黃曲霉侵染對黃芪質(zhì)量的影響及其儲藏條件研究△

胡一晨，孔維軍，劉秋桃，劉洪美，趙鋼，楊美華*

(1.成都大學(xué)生物工程學(xué)院，成都 610106； 2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193)

·專題·

黃曲霉侵染對黃芪質(zhì)量的影響及其儲藏條件研究△

胡一晨1，2，孔維軍2，劉秋桃2，劉洪美2，趙鋼1，楊美華2*

(1.成都大學(xué)生物工程學(xué)院，成都 610106； 2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193)

目的：從黃曲霉侵染對黃芪藥材有效成分影響的角度評價(jià)真菌污染過程對黃芪質(zhì)量的影響，并考察黃芪最佳儲藏條件。方法：采用人工侵染接種的方法使黃芪染菌，通過采用Q-TOF HDMS質(zhì)譜儀建立黃芪中9種有效成分(毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花苷、芒柄花素、黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪甲苷和異黃芪皂苷Ⅰ)的同步分析譜，對比研究染菌前后有效成分的變化趨勢。隨后，采用中心組合設(shè)計(jì)—響應(yīng)面法考察儲藏環(huán)境溫度和濕度對黃芪中真菌毒素產(chǎn)生的影響，優(yōu)化最佳儲藏條件。結(jié)果：在黃芪藥材上接種曲霉孢子培養(yǎng)10 d后，黃芪霉變嚴(yán)重，其中黃酮苷成分顯著減少，而黃酮苷元和皂苷成分變化較小。通過建立的溫濕度與黃曲霉毒素含量相關(guān)性模型以及響應(yīng)面曲線圖，優(yōu)化得到避免黃芪藥材染菌產(chǎn)毒的最佳儲藏環(huán)境為溫度低于20 ℃，濕度小于85%。結(jié)論：本研究首次探索了黃曲霉染菌過程對黃芪藥材質(zhì)量的影響，并篩選出黃芪最佳儲藏條件，為建立中藥儲藏過程防霉變體系提供依據(jù)。

黃芪；儲藏；黃曲霉毒素；有效成分；響應(yīng)面

黃曲霉菌(Aspergillusflavus)是一類廣泛存在于自然界中的常見真菌，其代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素(Aflatoxin，AFT)因其致癌、致畸、致突變性，已成為國民健康的重要威脅[1]。近年來，中藥材中AFT污染問題已引起了越來越多的關(guān)注[2-3]。中藥材中往往含有多糖、脂肪油、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，這些成分都可能成為黃曲霉菌的生長和代謝過程的能量物質(zhì)，若儲藏條件較差，溫濕度控制不當(dāng)，極易引起黃曲霉毒素的污染?，F(xiàn)有的中藥質(zhì)量評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)往往只考慮中藥材中黃曲霉毒素的含量，而未涉及真菌和真菌毒素污染對藥材成分的影響。因此，尋找適宜于中藥材的儲藏溫濕度，探索黃曲霉菌侵染對藥材內(nèi)在質(zhì)量的變化迫在眉睫。

黃芪以其益氣固表、利水消腫、脫毒生肌等功效被世人廣泛應(yīng)用[4-5]。由于黃芪中富含黃芪多糖、黃芪皂苷等有效成分[6]，為黃曲霉菌提供了得天獨(dú)厚的生存環(huán)境，若儲藏環(huán)境的溫濕度適宜則極易被黃曲霉菌侵染，從而污染黃曲霉毒素。因此，本研究將從黃曲霉菌污染對黃芪內(nèi)在質(zhì)量的影響入手，探究黃芪在受到黃曲霉菌污染后其化學(xué)成分(三萜皂苷和黃酮類化合物：黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ、黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、異黃芪皂苷Ⅰ、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素)的變化規(guī)律，為全面、深入、系統(tǒng)的綜合評價(jià)黃芪的內(nèi)在質(zhì)量提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。同時運(yùn)用響應(yīng)面法尋找適宜儲藏黃芪藥材的溫濕度，以期以黃芪為例來考察適宜的中藥材儲藏環(huán)境。

1 儀器與材料

Waters Q-TOF HDMS質(zhì)譜儀(Waters，USA)；KQ-500超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)；甲醇和乙腈(色譜純，美國Honeywell公司)；QTRAP?5500質(zhì)譜(AB SCIEX公司)；LC-30AT超高效液相色譜儀(日本島津公司)。

