復(fù)方坤血停對藥物流產(chǎn)模型大鼠凝血功能及性激素水平的影響△

楊梅，冷康，王夢，鄭云楓，程建明，陳湘玉,3*

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210029；2.南京市婦幼保健院，江蘇 南京 210004；3.南京市鼓樓醫(yī)院，江蘇 南京 210008)

·基礎(chǔ)研究·

復(fù)方坤血停對藥物流產(chǎn)模型大鼠凝血功能及性激素水平的影響△

楊梅1,2，冷康1，王夢1，鄭云楓1，程建明1，陳湘玉1,3*

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210029；2.南京市婦幼保健院，江蘇 南京 210004；3.南京市鼓樓醫(yī)院，江蘇 南京 210008)

目的：研究復(fù)方坤血停對大鼠藥物流產(chǎn)后凝血功能的影響，并探討其作用機(jī)制。方法：采用妊娠大鼠灌服米非司酮和米索前列醇造成不完全流產(chǎn)模型，觀察復(fù)方坤血停對模型大鼠凝血指標(biāo)及子宮出血量的影響，同時(shí)檢測血清雌二醇(E2)、孕酮(P)、血栓素(TXB2)和6-酮前列腺素(6-Keto-PGF1α)的水平變化。結(jié)果：復(fù)方坤血?？擅黠@減少子宮出血量，縮短藥物流產(chǎn)模型大鼠血漿凝血酶原時(shí)間(PT)、凝血酶時(shí)間(TT)，血清TXB2、E2水平較模型組升高(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論：復(fù)方坤血?？擅黠@降低流產(chǎn)模型大鼠子宮出血，其機(jī)制可能與其降低凝血因子水平及調(diào)節(jié)體內(nèi)激素水平有關(guān)。

坤血停；藥物流產(chǎn)；子宮出血；凝血功能；激素水平

藥物流產(chǎn)后子宮出血不止，屬于中醫(yī)“小產(chǎn)”和“產(chǎn)后惡露不行”的范疇[1]。中醫(yī)認(rèn)為流產(chǎn)后耗傷天癸，以致氣血虛虧，沖任不固，瘀血阻絡(luò)，瘀熱阻胞等，因此治療應(yīng)虛實(shí)兼顧，祛邪扶正并施。復(fù)方坤血停由蒲黃、五靈脂、當(dāng)歸、三七、香附以1∶1∶1∶1∶0.5的配比組成，具有行氣止痛、化瘀止血之功能，臨床上被用于藥物流產(chǎn)后子宮出血，具有較好的療效。本實(shí)驗(yàn)以早孕大鼠藥物致流產(chǎn)形成出血為模型[2-3]，觀察復(fù)方坤血停對大鼠的血漿凝血指標(biāo)及子宮出血量的影響，同時(shí)還檢測了血清雌二醇(E2)、孕酮(P)、血栓素(TXB2)和6-酮前列腺素(6-Keto-PGF1α)的水平變化，對其作用機(jī)制進(jìn)行探討，為新藥的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物

SD大鼠，SPF級，雌性80只，雄性40只，交配受孕數(shù)量66只。體重250～300 g。北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司中心提供，許可證號SCXK(京)2012-0001，合格證號11400700048568。

1.2 藥物與試劑

坤血停提取物：取蒲黃、五靈脂、當(dāng)歸、三七和香附，加水提取兩次，濃縮至含生藥2 g·mL-1的清膏，加乙醇醇沉，過濾，濾液減壓回收，濃縮得提取物樣品(1克提取物相當(dāng)于3.2克生藥)，置4 ℃冷藏保存，使用前以0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)配制成質(zhì)量濃度分別為0.2、0.4、0.8 g·mL-1(以生藥計(jì)，下同)坤血停提取物；宮血寧膠囊(0.13 g/粒，批號：ZLA1305，云南白藥集團(tuán)股份有限公司)以0.5% CMC-Na配制成質(zhì)量濃度為0.013 g·mL-1的混懸液備用。

米非司酮(25 mg/片，批號為130303，上海新華聯(lián)制藥有限公司)臨用前以0.5%CMC-Na配制成質(zhì)量濃度為0.83 mg·mL-1的混懸液備用；米索前列醇(0.6 mg/片，批號為130603，湖北葛店人福藥業(yè)有限責(zé)任公司)臨用前以0.5%CMC-Na配制成質(zhì)量濃度為0.01 mg·mL-1的混懸液備用。

