毛細(xì)管氣相色譜法同時測定斑蝥脂肪油中7種脂肪酸成分的含量△

陳雯玥，白鋼鋼，袁斐，陳建偉,3*，李祥,

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；3.江蘇省中藥炮制重點實驗室，江蘇 南京 210023)

·基礎(chǔ)研究·

毛細(xì)管氣相色譜法同時測定斑蝥脂肪油中7種脂肪酸成分的含量△

陳雯玥1，白鋼鋼2，袁斐2，陳建偉2,3*，李祥1,2

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；3.江蘇省中藥炮制重點實驗室，江蘇 南京 210023)

目的：建立斑蝥多脂肪酸成分毛細(xì)管氣相色譜法(GC)含量測定方法。方法：采用石油醚索氏提取斑蝥脂肪油并甲酯化后，以棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、花生酸為指標(biāo)性成分，通過GC同時測定斑蝥7種脂肪酸成分的含量。結(jié)果：7種脂肪酸含量存在一定產(chǎn)地差異性。結(jié)論：多脂肪酸成分的GC含量測定方法準(zhǔn)確、可靠，為建立斑蝥多指標(biāo)含量測定方法提供依據(jù)。

斑蝥；脂肪酸；毛細(xì)管氣相色譜；甲酯化

斑蝥(Mylabris)為昆蟲綱鞘翅目芫青科昆蟲南方大斑蝥MylabrisphalerataPallas或黃黑小斑蝥MylabriscichoriiLinnaeus的干燥體，為臨床常用中藥[1]。斑蝥具有破血逐瘀、散結(jié)消癥、攻毒蝕瘡的功能，近年來廣泛用于腫瘤病、肝炎及皮膚病的治療[2]?，F(xiàn)代研究證明，斑蝥的主要活性成分為斑蝥素(Cantharidin，C10H12O4)，此外尚含脂肪、多種微量元素及蟻酸等[3]。目前，斑蝥活性成分的研究主要集中在斑蝥素及其衍生物的合成、含量測定上，本課題組前期曾對斑蝥的種屬藥用資源、不同產(chǎn)地斑蝥中化學(xué)成分及斑蝥素含量、斑蝥炮制前后脂肪酸成分的GC-MS進(jìn)行了分析[4-8]。本研究首次采用毛細(xì)管氣相色譜法(GC)對斑蝥脂肪酸組分進(jìn)行分析鑒定，以期為斑蝥藥材多指標(biāo)質(zhì)量控制及其脂肪油資源合理開發(fā)應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 6820氣相色譜儀(FID檢測器)；SRADV色譜工作站；KQ-100超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；FA1004電子分析天平(上海天平儀器廠，精確度為萬分之一)；DHG-910型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；離心機(上海蘭科儀器有限公司)；DK-S22型電熱恒溫水浴鍋(上海精密實驗設(shè)備有限公司)。

1.2 試藥

對照品：SupelcoTM 37 Component FAME Mix(Sigma公司，純度>99%)。

試劑：正己烷為色譜純(禹王試劑有限公司)；石油醚(30～60 ℃)、氫氧化鈉、甲醇、三氟化硼-乙醚溶液、氯化鈉、無水硫酸鈉均為分析純；水為蒸餾水。

樣品：共收集5個產(chǎn)地5批斑蝥樣品，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定為芫青科昆蟲南方大斑蝥MylabrisphalerataPallas 或黃黑小斑蝥MylabriscichoriiLinnaeus的干燥體。樣品信息見表1。

表1 斑蝥樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：DB-WAX柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm)；載氣(氮氣)流量：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；檢測器溫度：260 ℃；升溫程序：50 ℃保持3 min，以25 ℃·min-1的速度升溫至200 ℃，保持5 min，再以3 ℃·min-1的速度升溫至230 ℃，保持20 min；分流比：20∶1；進(jìn)樣量：1 μL。

