至10月4日，即分別于穿心蓮快速生長期(7月)、現(xiàn)蕾期(8月)、花期(9月)、花果期(10月)采集樣品，樣品詳情見表1。

表1 穿心蓮樣品信息

2 方法

2.1 樣品制備

將采集的穿心蓮嫩葉用去離子水洗凈，用濾紙吸干其表面水分，稱取0.5 g(每批樣品取3份)，加入液氮研成粉，加入1.0 mL pH 8.0的1.0 mol· L-1Tris-HCl緩沖液冰浴研磨成漿，提取液于4 ℃離心20 min，12 000 r·min-1，吸取上清液作為粗酶液。貯于-20 ℃冰箱備用。

2.2 電泳

采用垂直板PAGE法，分離膠緩沖液為pH 8.9 Tris-HCl，濃縮膠緩沖液為pH 6.7 Tris-HCl，POD、SOD和EST的分離膠、濃縮膠質量分數(shù)為10%、4%，PPO的分離膠和濃縮膠質量分數(shù)分別為10%、3.75%，CYT和CAT的分離膠質量分數(shù)為7%，CYT濃縮膠質量分數(shù)為3%、CAT濃縮膠質量分數(shù)為2.5%。電極緩沖液為pH 8.3 Tris-甘氨酸，樣品按照粗酶液-40%蔗糖溶液-0.5%溴酚藍(1∶1∶0.5)混勻，每孔加樣20 μL，4 ℃條件下電泳，起始電流為10 mA，樣品進入分離膠后調節(jié)電流至20 mA，溴酚藍標志到達凝膠前沿停止電泳。

2.3 染色

2.3.1 POD同工酶染色 采用聯(lián)苯胺-抗壞血酸染色法：電泳完畢，剝取凝膠，用蒸餾水漂洗數(shù)次后，放入染色液“70.4 mg抗壞血酸，20 mL聯(lián)苯胺貯存液(2 g聯(lián)苯胺溶于18 mL冰醋酸中再加水72 mL)，20 mL 3% H2O2，60 mL水”，約1～5 min出現(xiàn)清晰的過氧化物酶區(qū)帶，迅速傾出染色液，用蒸餾水洗滌數(shù)次，于7%乙酸中保存。

2.3.2 SOD同工酶染色 凝膠在染色液“10 mmol·L-1pH 7.2磷酸緩沖液中含有2 mmol·L-1茴香胺、0.1 mmol·L-1核黃素”中浸泡1 h，快速水洗兩次，光照5～15 min，即顯示SOD活性譜帶。

2.3.3 PPO同工酶染色 采用染色液“0.06% 鄰苯二胺(0.01 mol·L-1草酸溶解)20 mL，0.05 mol·L-1鄰苯二酚60 mL，pH 6.8磷酸緩沖液20 mL，混勻”常溫下染色40 min，透明背景下出現(xiàn)黃色條帶。

2.3.4 EST同工酶染色 染色液“堅牢藍RR鹽30 mg溶于30 mL pH 6.4的0.1 mol·L-1磷酸緩沖液中，2 mL 1%α-醋酸萘酯(少許丙酮溶解，用80%乙醇配制)，1 mL 2%β-醋酸萘酯(配制同α-醋酸萘酯)，混勻即可”染色，37 ℃下暗反應10～60 min，當呈現(xiàn)棕紅色酶帶時，迅速傾出染色液，用蒸餾水漂洗，于7%乙酸中保存。

2.3.5 CYT同工酶染色 采用染色液“1%二甲基對苯二胺3 mL，1%α-萘酚(溶于40%乙醇)3 mL，0.1 mol·L-1pH 7.4磷酸緩沖液75 mL，混勻”染色，37 ℃下暗反應10～60 min，直至條帶清晰時，立即倒掉染色液，用去離子水沖洗數(shù)次，立即拍照，否則天藍色酶帶會褪去。