1.5 μm玻璃纖維濾紙(美國VICAM公司)；黃曲霉毒素G2、G1、B2和B1混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液(黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1濃度分別為0.5、2.0、0.5、2.0 μg·mL-1，新加坡Pribolab公司)；甲醇和乙腈(色譜純，美國Honeywell公司)。黃曲霉菌凍干粉(Aspergillusflavus，CGMCC 3.4410)購自于中國普通微生物菌種保藏管理中心。察氏培養(yǎng)基(Salt Czapek Dox Agar，SCDA)購買于北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

黃芪甲苷(110781-200613，98.0%)，毛蕊異黃酮葡萄糖苷(111920-201203，97.3%)和芒柄花素(111703-200603，98.0%)，購于中國食品藥品檢定研究院(北京)。芒柄花苷(CHB-M-009，HPLC≥98.0%)，毛蕊異黃酮(CHB-M-016，HPLC≥98.0%)，黃芪皂苷Ⅰ(CHB-H-036，HPLC≥98.0%)，黃芪皂苷Ⅱ(CHB-H-037，HPLC≥98.0%)，黃芪皂苷Ⅲ(CHB-H-038，HPLC≥98.0%)，異黃芪皂苷Ⅰ(CHB-Y-084，HPLC≥98.0%)，購于成都克洛瑪生物科技有限公司(成都)。黃芪藥材購于河北安國藥材市場，并經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所張本剛研究員鑒定，黃芪藥材均密封于-20 ℃條件下保存。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 黃曲霉人工侵染黃芪

2.1.1 黃曲霉菌侵染黃芪過程 用無菌接種環(huán)挑取黃曲霉菌分生孢子到察氏培養(yǎng)基平板上，在28 ℃、90%濕度下培養(yǎng)7 d。取一支已培養(yǎng)好的黃曲霉菌斜面，加入含1%吐溫-20的無菌水10mL，用無菌接種環(huán)輕輕刮下瓊脂培養(yǎng)基表面的分生孢子，將懸浮的孢子懸液置于無菌的離心管中，充分振搖使其混懸。然后用無菌脫脂棉過濾，并用無菌水清洗3次，得到孢子懸液。運(yùn)用血球計(jì)數(shù)板(25×16)法，將上述孢子懸液用無菌水稀釋至濃度為106孢子/mL的A.flavus(CGMCC 3.4410)孢子懸液。以每50 g黃芪藥材為一份分別儲藏，每一份中分別添加濃度為106孢子/mL的孢子懸液1 mL，在30 ℃，95%濕度下儲藏10 d。

2.1.2 UFLC-QTrap-MS/MS檢測黃芪中黃曲霉毒素方法的建立 準(zhǔn)確稱取10 g粉碎的黃芪樣品(過2號篩)，加入50 mL甲醇-水(80∶20，v/v)，超聲提取20 min，用玻璃纖維濾紙過濾，精密吸取2 mL續(xù)濾液于45 ℃下氮?dú)獯抵两?，并用甲?水(50∶50，v/v)定容至1 mL，過0.22 μm有機(jī)濾膜，轉(zhuǎn)入進(jìn)樣瓶，進(jìn)樣2.0 μL，根據(jù)課題組前期已建立起的黃芪中黃曲霉毒素的UFLC-QTrap-MS/MS檢測方法[7]，檢測染菌培養(yǎng)10 d后黃芪中黃曲霉毒素的含量。

2.2 黃芪染菌前后主要化學(xué)成分含量變化

2.2.1 色譜條件和質(zhì)譜條件 色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18 column (100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相為乙腈(A相)-0.1%甲酸水(B相)，梯度洗脫程序如下：0～3 min，A相從10%升至30%；3～5 min，A相保持30%；5～8 min，A相從30%升至65%；8～12 min，A相從65%升至90%；12～15 min，A相瞬間回到10%的起始濃度并保持3 min。柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：2 μL；流速：0.30 mL·min-1。離子源為電噴霧離子化源(ESI源)；正離子方式檢測；毛細(xì)管電壓(Capillary voltage)為 3.0 kV；源溫度(Source temperature)：120 ℃；錐孔電壓(cone voltage)為 40 V；質(zhì)荷比范圍：100～1200 m/z；母離子掃描能量(Parent Survey CE)：10～30 V。