2.2 對照品溶液的制備

對照品SupelcoTM 37 Component FAME Mix質(zhì)量濃度為10 mg·mL-1，按照所需用正己烷稀釋成相應(yīng)濃度。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 脂肪油提取 精密稱定斑蝥粉末5.0 g于索氏提取器中，80 mL石油醚70 ℃水浴回流提取6 h，減壓回收溶劑，低溫烘干得斑蝥脂肪油。計算脂肪油得率，結(jié)果見表2。

表2 不同產(chǎn)地斑蝥中脂肪油得率

2.3.2 甲酯化處理 參照GB/T 17376—2008[9]改良測定方法。取上述脂肪油100 mg，精密稱定，置于10 mL具塞玻璃管中，加入0.5 mol·L-1氫氧化鈉-甲醇溶液4 mL，置60 ℃水浴皂化40 min(至油珠完全消失)，冷卻至室溫，加入14%三氟化硼-甲醇2 mL，繼續(xù)水浴5 min，冷卻至室溫，加入正己烷2 mL，飽和氯化鈉2 mL，振搖，靜置分層，取上清液200 μL，正己烷定容至5 mL，取適量溶液用無水硫酸鈉脫水，12 000 r·min-1離心10 min，即得。

2.4 對照品與樣品色譜行為

按照2.1色譜條件，進(jìn)行斑蝥脂肪油樣品及對照品溶液檢測，樣品與對照品在相同的保留時間處有相應(yīng)的色譜峰，且與雜質(zhì)峰得到較好的分離，色譜圖見圖1。

2.5 線性關(guān)系考察

37種脂肪酸混合對照品中各待測組分質(zhì)量濃度見表3，總質(zhì)量濃度為10 mg·mL-1。

取質(zhì)量濃度為10 mg·mL-1的混合對照品溶液，配成下列5個質(zhì)量濃度梯度：0.5、1、2、4、10 mg·mL-1。其中的濃度為各組分的總濃度。分別取各濃度對照品溶液進(jìn)樣1 μL，按照上述色譜條件，分別以棕櫚酸甲酯、棕櫚油酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯、亞麻酸甲酯和花生酸甲酯對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(μg·mL-1)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以質(zhì)量濃度對峰面積進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。結(jié)果表明，各對照品在一定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，結(jié)果見表4。

注：A.37種混合脂肪酸甲酯對照品；B.斑蝥供試品；1.棕櫚酸甲酯；2.棕櫚油酸甲酯；3.硬脂酸甲酯；4.油酸甲酯；5.亞油酸甲酯；6.亞麻酸甲酯；7.花生酸甲酯。 圖1 37種混合脂肪酸甲酯對照品及供試品GC圖

組分組分(碳原子數(shù)∶雙鍵數(shù))質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)質(zhì)量濃度/μg·mL-1棕櫚酸甲酯C16∶06600棕櫚油酸甲酯C16∶12200硬脂酸甲酯C18∶04400油酸甲酯C18∶14400亞油酸甲酯C18∶22200亞麻酸甲酯C18∶32200花生酸甲酯C20∶04400

表4 各脂肪酸組分線性回歸方程和線性范圍

2.6 精密度試驗

取質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1的混和對照品溶液，按照上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣1.0 μL，測定各目標(biāo)峰峰面積，計算RSD值。結(jié)果RSD值均小于2.82%，表明該儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取批號為S060902的河南斑蝥脂肪油，按2.3.2項下方法制備供試品溶液，分別于0、1、2、4、8、12 h各進(jìn)樣1次，每次進(jìn)樣1.0 μL，測定各目標(biāo)峰峰面積，計算RSD值。結(jié)果RSD值均小于5.52%，表明供試品溶液中斑蝥素在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗

取批號為S060902的河南斑蝥脂肪油各6份，按2.3.2項下方法制備供試品溶液，測定各目標(biāo)峰峰面積，計算各脂肪酸在脂肪油中的平均含量，計算RSD值。結(jié)果RSD值均小于4.94%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.9 加樣回收試驗