2.3.6 CAT同工酶染色 電泳完畢，剝取凝膠，用蒸餾水漂洗數(shù)次后，浸沒在0.9 mmol·L-1H2O2中10 min，然后加入2%鐵氰化鉀和2%三氯化鐵的混合液，待條帶顯示，即刻拍照。

3 結果與分析

3.1 POD同工酶

不同生長時期穿心蓮葉中POD同工酶PAGE電泳圖見圖1 (POD)，圖譜顯示不同生長時期穿心蓮葉中POD同工酶酶帶條數(shù)有明顯差別，1～3號樣品為生長旺盛期采集的穿心蓮樣品，其POD電泳結果顯示出1條明顯酶帶，相對遷移率(Rf)約為0.2；4和5號樣品為花蕾期的穿心蓮葉，分離出2條明顯的酶帶，Rf值在0.1和0.2，在Rf值0.4處隱約可見第3條酶帶；6和7號樣品分別為花盛期和花果期的穿心蓮葉，分離出3條酶帶，Rf值0.4處的酶帶亮度較4和5號樣品明顯增強；Rf 0.2的酶帶為所有樣品的共有帶，且隨著生長期的延長，酶帶亮度加深，可作為穿心蓮生長過程中的POD同工酶特征酶帶，此結果說明花果期(采收期)的穿心蓮葉中POD同工酶的酶活性增強，且產(chǎn)生新的特征酶帶。

3.2 SOD同工酶

不同生長時期穿心蓮葉中SOD同工酶PAGE電泳圖見圖1(SOD)，由結果可知，不同生長時期穿心蓮葉中SOD同工酶酶帶數(shù)為3條，Rf值在0.1、0.4和0.5，且其特征酶帶亮度基本一致。說明穿心蓮葉SOD同工酶在生長過程中較穩(wěn)定。

3.3 PPO同工酶

不同生長時期穿心蓮葉中PPO同工酶PAGE電泳圖見圖1(PPO)，由結果可知，穿心蓮葉中PPO同工酶有5條酶帶，Rf值在0.1、0.2、0.4、0.5、0.6，酶帶亮度差異顯著，Rf 0.5的酶帶可作為PPO的特征酶帶，且其在1號、2號和7號樣品中顯示較強亮度。說明PPO同工酶在穿心蓮的快速生長期和花果期活性較強。

3.4 EST同工酶

不同生長時期穿心蓮葉中EST同工酶PAGE電泳圖見圖1(EST)，由結果可知，不同生長時期穿心蓮葉中EST同工酶酶帶數(shù)一致，均有3條，Rf值在0.06、0.25、0.4，隨著生長期的延長，EST酶帶亮度增強，Rf 0.4的酶帶在花盛期和花果期時才清晰可見。說明穿心蓮葉中EST同工酶在花果期活性較強。

3.5 CYT同工酶

不同生長時期穿心蓮葉中CYT同工酶PAGE電泳圖見圖1(CYT)，由結果可知，不同生長時期穿心蓮葉中CYT同工酶酶帶數(shù)一致，均有2條，Rf值在0.2、0.55，隨著生長期的延長，CYT酶帶亮度增強，尤其是Rf 0.55的酶帶。說明穿心蓮葉中CYT同工酶在花果期活性較強。

3.6 CAT同工酶

不同生長時期穿心蓮葉中CAT同工酶PAGE電泳圖見圖1(CAT)，由結果可知，不同生長時期穿心蓮葉中CAT同工酶酶帶數(shù)一致，均有3條，Rf值在0.05、0.1、0.4，酶帶亮度也基本一致。說明穿心蓮葉中CAT同工酶在生長過程中相對穩(wěn)定。

圖1 不同生長時期穿心蓮葉中6種同工酶的PAGE電泳圖譜

4 討論

本研究利用聚丙烯酰胺凝膠電泳圖直觀清晰地顯示了不同生長期穿心蓮葉中6種同工酶的酶譜變化特征。POD、PPO、CYT、SOD及CAT為抗氧化酶系，參與植物的光合作用、呼吸作用以及次生代謝產(chǎn)物的生成積累，同時幫助植物抵御一些生物或非生物性脅迫[10]；EST是一類水解酶，能催化分子中的酯鍵，參與若干酶類的修飾、激活或鈍化，并與內膜系統(tǒng)的發(fā)育有關[11]，同工酶的多寡和有無，與植物的不同生長發(fā)育時期及特定的生理狀態(tài)等均有密切關系。POD、PPO、CYT和EST在花期至果期酶活性明顯增強，此結果與穿心蓮內酯類化學成分在花果期時含量最高的研究結果[3]相吻合，本研究從穿心蓮抗氧化酶及酯酶活性的角度證明了穿心蓮的最佳采收期?；ü诖┬纳徝富钚缘脑龈呒拔墨I報道的穿心蓮內酯類化學成分含量的增高可能與此時穿心蓮生理代謝水平提高有關。林植芳等[12]報道水稻生理作用水平的提高與保護酶活性的升高協(xié)調一致，酶活力的增高能完全消除細胞內光合及呼吸作用所產(chǎn)生的活性氧或其他有害物質，從而使細胞內具備大量的剩余能量進行次生代謝產(chǎn)物的積累，由此亦可以猜測POD、PPO、CYT和EST同工酶的活性高低可能會影響穿心蓮內酯類化學成分在植物體內的積累。此外，6種同工酶均具有各自的主要特征酶帶，并存在于穿心蓮生長的各個時期，表明這6種同工酶的特征酶帶是穿心蓮生長過程中的必須酶帶，以保證穿心蓮體內的活性氧以及其他導致膜結構及生理完整性受到破壞的物質維持在一個正常的動態(tài)水平。