2.2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取對照品毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花苷、芒柄花素、黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪甲苷和異黃芪皂苷Ⅰ適量，用80%甲醇配成濃度分別為34、40、45.5、43、53.25、52、51、39、56 μg·mL-1的混合對照品儲備液。

2.2.3 線性關(guān)系的考察和檢測限 取“2.2.2”項(xiàng)下的混合對照品儲備液，用80%甲醇稀釋得到不同濃度的對照品溶液，分別進(jìn)樣2.0 μL，記錄色譜圖，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2。根據(jù)3倍與10倍的信噪比峰響應(yīng)值，得出檢測限和定量限如表1中所示。

表1 黃芪中有效成分的線性關(guān)系

2.2.4 供試品溶液的制備 精密稱取2.0 g黃芪藥材粉末(二號篩)于錐形瓶中，加入20 mL 80%的甲醇超聲提取1 h。過濾，取續(xù)濾液，濾液過0.22 μm有機(jī)濾膜，轉(zhuǎn)入進(jìn)樣瓶，進(jìn)樣2.0 μL。按“2.2.1”項(xiàng)下色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行檢測。

2.3 中心設(shè)計(jì)—響應(yīng)面法優(yōu)選黃芪的儲藏條件

響應(yīng)面法結(jié)合了統(tǒng)計(jì)學(xué)方法和數(shù)學(xué)方法，能夠通過一系列確定性實(shí)驗(yàn)，用多項(xiàng)式函數(shù)的方式反映多個變量與其相應(yīng)的結(jié)果之間的關(guān)系，并進(jìn)行建模和分析，以達(dá)到尋找最佳變量值的最終目的[8-9]。中心組合設(shè)計(jì)(Central Composite Design，CCD)是響應(yīng)面設(shè)計(jì)中最常用的二階設(shè)計(jì)，其優(yōu)勢在于可以支持三個以下因素和水平的設(shè)計(jì)[10]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用中心組合設(shè)計(jì)—響應(yīng)面法，同時考察儲藏環(huán)境中溫度和濕度兩個因素對中藥材儲藏期藥材霉變情況的影響，以探索中藥材(以黃芪為例)的最佳儲藏條件。

黃曲霉菌的最適生長溫度為25～40 ℃，黃曲霉毒素形成的最適溫度為20～30 ℃。曲霉比其他霉菌更耐旱，在濕度較低的情況下亦能生存，而相對濕度80%～90%為其最佳的生存環(huán)境。因此本實(shí)驗(yàn)選擇響應(yīng)面設(shè)計(jì)中的中心組合設(shè)計(jì)模型，變量因子分別為：溫度(20～40 ℃)和濕度(80%～95%)。每個變量因子均設(shè)有五個水平：0，±1，±α。各變量及水平的設(shè)置如表2所示。根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)的原理，整個實(shí)驗(yàn)共需進(jìn)行13次不同因素水平的測試。

表2 中心組合設(shè)計(jì)各因素的水平設(shè)置值

3 結(jié)果與討論

3.1 黃芪染菌過程考察

采用人工染菌將曲霉孢子接種黃芪，培養(yǎng)藥材10 d后，黃芪藥材表面出現(xiàn)嚴(yán)重霉菌現(xiàn)象(圖1)。同時根據(jù)UFLC-QTrap-MS/MS檢測方法，從接種孢子的黃芪藥材中檢測到黃曲霉毒素B1和B2，總量約31.8 μg·kg-1，由此證明了該人工染菌方法的可靠性。

圖1 黃芪藥材接種曲霉孢子后在溫度30℃，濕度95%下培養(yǎng)圖

3.2 黃芪染菌前后主要化學(xué)成分變化研究

本研究采用Waters Q-TOF HDMS質(zhì)譜儀建立起黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花苷、芒柄花素、黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪甲苷和異黃芪皂苷Ⅰ多個成分的同時分析圖譜，并對染菌前后黃芪中有效成分含量進(jìn)行對比研究。由圖2A可知，該方法可將黃芪中9種成分較好的分離，并且這些組分在染菌前后的黃芪藥材中都能檢測到(圖2B和2C)。