取批號為S060902的河南斑蝥脂肪油50 mg，精密稱定，共6份，按2.3.2項下方法制備供試品溶液，加入混合對照品溶液各100 μL，依法進(jìn)樣，測定各目標(biāo)峰峰面積，計算回收率與RSD值。結(jié)果見表5～11。

表5 棕櫚酸甲酯加樣回收率試驗測定

注：對照品加入量為1.50 mg

表6 棕櫚油酸甲酯加樣回收率試驗測定

注：對照品加入量為0.50 mg

表7 硬脂酸甲酯加樣回收率試驗測定

注：對照品加入量為1.00 mg

表8 油酸甲酯加樣回收率試驗測定

注：對照品加入量為1.00 mg

表9 亞油酸甲酯加樣回收率試驗測定

注：對照品加入量為0.50 mg

表10 亞麻酸甲酯加樣回收率試驗測定

注：對照品加入量為0.50 mg

表11 花生酸甲酯加樣回收率試驗測定

注：對照品加入量為1.00 mg

2.10 樣品含量測定結(jié)果

取斑蝥藥材粉末，精密稱定，分別按2.3項下方法制備供試品溶液，并按上述方法同時測定7種脂肪酸甲酯含量。因為樣品是經(jīng)甲酯化后再進(jìn)行色譜分析，在計算實際含量時，應(yīng)乘以各自系數(shù)，該系數(shù)是脂肪酸分子量與對應(yīng)的脂肪酸甲酯分子量之比。按每克斑蝥生藥計，各產(chǎn)地斑蝥藥材中7種脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)結(jié)果見表12。

表12 不同產(chǎn)地斑蝥中7種脂肪酸的測定(n=2) (%)

比較各產(chǎn)地斑蝥藥材中7種脂肪酸含量，結(jié)果表明，以湖北產(chǎn)斑蝥(批號：S091102)為例，各組分含量高低依次為：油酸>硬脂酸>棕櫚酸>亞油酸>亞麻酸>棕櫚油酸>花生酸，如圖2所示。不同產(chǎn)地斑蝥脂肪油種類及其飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的比例(SFA/USFA)見表13。廣西和湖北的斑蝥中SFA/USFA較高，為1.16～1.24；河南、安徽和湖南的SFA/USFA則較低，為0.74～0.81。

圖2 湖北產(chǎn)斑蝥脂肪油中7種脂肪酸的含量比較

批號產(chǎn)地飽和脂肪酸(SFA)(%)不飽和脂肪酸(USFA)(%)總量(%)SFA/USFAS060902河南26.4332.5959.020.81S060903安徽39.6553.6593.310.74S060904廣西50.7543.7894.531.16S060905湖南31.1539.6470.790.79S091102湖北35.1728.3363.501.24

3 討論與小結(jié)

3.1 色譜柱的選擇

為達(dá)到良好的分離度和合適的保留時間，實驗中比較了不同極性色譜柱的分離效果：HP-5(弱極性)、HP-35(中極性)、DB-WAX(強極性)，結(jié)果表明HP-5、HP-35分離效果差，各組分不能達(dá)到基線分離，且色譜峰拖尾等情況明顯，強極性DB-WAX柱的分離效果良好，對37種脂肪酸甲酯混合對照品中的35種脂肪酸甲酯均能達(dá)到基線分離，且峰型良好，滿足分析要求。

3.2 甲酯化條件優(yōu)化

參照并改進(jìn)了GB/T 17376—2008中的三氟化硼甲酯化方法，以10 mL具塞玻璃試管水浴代替了錐形瓶回流提取，簡化操作，可行性更好。

3.3 混合對照品的保存

混合對照品中含有多種不飽和脂肪酸甲酯，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，應(yīng)注意低溫保存；溶劑正己烷易揮發(fā)，實驗中應(yīng)注意密閉；同時，正己烷對塑料制品有腐蝕性，樣品溶液應(yīng)存放在玻璃容器中。