水合氯醛(批號為20130426，南京壽德試劑有限公司)用氯化鈉注射液配制成10%溶液。

凝血酶原時(shí)間(PT)測試試劑盒(批號：545548)；活化部分凝血酶時(shí)間(APTT)測試試劑盒(批號：547198)；凝血酶時(shí)間(TT)測試試劑盒(批號：43323)；雌二醇(E2)Elisa測定試劑盒、孕酮(P)Elisa測定試劑盒、6-keto-PGF1αElisa測定試劑盒、TXB2Elisa測定試劑盒(批號均為201407)由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 儀器

酶標(biāo)儀(型號：Synergy 2，BioTek公司)；Labsystems Finnpipette 100 μL單道移液器；Thermo 50 μL 8道移液器；電子天平[型號：BSA3225-CW，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]；離心機(jī)(型號：LD5-10b，北京雷勃爾離心機(jī)有限公司)；電子秤(型號：ACS-D11，上海乾峰電子儀器有限公司)；生物顯微鏡(XSP-18B，南京江南光學(xué)儀器廠)；使用記錄全自動凝血分析儀(型號：CA-1500，SYSMEX公司)。

1.4 分組與給藥

將大鼠按雌、雄2∶1的比例于下午5點(diǎn)合籠，次日上午8點(diǎn)用蘸取氯化鈉注射液的棉棒進(jìn)行雌鼠陰道涂片，生物顯微鏡檢查，以檢出精子為妊娠第1天。未檢出精子的雌鼠于當(dāng)日下午5點(diǎn)繼續(xù)合籠，連續(xù)3 d，最后陰道涂片檢出精子的雌鼠共66只。

根據(jù)受孕時(shí)間和體重隨機(jī)分為6組，每組11只，分別為正常對照組、模型組、陽性對照組、坤血停低、中、高劑量組。除正常對照組外，其余5組于受孕第7天上午8點(diǎn)灌服米非司酮(劑量為8.3 mg·kg-1)，當(dāng)日下午5點(diǎn)灌服米索前列醇(劑量為0.1 mg·kg-1)，以造成早孕大鼠不完全流產(chǎn)模型。

正常對照組在相同時(shí)間灌服同體積0.5% CMC-Na。第8天開始，正常對照組和模型組均灌服0.5%CMC-Na；陽性對照組灌服宮血寧(劑量為0.13 g·kg-1)；坤血停低、中和高三個(gè)劑量組分別灌服劑量為2.0、4.0、8.0 g·kg-1的坤血停。大鼠每天給藥1次，連續(xù)給藥7 d，給藥體積均為每100 g體重給藥1.0 mL。

1.5 子宮出血量測定

受孕第7天下午5點(diǎn)，給大鼠灌服米索前列醇后，于其陰道內(nèi)置入定量棉球1個(gè)(棉球重70～ 80 mg)。次日上午8點(diǎn)取出，置換一個(gè)新棉球于陰道內(nèi)，當(dāng)日下午5點(diǎn)將棉球取出，同時(shí)再放置一個(gè)新棉球。取出棉球放入塑料袋中密閉，置4 ℃冰箱冷藏保存，每天同樣操作，連續(xù)至受孕第14天。

將收集的每鼠子宮出血棉球置于燒杯內(nèi)，采用質(zhì)量濃度為50 g·L-1的氫氧化鈉(NaOH)溶液10 mL，分次浸泡、擠壓、搓洗棉球。先浸洗血量較少的棉球，再浸洗血量較多的棉球，合并浸洗液，混勻，800 rpm離心5 min。分別將浸洗液和含大鼠靜脈血20 μL的NaOH溶液，用酶標(biāo)儀在546 nm波長測定吸光度。陰道出血量計(jì)算公式：陰道出血量(mL)=(靜脈血量0.02 mL)×(棉球浸洗液吸光度×V2)/靜脈血吸光度×V1)，其中V1為稀釋靜脈血所用的NaOH溶液的量(4 mL)，V2為浸提子宮出血棉球所用NaOH溶液量(10 mL)。

1.6 大鼠血標(biāo)本的采集

大鼠受孕第14天，于給藥后30 min，用10%水合氯醛腹腔注射(每100 g體重給藥0.35 mL)，麻醉大鼠，腹主動脈取血，以0.109 M檸檬酸鈉溶液抗凝分離血漿，取5 mL全血分離血清，并取20 μL全血加入質(zhì)量濃度為50 g·L-1的NaOH 溶液(4 mL)中，混勻，用于陰道出血量測定時(shí)使用。

