大黃素抑制軟脂酸誘導的大鼠VSMCs炎性細胞因子的表達△

吳迪，鐘珊珊

(遵義醫(yī)學院 藥學院，貴州 遵義 563000)

·基礎研究·

大黃素抑制軟脂酸誘導的大鼠VSMCs炎性細胞因子的表達△

吳迪*，鐘珊珊

(遵義醫(yī)學院 藥學院，貴州 遵義 563000)

目的：探討大黃素對軟脂酸誘導的大鼠血管平滑肌細胞(VSMCs)炎癥細胞因子CRP、TNF-α及iNOS的影響。方法：培養(yǎng)鑒定原代大鼠VSMCs，使用不同濃度的大黃素(1、10、50 μmol·L-1)預孵育VSMCs 24 h，再以濃度為100 μmol·L-1的軟脂酸刺激24 h，使用RT-PCR、western blot分別測定VSMCs CRP、TNF-α、iNOS 的mRNA和蛋白的表達變化。結果：濃度為50 μmol·L-1的大黃素預孵育大鼠VSMCs 24 h后，與軟脂酸組相比，CRP、TNF-α、iNOS的mRNA及蛋白的表達顯著性降低，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論：大黃素能濃度依賴性地抑制軟脂酸誘導的大鼠VSMCs 炎性因子的表達，可以通過抗炎而達到抗動脈粥樣硬化的作用。

大黃素；軟脂酸；血管平滑肌細胞；細胞因子；動脈粥樣硬化

大黃素(emodin，EMO)屬蒽醌類衍生物，可以通過調脂、抗氧化、保護內皮細胞等途徑，發(fā)揮抗動脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)功能。EMO可以抑制血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)核抗原蛋白的表達，阻滯細胞周期的移行，抑制VSMCs的增殖[1]，而達到抗As的作用。現(xiàn)代研究表明，炎癥反應參與了As的發(fā)生和發(fā)展，EMO對脂多糖誘導的巨噬細胞炎癥反應具有明顯的抑制作用，可以抑制NF-κB的活化，抑制炎癥反應中一氧化氮(NO)的大量合成和釋放[2]。但EMO對VSMCs炎性細胞因子的研究不多，對抗炎、抗As的研究也不多，且機理不明。本研究擬設計實驗，探討EMO對軟脂酸(palmitic acid，PA)誘導的VSMCs炎癥細胞因子表達的影響，研究EMO的抗As作用，深入了解EMO藥理作用，為其臨床使用提供新的思路。

1 材料

1.1 動物

SD大鼠，雄性，體重100～150 g，由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供，合格證號：SCXX 2012-005。

1.2 藥品及試劑

EMO(陜西中鑫生物技術有限公司)；PA(美國Sigma公司)；DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS，美國Hyclone公司)；C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)、誘導性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)抗體(美國Abcam公司)；GAPDH抗體、兔抗大鼠平滑肌α-actin抗體、辣根酶標記山羊抗兔lgG(H+L)、辣根酶標記山羊抗鼠lgG(H+L)、SP-9000免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)；RNAfast200總RNA極速抽提試劑盒(上海飛捷生物)；逆轉錄試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]。

2 方法

2.1 大鼠血管平滑肌細胞的培養(yǎng)

100～150 g的SD雄性大鼠，麻醉后在無菌條件下迅速開胸，取出大鼠胸主動脈段，使用PBS洗滌3次，剝去外膜，刮去內膜。將處理好的中膜移入培養(yǎng)皿中，剪成大約1 mm的碎片，將碎片均勻鋪于培養(yǎng)瓶壁上，將瓶翻轉，再加入含20% FBS的DMEM培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2)，2～4 h后將瓶輕輕翻回，使組織塊完全浸泡在培養(yǎng)液中。待單層細胞鋪滿培養(yǎng)瓶80%左右時，采用酶消化法傳代。實驗中采用3～7代細胞，細胞在實驗前，換成含0.4% FBS的DMEM培養(yǎng)基，去血清培養(yǎng)24 h，使細胞同步化。