根據(jù)所建立的黃芪多成分測定方法線性關(guān)系和方法學(xué)，對染菌前后黃芪中黃酮和皂苷成分進(jìn)行含量對比分析，結(jié)果如圖3。由圖3A可知，染菌后黃芪藥材中黃酮苷化合物(毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芒柄花苷)含量顯著降低，對黃酮苷元化合物影響較小。盡管芒柄花素含量也出現(xiàn)降低，但含量減少幅度相對較小，對毛蕊異黃酮苷元含量幾乎無影響。這可能是由于黃酮成分為黃芪中次生二級代謝產(chǎn)物，曲霉毒菌生長過程中需要攝取能量物質(zhì)，在曲霉生長代謝產(chǎn)生曲霉毒素的過程中，將黃酮化合物中葡萄糖基團(tuán)代謝掉，從而使糖苷含量顯著降低，但黃酮苷元結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，因此受曲霉影響更小。由圖3B可知，染菌后黃芪中皂苷成分變化較小，五種皂苷成分中僅黃芪皂苷I存在顯著變化，說明黃芪染菌對其中皂苷影響較小，可能是由于皂苷分子量普遍較黃酮大，分子結(jié)構(gòu)更復(fù)雜，受曲霉影響更小。綜上說明，真菌毒素的污染不僅會產(chǎn)生毒素，導(dǎo)致人體的毒副作用，而且對黃芪藥材的內(nèi)在質(zhì)量也存在影響。

(A.黃芪混合標(biāo)準(zhǔn)品，B.黃芪藥材，C.黃芪藥材染菌后)(1.毛蕊異黃酮葡萄糖苷，2.芒柄花苷，3.毛蕊異黃酮，4.黃芪甲苷，5.黃芪皂苷Ⅲ，6.芒柄花素，7.黃芪皂苷Ⅱ，8.黃芪皂苷Ⅰ，9.異黃芪皂苷Ⅰ)圖2 黃芪內(nèi)在成分變化圖

圖3 黃芪藥材染菌前后黃酮成分(A)和皂苷成分(B)含量變化對比

3.3 黃芪儲藏條件的考察

運(yùn)用UFLC-QTrap-MS/MS檢測黃芪中的黃曲霉毒素，并將樣品中測得的總黃曲霉毒素的含量輸入Design-Expert V8.0.6軟件中進(jìn)行分析，中心組合設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 Central Composite設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)中總黃曲霉毒素的測得量

采用響應(yīng)面優(yōu)化法，建立黃曲霉毒素與溫度、濕度相關(guān)性模型，所得方程如下：

R1=+0.000+0.000×A+12.01×B+1.29×A×B-1.80×A2+6.69×B2-10.72×A2×B+1.29×A×B2

其結(jié)果方差分析結(jié)果見表4。該模型的F-Value為6.61，表示該模型有顯著性意義，且只有2.70%的可能性是由于噪音引起的F-Value大?！癙rob>F”的值均小于0.0500表明模型中的各項(xiàng)式均具有顯著性意義，即B，B2，A2B 均是具有顯著性意義的模型中的各項(xiàng)。

表4 方差分析表

本實(shí)驗(yàn)以表5中的四個參數(shù)來評估模型的好壞，評價(jià)該模式是否能應(yīng)用于考察最佳的儲藏環(huán)境。

表5 響應(yīng)面評估參數(shù)表

R-Squared：擬合度，數(shù)值越接近1越好，本實(shí)驗(yàn)的擬合度有90.24%，實(shí)驗(yàn)誤差??；Adj R-Squared：表示模型的校正決定系數(shù)，即相關(guān)指數(shù)R(判斷曲線回歸方程有效性的一個重要參數(shù)，R值越大則所求得的曲線回歸方程越有效)的平方，本實(shí)驗(yàn)所得值表示該模型可以解釋76.58%響應(yīng)值的變化；Pred R-Squared：是用來解釋模型預(yù)測新觀測值的好壞能力；Adeq Precision：當(dāng)此值大于4時，則指出該模型具有足夠的分辨力，本實(shí)驗(yàn)所得的值為9.508，表明該模型可以用于實(shí)踐。由此可知，本實(shí)驗(yàn)所建立的響應(yīng)面優(yōu)化模型用于預(yù)測培養(yǎng)環(huán)境的溫濕度對真菌毒素產(chǎn)生量具有較好的準(zhǔn)確率和可行性。

根據(jù)所繪制的響應(yīng)面(圖4)可知，當(dāng)溫度范圍為22～37 ℃，濕度大于87.5%時，真菌毒素在黃芪中的含量會隨著溫度和濕度的變化而變化，其中溫度為30 ℃，濕度為95%時為真菌毒素產(chǎn)生最多的條件。因此，根據(jù)響應(yīng)面曲線圖推測適宜于黃芪藥材儲藏的環(huán)境條件為溫度低于20 ℃，濕度小于85%。