分離血漿由全自動凝血分析儀測定凝血指標(biāo)：凝血酶原時(shí)間(PT)、部分活化凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶時(shí)間(TT)。

分離血清，按試劑盒說明進(jìn)行操作。酶標(biāo)儀測定E2、P、TXB2和6-Keto-PGF1α水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 對血漿凝血指標(biāo)及子宮出血量的影響

流產(chǎn)模型組大鼠次日開始可見子宮出血，PT、TT、APTT較正常對照組明顯延長(P<0.05或P<0.01)。坤血停低、中、高劑量組子宮出血量均明顯減少(與模型組比較P<0.01)；中、高劑量組的PT、TT明顯縮短(與模型組比較P<0.05或P<0.01)；而高劑量組的APTT有一定的縮短趨勢，但與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。陽性藥宮血寧組的PT、TT和APTT均明顯縮短，子宮出血量也有明顯減少(與模型組比較P<0.05)。結(jié)果表明坤血停和陽性藥宮血寧對大鼠藥物流產(chǎn)后的子宮出血均具有明顯的止血作用。結(jié)果見表1。

表1 坤血停對藥物流產(chǎn)大鼠子宮出血及凝血指標(biāo)的影響

注：模型組與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；給藥組與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。下同。

2.2 對雌性激素水平的影響

血清雌二醇和孕酮檢測結(jié)果表明，藥物流產(chǎn)模型組大鼠與正常對照組比較，其雌二醇及孕酮水平明顯降低(與正常組比較P<0.01)。坤血停中、高劑量組及陽性藥組給藥后能夠顯著升高雌二醇水平(與模型組比較P<0.05或P<0.01)；而坤血停低、中劑量組及陽性藥宮血寧組均未顯示出對孕酮水平的影響，坤血停高劑量組才顯示出升高孕酮水平(與模型組比較P<0.05)，見表2。

2.3 對血清中TXB2和6-keto-PGF1α的影響

結(jié)果顯示，模型組大鼠血清TXB2含量顯著降低(與正常組比較P<0.05)，而血清6-keto-PGF1α含量顯著升高(與正常組比較P<0.05)。TXB2/6-keto-PGF1α比值亦顯著降低，說明模型組大鼠中TXB2/6-keto-PGF1α系統(tǒng)失調(diào)，表明造模成功。給藥后，坤血停中、高劑量組及陽性藥組均能夠顯著升高TXB2水平(與模型組比較P<0.05或P<0.01)，提升TXB2/6-keto-PGF1α比值，說明坤血停中、高劑量組能夠通過調(diào)節(jié)TXB2/6-keto-PGF1α比值，起到治療的作用。見表3。

表2 坤血停對藥物流產(chǎn)大鼠血清雌性激素水平的影響

表3 坤血停對藥物流產(chǎn)大鼠血清TXB2和6-keto-PGF1α的影響

3 討論和結(jié)論

傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為流產(chǎn)乃本虛標(biāo)實(shí)之證，概括起來主要有“瘀、熱、虛、郁”四個(gè)方面，如若防治不當(dāng)，易引起子宮出血，導(dǎo)致“產(chǎn)后惡露不行”或“崩漏”。其發(fā)病機(jī)理主要為沖任不固、氣血運(yùn)行失常。病機(jī)的關(guān)鍵是“瘀血留滯胞中”，但又有“多虛、多瘀”的特點(diǎn)，故臨床組方常以“益氣活血、化瘀止血”為原則[4]。復(fù)方坤血停是臨床用于產(chǎn)后“崩漏”的經(jīng)驗(yàn)方，方中以蒲黃化瘀止血，五靈脂祛瘀止痛，共同作為君藥；當(dāng)歸甘溫，既能補(bǔ)血又能活血，為臣藥；三七等藥行氣活血，共為佐藥。全方藥味組成具有益氣活血、化瘀止血之功能，使胞宮內(nèi)瘀血盡去，新血?dú)w經(jīng)，惡露自止?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，出血時(shí)間長、出血量多是臨床上流產(chǎn)后最常見的并發(fā)癥，其原因較為復(fù)雜，不僅與體內(nèi)凝血因子有關(guān)，而且和體內(nèi)性激素水平也存在聯(lián)系[5]。