2.2 VSMCs的鑒定

取濃度為1×106/mL第3代VSMCs，接種于預置有蓋玻片的6孔板中培養(yǎng)，待細胞生長至近融合狀態(tài)時，取出蓋玻片，PBS沖洗。4%多聚甲醛固定20 min，0.3%Tritonx-100室溫孵育20 min，羊血清室溫封閉20 min，兔抗大鼠平滑肌α-actin抗體(1∶100)孵育[3]，4 ℃過夜。PBS沖洗后加入生物素化山羊抗兔IgG，37 ℃孵育15 min，加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素，37 ℃孵育15 min，PBS沖洗后，DAB顯色5 min，顯微鏡下觀察。待顯色完成后用PBS沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

2.3 實驗分組

實驗分為空白對照組(NC組)、PA組、EMO組、EMO+PA組。NC組VSMCs不做任何處理；PA組用PA(100 μmol·L-1)刺激24 h；EMO組用EMO(50 μmol·L-1)刺激24 h；EMO+PA組用不同濃度EMO(1、10、50 μmol·L-1)預孵育24 h后加入PA(100 μmol·L-1)24 h。RT-PCR法測定細胞內CRP、iNOS及TNF-αmRNA的表達，Western blot法測定蛋白的表達。

2.4 RT-PCR測定

按照RNAfast200試劑盒說明書所示規(guī)程提取細胞總RNA，使用分光光度計測定RNA的濃度和純度。RNA提取后依照逆轉錄試劑盒說明書操作合成cDNA。以GAPDH為內參，擴增CRP、TNF-α及iNOS基因。GAPDH上游引物(產物124 bp)：5′-GCAAGTTCAACGGCACAGTCAAG-3′，下游引物：5′-ACATACTCAGCACCAGCATCACC-5′；CRP上游引物(產物153 bp)：5′-CATCTGTGCCACCTGGGAGTC-3′，下游引物：5′-AAGCCACCGCCATACGAGTC-3′；iNOS上游引物(產物262 bp)：5′-GAGATTTTTCACGACACC-CTTC-3′，下游引物：5′-GAGATTTTTCACGACACC-CTTC-3′；TNF-α上游引物(產物381 bp)：5′-GCTGGTAGGTTCCTGTTGTTTC-3′，下游引物：5′-CACCACGCTCTTCTGTCTACTG-3′。產物電泳后，采用Quantity one 4.6軟件分析擴增產物條帶灰度，取目的基因與GAPDH的灰度值的比值為該目的基因的相對含量。實驗重復3次，取平均值。

2.5 Western blot測定

用RIPA裂解液收集細胞，將細胞從六孔板中轉移至1.5 mLEP管中，用破膜儀抽打3次，使蛋白充分溶解。將EP管靜置于冰上20 min，再離心15 min，吸取上清液，即得細胞總蛋白。利用10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)分離等量蛋白，然后轉膜、封閉，分別加入CRP(1∶100)、iNOS(1∶300)、TNF-α(1∶200)及GAPDH(1∶500)抗體12 h，洗膜后加入二抗(1∶5000)，室溫孵育1 h，洗膜后采用化學顯影，X線片曝光，并對顯影條帶進行灰度掃描，做相對定量分析，以GADPH為內參照。

2.6 統(tǒng)計學分析

實驗所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示，使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，多組間比較使用ANOVA單因素方差分析，P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 體外培養(yǎng)大鼠VSMCs的鑒定

倒置顯微鏡下，3～5 d即可見少量細胞爬出組織塊，細胞呈典型梭形，有一個橢圓形核，胞漿均質)。培養(yǎng)7～10 d，細胞局部成束狀平行排列，部分細胞多層重疊，呈典型高低起伏的“峰”、“谷”狀。使用免疫細胞化學染色方法檢測平滑肌肌動蛋白的表達，鑒定培養(yǎng)的第三代細胞。結果顯示：大于99%的細胞染色陽性，胞核不著色，胞漿顯棕黃色，見圖1。