同工酶是細胞代謝的調節(jié)者，穿心蓮在花果期的各項新陳代謝功能增強，所以生物體內的酶如POD和PPO同工酶表現(xiàn)出明顯質和量的提高，此結果符合侯連生等[13]報道的新陳代謝旺盛期的細胞內各種促進個體發(fā)育的酶含量和酶活力相對要高一些。POD同工酶在穿心蓮不同生長期的變化最為明顯，可以作為評價穿心蓮生長特性的生理指標。本研究中POD在不同生長期穿心蓮葉中的酶譜表現(xiàn)與Tang等[14]報道結果一致，這種同工酶酶譜的差異表現(xiàn)有助于探究植物在應對各種生物或非生物脅迫時同工酶所發(fā)揮的功用；CAT的穩(wěn)定性較強，標志性酶帶較恒定，可以作為遺傳鑒定的指標；CYT是位于線粒體中能量代謝的關鍵酶，花果期CYT同工酶活性增高可能與此時穿心蓮線粒體呼吸作用加強以維持正常生理代謝有關；EST同工酶活性的提高有利于調節(jié)作物對環(huán)境適應性的代謝過程，從而適應形態(tài)和功能的變化，順利度過生長轉型期[15-16]。

不同生長期穿心蓮葉中不同同工酶的分析可為研究穿心蓮的發(fā)育規(guī)律、種質資源鑒定以及培育高含量有效成分的穿心蓮資源植物[17]等提供有效的生理學參數(shù)，從而指導穿心蓮的規(guī)范化種植。另外，關于同工酶與穿心蓮二萜內酯類化學成分變化的內在關系將在后期實驗中進行。

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AnalysisonSixKindsofIsozymesinAndrographispaniculataLeafatDifferentGrowthPeriods

SHAOYanhua，GAOJunli，LIQian，ZHANGRunjing，DINGping*，LAIXiaoping

(CollegeofChineseMateriaMedica，GuangzhouUniversityofChineseMedicine，Guangzhou510006，China)

Objective：The influence of phonologicalstages (vegetative，squaring，flowering and fruiting stages) on six kinds of isozymes ofAndrographispaniculataleaf were investigated，which may offer references forunderstanding the relationshi Pbetween the isozymes and generation of secondary metabolites.Methods：The first fully developed leaves from the to Pwere used as thetested materials.The electrophoresis spectrums of six isoenzymes including peroxidase (POD)，superoxide dismutase (SOD)，Polyphenol oxidase (PPO)，Catalase (CAT)，Cytochrome Oxidase (CYT) and esterase (EST) were obtained by polyacrylamide gel electrophoresis(PAGE) method and then analyzed consequently.Results：The aforementioned isozymes showed significant difference with different phonological stages.The number of POD，EST，CYT and PPO enzyme band and their band intensity increased at flowering and fruiting period，around September and October.POD was affected most significantly.While CAT and SOD werestable during the growth period.Conclusion：Thechanges of POD，EST，CYT and PPO isoenzyme pattern，especiallythe POD can clearly reflect the growth and development specificity ofA.paniculataat different growth period，and itmay be used as aphysiological and chemical index for the further study ofA.paniculata.

Andrographispaniculataleaf；different growth periods；isozymes

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.11.010

2015-01-13)

“十二五”國家科技支撐計劃(2011BAI01B01)

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丁平，研究員，研究方向：中藥資源有效成分及中藥質量評價；E-mail：dingpinggz@126.com