凝血因子TXB2和6-K-PGF1α都是不穩(wěn)定花生四烯酸代謝產(chǎn)物，其中TXB2是花生四烯酸轉(zhuǎn)化物血栓素的代謝產(chǎn)物，具有促進(jìn)血小板聚集、促凝和收縮縮血管作用。而6-K-PGF1α為花生四烯酸轉(zhuǎn)化成前列環(huán)素的代謝產(chǎn)物，具有較強(qiáng)的血小板聚集作用，二者在體內(nèi)維持著動態(tài)的平衡，對維持血管張力、防止血小板聚集起著重要作用，一旦平衡失調(diào)，可造成血栓或出血傾向。已有研究發(fā)現(xiàn)，藥物流產(chǎn)后體內(nèi)TXB2/6-Keto-PGF1α系統(tǒng)失調(diào)是導(dǎo)致流產(chǎn)后出血的機(jī)制之一[6]，調(diào)整該系統(tǒng)至正常范圍將能夠有效抑制流產(chǎn)后出血。

孕酮和雌二醇分別為體內(nèi)卵巢分泌的天然孕激素和雌激素。孕酮主要引起子宮內(nèi)膜產(chǎn)生分泌期的變化，如腺體擴(kuò)張、分泌增加、血液供應(yīng)豐富、內(nèi)膜發(fā)育生長等；而雌二醇在體內(nèi)具有促進(jìn)子宮內(nèi)膜增生，增強(qiáng)子宮滑肌收縮及抗雄性激素等作用。臨床常用的致流產(chǎn)藥物米非司酮作為孕激素受體水平的抗孕激素藥[7]，與孕激素競爭抗孕激素受體而達(dá)到抗孕激素作用，引起蛻膜和絨毛變性壞死，導(dǎo)致流產(chǎn)和出血。同時(shí)米非司酮還可抑制卵巢發(fā)育[8]，使得雌二醇水平低下，影響子宮內(nèi)膜修復(fù)，導(dǎo)致出血時(shí)間延長。因而調(diào)整藥物流產(chǎn)后孕酮和雌二醇等性激素水平，促進(jìn)子宮復(fù)舊、修復(fù)子宮內(nèi)膜是治療流產(chǎn)后“崩漏”的重要環(huán)節(jié)[9-10]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)方坤血停能夠明顯增加大鼠血漿中TXB2的含量，升高TXB2/6-Keto-PGF1α值，通過促進(jìn)血小板聚集，收縮子宮內(nèi)血管而起到止血作用，同時(shí)還可以升高藥物流產(chǎn)大鼠血清中雌二醇含量，促進(jìn)子宮內(nèi)膜的修復(fù)，從而進(jìn)一步減少出血的可能。

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Effect of Fufang Kunxueting on Function of Coagulationand Serum level of Sex Hormone in Rats Model of Medical Abortion

YANG Mei1,2，LENG Kang1，WANG Meng1，ZHENG Yunfeng1，CHENG Jianming1，CHEN Xiangyu1,3*

(1.Nanjing University of Chinese Medicine，210029，China；2.Nanjing Maternity and Child Health care hospital，Nanjing，210004，China；3.Nanjing Drum Town hospital，Nanjing，210008，China)

Objective：To evaluate the effect of Fufang Kunxueting on the coagulation function and its mechanism in rats model of medical abortion.Methods：Incomplete abortion was induced in pregnant rats by perfusion of mifepristone and misoprostol.Then the level of coagulation factor and the amount of uterine haemorrhage were investigated.The change of serum level of E2，P，TXB2and 6-Keto-PGF1αin model rats was determined.Results：The results showed that Fufang Kunxueting could decrease the amount of uterine haemorrhage，shorten the PT and TT，and improve the serum level of TXB2and E2 in model rats(P<0.05，P<0.01).Conclusion：Fufang Kunxueting could decrease the risk of the abnormal uterine bleeding，and its mechanism may closely relate with the regulation on coagulation factor and sex hormone.

Kunxueting；medical abortion；uterine haemorrhage；coagulation function；sex hormone level

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.2.004

2014-11-03)

江蘇省科技廳產(chǎn)學(xué)研聯(lián)合創(chuàng)新資金—前曕性聯(lián)合研究項(xiàng)目(BY2014008-01)

*

陳湘玉，主任護(hù)師；E-mail：gycc2011@126.com