3.2 大黃素抑制軟脂酸誘導的VSMCs炎性細胞因子mRNA的表達

VSMCs先用不同濃度的EMO(1、10、50 μmol·L-1)預孵育24 h后加入PA(100 μmol·L-1)24 h，提取細胞mRNA，RT-PCR法分別檢測細胞中CRP、iNOS及TNF-αmRNA的表達。以GADPH為標準統(tǒng)計目的基因的表達水平，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤表示(n=3)。結果顯示，與正常對照組相比，100 μmol·L-1PA能顯著增加大鼠VSMCs CRP、iNOS和TNF-αmRNA的表達，50 μmol·L-1EMO本身對目的基因mRNA的表達無顯著影響。與PA組比較，不同濃度的EMO能夠抑制PA刺激的大鼠VSMCs CRP、iNOS及TNF-αmRNA的表達，其中高濃度的EMO差異有統(tǒng)計學意義，見圖2。

A.倒置顯微鏡下第4天細胞形態(tài)(×100)；B.倒置顯微鏡下第三代細胞形態(tài)(×100)；C.免疫細胞化學染色鑒定大鼠血管平滑肌肌動蛋白(×400)。圖1 大鼠血管平滑肌細胞的鑒定

注：與對照組相比，**P<0.01，***P <0.001；與軟脂酸組相比，#P<0.05，##P<0.01，###P <0.001(n=3)。下同。圖2 大黃素抑制軟脂酸誘導的VSMCs炎癥細胞因子mRNA的表達

3.3 大黃素抑制軟脂酸誘導的VSMCs炎性細胞因子蛋白的表達

VSMCs先用不同濃度的EMO(1、10、50 μmol·L-1)預孵育24 h后，加入PA(100 μmol·L-1) 24 h，提取細胞總蛋白，Western blot法分別檢測細胞中CRP、iNOS及TNF-α蛋白的表達。以GADPH為標準統(tǒng)計目的蛋白的表達水平，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤表示(n=3)。結果顯示，與正常對照組相比，100 μmol·L-1PA能顯著增加大鼠VSMCs CRP、iNOS和TNF-α蛋白的表達，50 μmol·L-1EMO本身對目的蛋白的表達無顯著影響。與PA組比較，不同濃度的EMO能夠抑制PA刺激的VSMCs CRP、iNOS和TNF-α蛋白的表達，其中高濃度的EMO差異有統(tǒng)計學意義，見圖3。

圖3 大黃素抑制軟脂酸誘導的VSMCs 炎癥細胞因子蛋白的表達

4 討論

As是一種慢性炎性疾病，這一觀點已得到研究者的公認。VSMCs在As的發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，其能分泌一系列的炎癥因子，如CRP、TNF-α、IL-6及MMPs等，促進血管炎癥反應，加劇As。

CRP作為心血管疾病的獨立預測因子，在中風、心肌梗死及冠心病等疾病的預防和治療中具有重要意義[4]，CRP也作為炎性細胞因子參與As的整個過程。研究顯示，CRP可以誘導VSMCs生成ROS、上調AT1-R的表達，活性氧(ROS)、AT1-R表達的增加又促進新生內膜的形成及增厚，促進VSMCs的增殖遷移，從而促進粥樣斑塊的形成和破裂[5]，這一過程可能與MAPK及NF-κB的激活有關[6]。iNOS在多種細胞中均有表達，如巨噬細胞、成纖維細胞、內皮細胞和VSMCs等。當細胞受到炎癥介質刺激時，iNOS催化合成大量NO，造成細胞脂質過氧化、細胞壞死，釋放更多炎癥介質，加重炎癥反應，加劇iNOS的表達，形成惡性循環(huán)，促進粥樣斑塊的破裂[7]。TNF-α是生物體內主要的促炎和免疫調節(jié)因子，參與機體的急、慢性炎癥，在人和小鼠的動脈粥樣病變區(qū)域中都檢測到TNF-α，其分泌過多會引起炎癥因子的瀑布式釋放，造成組織細胞損傷。TNF-α可以誘導VSMCs炎癥因子IL-6、IL-1β的表達，可以促進VSMCs成骨樣分化，增加鈣鹽沉積，從而促進血管鈣化[8]。TNF-α還能激活VSMCs MAPK信號轉導通路，促進VSMCs的增殖[9]。