圖4 溫度、濕度與真菌毒素生成量關(guān)系的響應(yīng)面曲線圖

4 結(jié)論

黃芪中主要物質(zhì)基礎(chǔ)是黃酮和皂苷兩大類組分。目前常用HPLC-DAD-ELSD同時測定這兩類成分，但在靈敏度和色譜峰的鑒定上都表現(xiàn)出一定的不足[11]。Q-TOF-MS作為一種高分辨質(zhì)譜，可適用于測定寬分子量范圍的化合物，不受成分種類的影響，且具有高靈敏度，高掃描速率和高質(zhì)量精度等優(yōu)勢。本研究采用Waters Q-TOF HDMS質(zhì)譜儀建立起黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花苷、芒柄花素、黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪甲苷和異黃芪皂苷Ⅰ多個成分的同時分析圖譜，并采用人工接種黃曲霉菌使黃芪藥材染菌，對比黃芪染菌前后有效成分變化發(fā)現(xiàn)，黃芪染菌過程不僅會產(chǎn)生毒性物質(zhì)黃曲霉毒素，而且會影響黃芪藥材中有效成分含量，尤其使黃酮苷類化合物含量顯著降低，這可能與真菌生長代謝過程消耗黃酮苷中糖基有關(guān)。因此，中藥材染菌過程不僅僅會產(chǎn)生外源性毒素，同時也會造成有效成分含量的降低，在中藥材儲藏防控體系研究中不能僅考慮將藥材表面產(chǎn)生的真菌除去，還需要考慮到這一過程對中藥質(zhì)量的影響?；诖耍狙芯坎捎弥行慕M合設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法考察了黃芪避免染菌的最佳儲藏溫濕度條件(溫度低于20 ℃，濕度小于85%)，從根本上避免了外源性毒素的產(chǎn)生以及中藥材質(zhì)量的降低。本研究不僅為綜合評價(jià)黃芪的內(nèi)在質(zhì)量提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，而且以黃芪為例來考察適宜的儲藏環(huán)境，為快速尋找適宜的中藥材儲藏環(huán)境提供可行方法。

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StudyontheInfluenceofAspergillusflavusContaminationontheQualityofRadixAstragaliandItsStorageConditionOptimization.

HUYichen1，2，KONGWeijun2，LIUQiutao2，LIUHongmei2，ZHAOGang1，YANGMeihua2*

(1.SchoolofBioengineering，ChengduUniversity，Chengdu610106，China； 2.InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciences，PekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China)

Objective：The present study is aimed to evaluate the influence ofAspergillusflavuscontamination on the quality and bio-effectivity of Radix Astragali from the perspective of herbal compound changes，and investigate the best storage conditions.Methods：Radix Astragali was firstly contaminated by artificial inoculation ofAspergillusflavusspores.Based on the simultaneous determination of nine compounds in Radix Astragali by Q-TOF HDMS，including Calycosin-7-glucoside，calycosin，ononin，formononetin，Astragaloside I，Astragaloside II，Astragaloside III，Astragaloside IV and Isoastragaloside I，the variation of these bioactive compounds was monitored between herbs with or without fungal contamination.Subsequently，the storage condition about temperature and humidity of Radix Astragali was optimized by central composite design-response surface method.Results：After co-incubation withA.flavusspores for 10 days，Radix Astragali emerged significant mildew appearance and possessed remarkably reduced flavonoid glycosides，instead of flavonoid aglycones and saponins.The best storage condition for Radix Astragali to avoidA.flavuscontamination was optimized as the following：temperature and humidity below 20 ℃ and 85%，respectively according to the established response surface model.Conclusion：To the best of our knowledge，the influence ofA.flavuscontamination on the herbal quality of Radix Astragali and its optimized storage condition were evaluated for the first time herein.It would provide a promising research reference to establish the mildew prevent system during herbal storage.

Radix Astragali；storage；aflatoxin；bioactive components；response-surface

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.11.006

2015-08-20)

十二五國家科技重大專項(xiàng)重大新藥創(chuàng)制“中藥質(zhì)量安全檢測和風(fēng)險(xiǎn)控制技術(shù)平臺”(2014ZX09304307-002)

*

楊美華，研究員，研究方向：中藥質(zhì)量分析與安全性研究；Tel：(010)57833277，E-mail：yangmeihua15@hotmail.com