3.4 斑蝥脂肪油組成分析

GC含量測定結(jié)果表明，5個產(chǎn)地的斑蝥脂肪油中各組分含量比存在一定的差異性，但不飽和脂肪酸含量均較高，達(dá)到脂肪油總含量的28.33 %～53.65%不等。文獻(xiàn)研究表明，油酸、亞油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸有明顯的抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用，這些物質(zhì)可能為斑蝥脂肪油抗腫瘤的活性成分[10]。

《中華人民共和國藥典》(2010版)與文獻(xiàn)研究均以斑蝥素作為斑蝥質(zhì)量指標(biāo)性成分[1]，然而斑蝥素有很大毒性，限制了斑蝥的臨床應(yīng)用，至今尚未明確斑蝥臨床安全有效劑量范圍。本研究首次建立了同時測定斑蝥藥材中7種脂肪酸的含量測定方法，方法學(xué)考察表明，該方法操作簡單，準(zhǔn)確可行。研究為斑蝥藥材的多指標(biāo)質(zhì)量控制提供一定的實驗依據(jù)，對斑蝥藥材中其他成分的藥用提供一定參考。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：311.

[2] 蔡慧蕓.JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在去甲斑蝥素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡中的作用[D].石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2013.

[3] 趙麗娜，張振凌.中藥斑蝥的現(xiàn)代研究進(jìn)展[J].中國民族民間醫(yī)藥，2010，10(9)：33-34.

[4] 張建輝，陳建偉，李祥.斑蝥及其近緣種屬藥用資源研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志，2009，34(6)：647-650.

[5] 張建輝，陳建偉，武露凌，等.南方大斑蝥酸水解-丙酮提取物成分的GC/MS分析[J].中國藥房，2009，20(30)：2363-2365.

[6] 張建輝，陳建偉，許金國，等.不同產(chǎn)地南方大斑蝥水解產(chǎn)物化學(xué)成分的比較分析[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2009，21(3)：449-452.

[7] 劉沁，陳建偉，武露凌，等.斑蝥炮制前后脂肪酸成分的GC-MS分析[J].中國藥房，2011，22(19)：1788-1789.

[8] 劉沁，陳建偉，李祥，等.HPLC法測定5個產(chǎn)地斑蝥藥材中斑蝥素的含量[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2011，17(5)：582-585.

[9] 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.GB/T 17376—2008 動植物油脂 脂肪酸甲酯制備[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

[10] 王曉崢.硅藻中多不飽和脂肪酸抗腫瘤作用的研究[D].天津：天津科技大學(xué)，2010.

Determination of7Fatty Acids from Mylabris by Capillary Gas Chromatography

CHEN Wenyue1，BAI Ganggang2，YUAN Fei2，CHEN Jianwei2,3*，LI Xiang1,2

(1.School of Preclininal Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China；2.School of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China；3.Jiangsu Key Laboratory for Chinese Materia Medica Processing，Nanjing 210023，China)

Objective：To establish a method for analyzing the chemical constituents of the fatty acids from Mylabris.Methods：The fatty oil of Mylabris was extracted by petroleum ether and analyzed by GC after methyl esterifying.The content of palmitic acid，palmitoleic acid，octadecanoic acid，oleic acid，linoleic acid，linolenic acid and arachidic acid were simultaneously analyzed.Results：Mylabris from different orgins are different in chemical composition of 7 kinds of fatty acid.Conclusion：This study provides an accurate and reliable method to analyze the fatty oils in Mylabris and could be a reference for determination of the content.

Mylabris；fatty acids；capillary gas chromatography；methyl esterification

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.8.008

2015-04-22)

國家公益性行業(yè)科研專項(201407002)；江蘇省中藥炮制重點實驗室開放式課題(ZYPZ006)；江蘇省高校自然科學(xué)研究計劃項目(02KJB360004)

*

陳建偉，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥品質(zhì)評價與中藥生物技術(shù)；E-mail：chenjw695@126.com