EMO是傳統(tǒng)中藥大黃的主要有效單體，其在抑制細胞增殖、抗炎、抗腫瘤及免疫調節(jié)等方面具有良好效果。臨床研究表明，EMO能降低全身炎癥反應綜合征患者血清TNF-α和CRP的水平，有效抑制炎癥介質的釋放及阻止炎癥介質介導的嚴重并發(fā)癥的發(fā)生，具有良好的抗炎作用[10]。通過體外實驗研究，我們發(fā)現(xiàn)PA可以誘導大鼠VSMCs CRP、iNOS及TNF-αmRNA和蛋白水平的表達，其對VSMCs有直接的致炎作用，這表明PA可以直接通過炎癥介導As的發(fā)生發(fā)展。在核酸和蛋白水平上，EMO可以顯著抑制PA對大鼠VSMCs CRP、iNOS及TNF-α的誘導作用，50 μmol·L-1的EMO本身對CRP、iNOS及TNF-α的表達沒有顯著的影響，表明EMO可以通過抑制炎癥因子的表達而達到抗As的作用。EMO能抑制PA誘導的炎癥反應從而抑制AS發(fā)展的作用機制仍不明確，體外實驗結果和具體的信號通路我們仍然未知，需要進一步的研究及探討。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)EMO可以抑制PA誘導的大鼠VSMCs CRP、iNOS及TNF-α的表達，提示EMO可以通過抑制炎癥反應的發(fā)生、發(fā)展，從而達到抗As的作用，加深了我們對EMO抗炎機制和抗As的理解，為EMO的臨床應用及傳統(tǒng)中藥大黃治療心血管疾病提供了參考。

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封面介紹——紅旱蓮

【異名】紅旱蓮異名湖南連翹。

【基原】為藤黃科金絲桃屬植物湖南連翹的全草。

【原植物】湖南連翹HypericumascyronL.又名黃海棠。

【植物形態(tài)】為多年生草本，高1.3 m。全株光滑無毛。莖四棱形，淡棕色，上部有分枝。單葉對生；葉無柄；葉片寬披針形，長5-10cm,寬1-3cm。先端鈍尖，基部抱莖，邊緣全緣，兩面密布細小透明的腺點?；〝?shù)朵排成頂生的二歧聚傘花序；花黃色，萼片5，卵圓形，具半透明腺點；花瓣5，鐮狀倒卵形，各瓣稍偏斜而旋轉；雄蕊多數(shù)，基部連合成5束，每束與花瓣對生；子房上位，圓錐形，花柱長，在中部以上5裂。蒴果圓錐形。種子多數(shù)，長橢圓形，褐色?；ㄆ?-7月，果期8-9月。

【性味與歸經】苦，寒。歸肝經。

【功能主治】涼血止血，活血調經，瀉火解毒。注治血熱吐血、咯血、衄血、尿血、崩漏，跌打損傷，外傷出血，月經不調，痛經，乳汁不下，肝火頭痛，黃疸，瘧疾，燙傷，濕疹，黃水瘡，毒蛇咬傷。

Inhibitory Effect of Emodin on Inflammatory Cytokines Expression Induced by Palmitic Acid in Rat Vascular Smooth Muscle Cells

WU Di*，ZHONG Shanshan

(Department of pharmacy，Zunyi Medcal University，Zunyi Guizhou 563000，China)

Objective：To observe the effects of emodin on CRP，TNF-α and iNOS generations induced by palmitic acid in rat vascular smooth muscle cells(VSMCs).Methods：After VSMCs were pretreated with different concentrations of emodin(1，10，50 μmol·L-1) for 24 h，VSMCs were treated with palmitic acid(100 μmol·L-1) for 24 h.At the indicated time，mRNA and protein expressions of CRP，TNF-α and iNOS in VSMCs were analyzed by RT-PCR，western blot，respectively.Results：In VSMCs，using 50 μmol·L-1of emodin for 24h before the stimulation with palmitic acid，mRNA and protein expressions of CRP，TNF-α and iNOS expressions were significantly decreased comparing with palmitic acid group.Conclusion：Emodin inhibits inflammatory cytokines expression induced by palmitic acid in VSMCs and has effect on atherosclerosis by its anti-inflammatory activity.

Emodin；palmitic acid；vascular smooth muscle cells；cytokines

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.2.005

2014-06-23)

遵義醫(yī)學院碩士啟動項目(F-669)

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吳迪，講師，研究方向：心血管藥理學；E-mail：wd_32677@126.com